Perfil fenotípico de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo derivadas de células madre humanas

Resumen

Este protocolo describe el cultivo celular de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo humano, seguido de la tinción inmunológica y la generación de perfiles fenotípicos neuronales a partir de imágenes microscópicas adquiridas de alto contenido que permiten la identificación de variaciones fenotípicas debidas a modulaciones genéticas o químicas.

Resumen

La enfermedad de Parkinson (EP) está relacionada con una serie de procesos biológicos celulares que causan la pérdida de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo (mDA). Muchos modelos celulares actuales de EP in vitro carecen de complejidad y no tienen en cuenta múltiples fenotipos. El perfil fenotípico en neuronas mDA derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) puede abordar estas deficiencias midiendo simultáneamente una serie de fenotipos neuronales en un tipo de célula relevante para la EP en paralelo. Aquí, describimos un protocolo para obtener y analizar perfiles fenotípicos de neuronas mDA humanas disponibles comercialmente. Se utiliza un panel de tinción fluorescente específico de neurona para visualizar los fenotipos relacionados con la proteína nuclear, la α-sinucleína, la tirosina hidroxilasa (TH) y la proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2). El protocolo de perfil fenotípico descrito es escalable, ya que utiliza placas de 384 pocillos, manipulación automática de líquidos y microscopía de alto rendimiento. La utilidad del protocolo se ejemplifica utilizando neuronas mDA de donantes sanos y neuronas mDA portadoras de la mutación G2019S ligada a PD en el gen de la quinasa repetida 2 rica en leucina (LRRK2). Ambas líneas celulares fueron tratadas con el inhibidor de la quinasa LRRK2 PFE-360 y se midieron los cambios fenotípicos. Además, demostramos cómo se pueden analizar los perfiles fenotípicos multidimensionales utilizando métodos de clasificación supervisada basados en clústeres o aprendizaje automático. El protocolo descrito interesará especialmente a los investigadores que trabajan en el modelado de enfermedades neuronales o en el estudio de los efectos de los compuestos químicos en las neuronas humanas.

Introducción

En la enfermedad de Parkinson (EP) se alteran diversos procesos biológicos celulares. Por ejemplo, la disfunción mitocondrial, el estrés oxidativo, los defectos de degradación de proteínas, la interrupción del tráfico vesicular y la función endolisosomal se han asociado con la pérdida de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo (mDA), se observan comúnmente en la EP¹. Por lo tanto, la EP parece implicar múltiples mecanismos de enfermedad que pueden interactuar y empeorarse entre sí. Una forma útil de investigar esta interacción mecanicista es la creación de una huella dactilar fenotípica completa o un perfil de las neuronas dopaminérgicas del me....

Protocolo

1. Preparación del medio y placas para la siembra de neuronas (Día 1)

1. Para preparar las placas para la siembra de neuronas en el día 1, caliente Laminin a temperatura ambiente (RT) justo antes de usarlo. Prepare la solución de laminina diluyendo la solución madre de laminina (0,1 mg/ml) 1/10 en PBS+/+ frío (con Ca 2+ y Mg²⁺).
   NOTA: Todos los reactivos se enumeran en la Tabla de materiales. Las composiciones de las soluciones y los tampones se describen en las Tablas 1-4.
2. A continuación, añadir 25 μL de la solución de laminina a cada pocillo de una placa de 384 pocillos prer....

Resultados

El perfil fenotípico en neuronas mDA es una forma eficiente de cuantificar múltiples aspectos de la biología celular y sus cambios durante la modulación experimental. Para ejemplificar esta metodología, este estudio hizo uso de LRRK2 G2019S criopreservado y neuronas mDA sanas de donantes. Estas neuronas han sido diferenciadas durante aproximadamente 37 días, son marcadores neuronales postmitóticos y expresos (TUBB3 y MAP2) y marcadores neuronales dopaminérgicos, incluyendo tirosina hidroxilasa (TH) en combinación con FOX.......

Discusión

El perfil fenotípico es una técnica para medir un gran número de fenotipos en las células mediante la aplicación de tinciones fluorescentes, microscopía y análisis de imágenes³. Los perfiles fenotípicos se pueden obtener y comparar a través de líneas celulares u otras condiciones experimentales para comprender cambios complejos en la biología celular que podrían pasar desapercibidos cuando se usa una sola lectura. En este trabajo describimos la aplicación del perfil fenotípico a las neuronas mDA d.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anti-pollo – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Inmunofluorescencia
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Inmunofluorescencia
Anti-ratón - Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Inmunofluorescencia
Anti-conejo - Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Inmunofluorescencia
Anti-tirosina hidroxilasa	Merck	T2928	Inmunofluorescencia
Anti-&alfa;-sinucleína	Abcam	138501	Inmunofluorescencia
Bravo Plataforma automatizada de manipulación de líquidos con cabezal 384ST	Agilent		Si no se dispone de un manipulador de líquidos, se recomienda el uso de una pipeta electrónica multicanal.
Microscopio confocal	Yokogawa	CV7000	Se recomienda el uso de un microscopio de fluorescencia confocal automatizado para garantizar la consistencia de la calidad de la imagen.
Countess Contador de células automatizado	Invitrogen		Recuento de células antes de la siembra. También se puede hacer utilizando una cámara de conteo manual.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Tampón para lavado
EL406 Lavadora Dispensador	BioTek (Agilent)		Si no se dispone de un manipulador de líquidos, se recomienda el uso de una pipeta electrónica multicanal.
Solución de formaldehído (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Fijación antes de la tinción
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Tinción nuclear
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	para neuronas
iCell DPN, Donante#01279, Fenotipo AHN, lote#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Donante
aparentemente sanoiCell DPN, Donante#11299, Fenotipo LRRK2 G2019S, fenotipo PD lote#106139	Fujifilm	C1149	Donante portador de la mutación LRRK2 G2019S
iCell Nervous System Supplement	Fujifilm	M1031	Suplemento para el medio base
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Suplemento para el medio base
Jupyter Python Notebook	Desarrollo interno	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook para realizar la visualización y clasificación de perfiles fenotípicos a partir de datos sin procesar.
Laminin	Biolamina	LN521	Recubrimiento
de placa PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	Inhibidor de la quinasa LRRK2
PhenoLink	Desarrollo propio	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Software para el análisis de imágenes
PhenoPlate 384w, recubierto de PDL	Perkin Elmer	6057500	Placa prerrevestida para cultivo celular e imagen. Esta placa permite obtener imágenes de todos los pocillos utilizando todos los objetivos del microscopio Yokogawa CV7000.
Placas de almacenamiento Abgene 120 µ L	Thermo Scientific	AB-0781	Necesario para la dosificación de compuestos mediante el sistema de pipeteo Vprep. Si no está disponible, se recomienda el uso de una pipeta electrónica multicanal.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilización antes de la lisis
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Determinación de células vivas
Vprep Pipetting System	Agilent		Cambio de medio y dispensación de compuestos. Alternativamente, se puede utilizar una pipeta electrónica multicanal.

Medio base