Expresión de transgenes en células cultivadas utilizando vectores virales adenoasociados recombinantes no purificados

Summary

El virus adenoasociado recombinante (rAAV) se usa ampliamente para la administración clínica y preclínica de genes. Un uso poco apreciado de los rAAV es la transducción robusta de células cultivadas sin necesidad de purificación. Para los investigadores nuevos en rAAV, proporcionamos un protocolo para la clonación de casetes transgénicos, la producción de vectores crudos y la transducción de cultivos celulares.

Abstract

Los vectores virales adenoasociados recombinantes (rAAV) pueden lograr una expresión transgénica potente y duradera sin integrarse en una amplia gama de tipos de tejidos, lo que los convierte en una opción popular para la administración de genes en modelos animales y en entornos clínicos. Además de las aplicaciones terapéuticas, los rAAV son una herramienta de laboratorio útil para administrar transgenes adaptados a las necesidades experimentales y los objetivos científicos del investigador en células cultivadas. Algunos ejemplos son los genes reporteros exógenos, los casetes de sobreexpresión, la interferencia de ARN y las herramientas basadas en CRISPR, incluidas las de las pantallas de todo el genoma. Las transducciones rAAV son menos dañinas para las células que la electroporación o la transfección química y no requieren ningún equipo especial ni reactivos costosos para producirse. Los lisados crudos o los medios acondicionados que contienen rAAV se pueden agregar directamente a las células cultivadas sin purificación adicional para transducir muchos tipos de células, una característica subestimada de los rAAV. Aquí, proporcionamos protocolos para la clonación básica de casetes de transgenes y demostramos cómo producir y aplicar preparaciones crudas de rAAV a células cultivadas. Como prueba de principio, demostramos la transducción de tres tipos de células que aún no se han reportado en aplicaciones de rAAV: células placentarias, mioblastos y organoides del intestino delgado. Discutimos los usos apropiados de las preparaciones crudas de rAAV, las limitaciones de los rAAV para la administración de genes y las consideraciones para la elección de la cápside. Este protocolo describe un método simple, de bajo costo y efectivo para que los investigadores logren una entrega productiva de ADN en cultivos celulares utilizando rAAV sin la necesidad de laboriosos pasos de titulación y purificación.

Introduction

La elucidación de las bases moleculares de las funciones celulares a menudo requiere la expresión de ADN transgénico en cultivos celulares. Para expresarse, los transgenes deben penetrar a través de la membrana selectiva de una célula y llegar al núcleo ^1,2. Por lo tanto, la capacidad de eludir eficazmente las barreras físicas de la célula y manipular sus procesos centrales es una necesidad para aplicar la transgénesis para descubrir nuevos fenómenos biológicos. Un enfoque aprovecha la capacidad intrínseca de los virus para entregar y expresar ADN extraño ^3,4.

El virus adenoasociado (AAV) es uno de los virus de mamíferos más pequeños: su genoma de ADN monocatenario de 4,7 kilobases (kb) contiene dos genes, rep (para replicasa) y cap (para cápside), empaquetados dentro de una cápside icosaédrica de 60 meros que mide 25 nm. Los genes rep/cap tienen múltiples promotores, marcos de lectura y productos de empalme que codifican al menos nueve proteínas únicas necesarias para la replicación, producción y empaquetamiento viral ^5,6. Además, ambos extremos del genoma contienen estructuras secundarias llamadas repeticiones terminales invertidas (ITR) que son necesarias para la replicación del ADN, el empaquetamiento del genoma y el procesamiento posterior durante la transducción 7,8,9,10. Los RTI son los únicos elementos de ADN que se requieren para el empaquetamiento del genoma en la cápside y, por lo tanto, el AAV se puede clonar con fines de administración de transgenes reemplazando los genes rep/cap virales con la elección de un investigador de elementos reguladores y/o genes de interés⁶. El AAV recombinante (rAAV) resultante, con un genoma vectorial (VG) modificado, se utiliza ampliamente en la clínica para la terapia génica humana y ha acumulado éxitos¹¹. Un uso subestimado del vector es en el laboratorio; Los rAAV pueden lograr de manera eficiente la expresión de transgenes en células cultivadas para satisfacer las necesidades experimentales de un investigador¹².

El método más común para producir rAAV es mediante transfección de plásmidos triples en células HEK293 o 293T (Figura 1). El primer plásmido, comúnmente llamado plásmido cis, contiene el transgén deseado flanqueado por ITR (pAAV). Dependiendo de la aplicación, los plásmidos cis con elementos comunes, como promotores fuertes o herramientas basadas en CRISPR, están disponibles para su compra. El segundo es el plásmido pRep/Cap que contiene los genes rep y cap AAV de tipo salvaje proporcionados en trans, es decir, en un plásmido separado, que no contiene ITR que expresa elementos reguladores y estructurales que luego interactúan con el plásmido cis, y por lo tanto se denomina plásmido trans. Además de encerrar físicamente la VG, la cápside influye en el tropismo celular^12,13. Al proporcionar el gen de la cápsula específico del serotipo en trans, los investigadores pueden maximizar fácilmente la eficiencia de la transducción eligiendo un serotipo de cápside optimizado para su célula diana dada. Por último, como Dependoparvovirus, el AAV requiere de un virus auxiliar para activar la expresión rep/cap de sus promotores virales, lograda por genes auxiliares adenovirales, proporcionados en un tercer plásmido como pAdΔF6^14,15. Después de 72 h de transfección de plásmido triple, el vector puede liberarse de las células productoras en el medio de cultivo mediante ciclos repetidos de congelación/descongelación. A continuación, se recoge todo el contenido de la placa y se eliminan los residuos celulares grandes mediante centrifugación; el sobrenadante de medios resultante es una preparación cruda de rAAV lista para transducciones posteriores.

Figura 1: Visión general de la producción cruda de vectores rAAV. La producción y transducción de crudo rAAV se puede lograr en 5 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El rAAV puede ser más favorable para la administración de transgenes en comparación con otros métodos de transfección, que comúnmente se asocian con toxicidad celular, baja eficiencia y reactivos y equipos costosos, como la electroporación o la transfección a base de químicos/lípidos^16,17. El rAAV evita estos obstáculos y, a menudo, proporciona una potente expresión de transgenes con una toxicidad mínima y un tiempo de manipulación mínimo. Es importante destacar que la producción de rAAV y su aplicación en cultivos celulares es sencilla y rara vez requiere la purificación del vector a partir de los medios de cultivo (Figura 1). Además, rAAV no integra su VG en el genoma del huésped, a diferencia de la administración de transgenes lentivirales, y por lo tanto reduce el riesgo de mutagénesis insercional¹⁸. A pesar de los beneficios potenciales del uso de rAAV para la administración de transgenes, se deben considerar las limitaciones. Es importante destacar que el tamaño del transgén, incluidos los RTI, no debe exceder los 4,9 kb debido a las limitaciones físicas de la cápside, lo que limita la capacidad de un investigador para administrar eficazmente grandes elementos reguladores y transgenes. Además, dado que el rAAV es un virus no integrador, la transducción da lugar a una expresión transitoria del transgén en las células en división y puede no ser práctica para una expresión estable. Sin embargo, los métodos que utilizan plantillas duales de Cas9 administradas por rAAV y de reparación dirigida por homología (HDR) pueden utilizarse para insertar secuencias de forma estable en loci genómicos específicos si un investigador lo desea¹⁹.

Protocol

1. Adquisición de plásmidos

NOTA: Este protocolo clonará un gen de interés (GOI) en un plásmido que contiene ITR con un promotor de citomegalovirus (CMV) y una secuencia de poliadenilación SV40 (pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40). Sin embargo, este plásmido se puede usar sin clonación adicional para producir rAAV, empaquetando un conveniente reportero dual de EGFP y luciferasa. Los plásmidos con diferentes elementos reguladores o para diferentes aplicaciones, como los experimentos basados en CRISPR, están disponibles en línea y seguirán pasos de clonación similares a los que se indican a continuación (consulte la discusión para conocer los pasos de clonación adicionales). Además, se pueden usar plásmidos rep/cap o trans para diferentes serotipos: este protocolo usará rep/cap para el serotipo 2 de AAV.

1. Compre puñaladas bacterianas que contengan un plásmido cis que contenga ITR, un plásmido auxiliar de adenovirus, un plásmido rep/cap y un plásmido que contenga un GOI. Raye las bacterias en placas de agar individuales que contengan antibióticos específicos para la resistencia de cada plásmido. Incubar las bacterias a 30 °C durante la noche para que crezcan.
   NOTA: Si un plásmido con un GOI no está disponible para su compra, se puede comprar en línea un fragmento de ADN sintético (consulte la Tabla de materiales). Además, se puede utilizar un fragmento de ADN sintético para omitir todo el proceso de PCR si se desea.
2. Recoger una sola colonia de cada placa y cultivar en 3 mL de tampón Luria Bertani (LB) suplementado con el antibiótico correspondiente a 30 °C durante la noche, agitando a 180 rpm. Transfiera 1 mL de la bacteria a un matraz estéril de Erlenmeyer de 250 mL que contenga 50 mL de tampón LB suplementado con el antibiótico correspondiente. Agitar a 30 °C, 180 rpm durante la noche.
3. Transfiera las bacterias a un tubo cónico de 50 ml y centrifugue durante 20 minutos a 3.000 x g, temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante. Aísle el plásmido usando un kit de preparación midip bajo o libre de endotoxinas según las instrucciones del fabricante.
   NOTA: Los RTI son estructuras inestables. Para evitar deleciones o mutaciones en el ITR, las células bacterianas deben cultivarse a 30 °C para ralentizar la división celular y mitigar los errores de replicación. Para aumentar el rendimiento y la pureza de los plásmidos, lo ideal es un kit midiprep o maxiprep. Se recomienda utilizar un kit bajo en endotoxinas o libre de endotoxinas para reducir la contaminación de las células por endotoxinas aguas abajo. No es necesario realizar el aislamiento de plásmidos dentro de una campana de flujo laminar, ya que la contaminación de la preparación de plásmidos no es probable si se realiza en un banco estándar.

2. Clonación de un gen de interés en un plásmido que contiene AAV ITR

1. Abra el mapa de plásmidos que contiene el GOI en un software de visualización de ADN.
   NOTA: El casete completo, incluidos los RTI, no debe exceder los 4,9 kb debido a las limitaciones físicas de empaquetado de la cápside. Además, la amplificación por PCR no se puede lograr a través de ITR debido a estructuras secundarias. Como tal, no se recomienda el ensamblaje de Gibson para la clonación de transgenes rAAV.
   1. Haga clic en la pestaña Secuencia para mostrar la secuencia completa del plásmido. Desplácese hasta la región más 5' de la secuencia GOI y haga clic en el primer nucleótido mientras arrastra hacia adentro hacia el cuerpo del gen para crear un cebador hacia adelante. Liberar una vez que se haya alcanzado una temperatura de fusión (Tm) de ~55 °C.
   2. Haga clic en Imprimación hacia adelante. Incluya manualmente la secuencia para un sitio de restricción EcoRI (5' GAATTC 3') en el extremo 5' de la secuencia del cebador. Además, agregue seis bases aleatorias adicionales en el extremo 5' de este sitio de restricción para permitir que la enzima interactúe de manera eficiente con el ADN. Haga clic en Agregar imprimación. Consulte la Figura 2 para ver un ejemplo representativo.
   3. Revise la imprimación para asegurarse de que no pueda formar horquillas o dímeros de imprimación (excepto para el sitio de restricción que es palindrómico). Si se forman horquillas, cambie la secuencia aleatoria de las seis bases adicionales. Además, asegúrese de que el cebador no se una a ninguna otra parte del plásmido.
   4. Repita los pasos para crear un cebador inverso en la región más 3' del GOI hacia el interior del cuerpo del gen. Haga clic en Reverse Primer e incluya un sitio de restricción NotI (5' GCGGCCGC 3').
      NOTA: El Gobierno de la India no puede contener sitios de restricción EcoRI o NotI; si es así, será necesario utilizar diferentes enzimas de restricción.
2. Amplificar el GOI en una reacción de PCR de 50 μL. Utilice los componentes individuales necesarios de la Tabla 1.
   1. Coloque la reacción en un termociclador y siga los parámetros del ciclo de la Tabla 2 para la programación. Si los cebadores tienen diferentes T m, utilice el T_m inferior para el programa.
   2. Verifique la amplificación del fragmento de PCR correcto agregando 1 μL de colorante de carga de gel (6x) a 5 μL de reacción de PCR. Ejecute una escalera de ADN y la mezcla de PCR en un gel de agarosa al 0,8% que contenga bromuro de etidio y visualice con luz ultravioleta.
      PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es un mutágeno conocido.
   3. Si aparece una sola banda específica en el gel, purifique el producto de PCR restante en el tubo de tira de PCR utilizando un kit de limpieza de PCR basado en columna según las instrucciones del fabricante. Si aparecen varias bandas (debido a una amplificación no específica), extirpe la banda deseada y purifique el ADN con un kit de extracción en gel según las instrucciones del fabricante.
3. Digiera el producto de PCR purificado y el plásmido de esqueleto pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 en una reacción de 50 μL con los componentes individuales requeridos de la Tabla 3 durante 1 h a 37 °C. Se requiere una mayor cantidad de ADN plasmídico pAAV debido a la recuperación ineficiente esperada después de la extracción en gel.
   NOTA: Las enzimas de restricción utilizadas son versiones de alta fidelidad (HF). Regular NotI no se puede utilizar con el búfer CutSmart. Si se utilizan diferentes enzimas, es posible que se requiera una temperatura de incubación y un tampón diferentes.
   1. Purifique el producto de PCR digerido con un kit de limpieza de PCR basado en columna según las instrucciones del fabricante.
   2. Prepare el plásmido de esqueleto pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 digerido para la electroforesis en gel agregando 10 μL de colorante de carga de gel (6x) a 50 μL de reacción de digestión. Cargue una escalera de ADN, una reacción de digestión y 250 ng de plásmido no digerido (control negativo) en un gel de agarosa al 0,8% que contenga bromuro de etidio con pocillos de dientes anchos. Visualice con luz ultravioleta, extirpe el fragmento deseado (~4,5 kb) y purifique el ADN utilizando un kit de extracción en gel según las instrucciones del fabricante.
4. Ligue el producto de PCR digerido y el plásmido primario de pAAV digerido en una reacción de ligadura de 20 μL con los componentes individuales requeridos de la Tabla 4. Para calcular la cantidad de productos de PCR necesarios, utilice la Fórmula 1. Normalmente, se utiliza una relación molar de 3:1 entre el producto de la PCR (inserto) y la columna vertebral (pAAV), con una masa de 50 ng de la columna vertebral.
   Fórmula 1
5. Realice un control negativo sustituyendo el producto PCR por agua. Incubar las reacciones de ligadura a 16 °C durante la noche o a temperatura ambiente durante 2 h.
6. Descongele un vial de células bacterianas competentes con deficiencia de recombinación (como las células Stbl3) en hielo y coloque 50 μL en un tubo de 1,5 ml. Añadir 3 μL de la reacción de ligadura directamente sobre las células e incubar en hielo durante 30 min.
   NOTA: Los ITR son estructuras inestables y, por lo tanto, requieren cepas bacterianas deficientes en recombinación para limitar los eventos de deleción y recombinación de ITR. Las células DH5α se pueden utilizar de forma intermitente para la propagación (una o dos veces), pero no se recomiendan para su uso a largo plazo. La integridad del ITR debe comprobarse regularmente después de la purificación de midiprep.
   1. Aplicar un choque térmico a las bacterias en un baño de agua a 42 °C durante 30 s y luego transferirlas inmediatamente a hielo durante 2 min. Añadir 200 μL de tampón LB y agitar durante 1 h a 30 °C, 180 rpm.
   2. Extender 125 μL de la mezcla en una placa de agar con el antibiótico correspondiente e incubar durante la noche (~18 h) a 30 °C. Elija varios clones y colóquelos en un tubo de cultivo de plástico estéril con 3 ml de LB que contenga el antibiótico correspondiente. Incubar durante la noche agitando a 30 °C, 180 rpm.
      NOTA: Para evitar deleciones o mutaciones en el ITR, las células bacterianas deben cultivarse a 30 °C para ralentizar la división celular y mitigar los errores de replicación. Además, se deben elegir colonias más pequeñas, ya que las que no tienen RTI pueden tener una ventaja de crecimiento sobre otras.
   3. Pipetear 1,8 ml de cada cultivo en un tubo de 2 ml y centrifugar a 6.000 x g durante 3 min, a temperatura ambiente. Aísla el ADN con un kit de minipreparación. Almacenar los 1,2 ml restantes de cultivo a 4 °C. Verifique los clones correctos mediante secuenciación de ADN o digestión de enzimas de restricción diagnóstica.
      NOTA: Se recomienda la secuenciación Sanger del inserto, pero la procesividad a través de ITR no se puede lograr con métodos estándar. Los RTI deben verificarse mediante un resumen de restricción, como se describe a continuación.
   4. Añadir 50 ml de tampón LB que contiene el antibiótico correspondiente a un matraz Erlenmeyer estéril de 250 ml. Añadir 500 μL del cultivo restante al matraz y agitar a 30 °C, 180 rpm hasta alcanzar un DE₆₀₀ de 0,2-0,5 (~18 h). Transfiera las bacterias a un tubo cónico de 50 ml y centrifugue durante 20 min a 3.000 x g, 4 °C. Aísle el ADN utilizando un kit de preparación midiprep bajo o libre de endotoxinas.
   5. Compruebe la integridad de la ITR con 20 μL de digestión de la enzima de restricción diagnóstica utilizando XmaI (o SmaI). Prepare una reacción que contenga 500 ng de plásmido, 0,5 μL de enzima y 1x tampón; incubar durante 1 h a 37 °C. Ejecute la reacción en un gel de agarosa al 0,8%. Si los ITR están intactos, la digestión dará una banda a ~2,9 kb y otra banda del tamaño del casete. Si no se observa esta banda distintiva, es posible que el ITR no esté intacto y que sea necesario volver a realizar la clonación.
      NOTA: Los plásmidos que contienen sitios de restricción XmaI (o SmaI) (además de los del ITR) tendrán bandas adicionales en el gel.

Figura 2: Ejemplo representativo para el diseño de imprimación. Diseño de cebador directo e inverso para un transgén mScarlet (ejemplo representativo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Importe	Componente
X μL	Plantilla de ADN (25 ng)
1 μL	Imprimación F (10 μM)
1 μL	Imprimación R (10 μM)
1 μL	dNTP (10 mM)
10 μL	Búfer de Phusion (5x)
1 μL	Phusion Polimerasa
X μL	Agua
50 μL	Volumen final

Tabla 1: Reactivos de amplificación por PCR. Los componentes necesarios para una reacción de PCR exitosa.

Paso	Temperatura	Hora
Desnaturalización inicial	98 °C	1 minuto
30 Ciclos	98 °C	10 s
	Tm de imprimación	30 s
	72 °C	30 s por kb
Extensión final	72 °C	10 minutos
Sostener	4 °C	indefinidamente

Tabla 2: Programación de amplificación por PCR. Los parámetros cíclicos necesarios para una reacción de PCR exitosa.

Importe	Componente
X μL	Producto de PCR (1 μg) o plásmido pAAV (3 μg)
5 μL	Búfer (10x)
1 μL	EcoRI-HF
1 μL	NotI-HF
X μL	Agua
50 μL	Volumen final

Tabla 3: Reactivos de digestión. Los componentes necesarios para una reacción digestiva exitosa.

Importe	Componente
X μL	Insertar (X ng)
X μL	Red troncal (50 ng)
2 μL	Tampón de ADN ligasa T4 (10x)
1 μL	ADN ligasa T4
X μL	Agua
20 μL	Volumen final

Tabla 4: Reactivos de ligadura. Los componentes necesarios para una reacción de ligadura exitosa.

3. Producción de vectores con transfección de plásmidos triples

NOTA: Los siguientes valores están optimizados para un solo pocillo de una placa de 6 pocillos que produce un volumen final de preparación de crudo de 2 mL. Todos los valores pueden ampliarse 10 veces para una placa de 15 cm que produce un volumen final de 20 ml o reducirse 4 veces para una placa de 24 pocillos con un volumen final de 500 μl.

1. Prepare una reserva de 1 μg/μL de clorhidrato de polietilenimina (PEI) MAX disolviendo 100 mg de PEI MAX en 100 ml de agua destilada. Ajuste el pH a 7.1 con NaOH. Filtrar: esterilizar la mezcla con un filtro de 0,22 μm y congelar alícuotas de 1 ml a -20 °C para su almacenamiento a largo plazo. Una vez descongelado, conservar el reactivo durante 1 mes a 4 °C.
2. Siembre 3 x 10 5^células HEK293 o HEK293T en una placa de 6 pocillos con medio de águila modificado de Dulbecco precalentado (DMEM, 4,5 g/L de glucosa, 110 mg/L de piruvato de sodio) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%. Crecer hasta ~75%-90% de confluencia en una incubadora ajustada a 37 °C y 5% de CO₂ (Figura 3).
   NOTA: Se ha observado que las células cultivadas con penicilina/estreptomicina (P/S) disminuyen el rendimiento de la producción de vectores. El uso de una técnica estéril adecuada evita la necesidad de utilizar P/S, por lo que se recomienda no cultivar células HEK293 con el antibiótico²⁰. Si se requiere P/S en las transducciones posteriores, se recomienda agregar P/S a la preparación del crudo después de la cosecha.
3. En un tubo de 2 ml, prepare una mezcla que contenga 1,3 μg de pAAV2/2 (Rep/Cap, serotipo 2), 1,3 μg de pAAV.GOI, 2,6 μg de pAdΔF6 y DMEM sin suero (4,5 g/L de glucosa, 110 mg/L de piruvato de sodio) en un volumen total de 100 μL (consulte la Tabla complementaria 1 para cálculos convenientes).
4. Prepare un control negativo en un tubo separado reemplazando pRep/Cap con cualquier plásmido no relacionado. El testigo negativo tiene en cuenta el plásmido pAAV.GOI no empaquetado presente en la preparación cruda que posiblemente podría transfectar células durante la transducción, aunque es raro.
   NOTA: El plásmido maxiprep o midiprep bajo o libre de endotoxinas es ideal para la triple transfección y, por lo general, produce un vector de título más alto en comparación con el ADN de miniprep, aunque el ADN de miniprep se puede usar para pruebas preliminares rápidas y sucias.
5. Añadir 5,2 μL de PEI MAX a la mezcla de plásmidos; se trata de una mezcla de plásmido:PEI con una proporción de 1:1. Mezcle bien pulsando de 10 a 15 veces en un mezclador de vórtice ajustado a 7. Si se producen varias preparaciones de vectores, agregue PEI a cada mezcla de plásmidos a intervalos de tiempo escalonados de 1 min (es decir, la preparación 1 a t = 0 min, la preparación 2 a t = 1 min, etc.) para permitir un tiempo suficiente para aspirar los pocillos y diluir la reacción en los siguientes pasos.
   NOTA: Se ha observado que una proporción de 1:1 de plásmido:PEI es óptima. Sin embargo, los usuarios individuales pueden optimizar esta relación para obtener la máxima eficiencia. Consulte la discusión sobre cómo realizar la optimización de PEI (consulte también la Tabla complementaria 2).
6. Incubar cada tubo durante exactamente 15 minutos y luego diluir la reacción con 1,9 ml de SF DMEM (4,5 g/L de glucosa, 110 mg/L de piruvato de sodio) para obtener un volumen final de 2 ml. Pipetear suavemente 2 veces para mezclar. La mezcla excesiva interrumpirá los complejos plásmido/PEI y dará como resultado una menor eficiencia de transfección.
7. Aspire los medios del pocillo y agregue suavemente la mezcla de plásmido:PEI en los lados del pocillo para evitar el desprendimiento celular. Incubar las células durante 72 h a 37 °C y 5% de CO₂. La lisis celular y el desprendimiento durante la incubación es un proceso normal de producción de rAAV (Figura 4).

Figura 3: Células HEK293 listas para la transfección. La confluencia ideal (75%-90%) de células HEK293 necesarias para la transfección de plásmidos triples. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Células HEK293 después de la transfección. La aparición de células HEK293 antes y después de 1, 2 o 3 días después de la transfección con pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40, pAAV2/2, pAdΔF6 y una relación 1:1 de plásmido:PEI. Barras de escala: 400 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Cosecha de preparaciones de vectores crudos

1. Congelar toda la placa de células transfectadas durante 30 min a -80 °C, seguido de una descongelación durante 30 min a 37 °C. Repita para un total de tres ciclos de congelación/descongelación. No retire la tapa, la placa debe permanecer estéril en el interior. Las placas pueden permanecer a -80 °C hasta que estén listas para continuar con los siguientes pasos.
   NOTA: Una incubadora no humidificada funciona mejor para descongelar, lo que minimiza la condensación en el exterior de las placas que puede provocar una contaminación accidental.
2. Realice los siguientes dos pasos en una campana de flujo laminar utilizando técnicas asépticas. Mezcle cada pozo pipeteando para garantizar la máxima interrupción de las células. Transfiera el lisado a un tubo de 2 ml y centrifugue durante 15 minutos a 15.000 x g, temperatura ambiente para eliminar los restos celulares.
3. Transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo de 2 ml. Esta preparación cruda se puede utilizar inmediatamente sin valoración ni purificación. El vector puede almacenarse a 4 °C durante varios meses o a -20 °C durante años.
   NOTA: Si es necesario, los títulos pueden calcularse mediante PCR cuantitativa (qPCR) cuantificando el número de genomas de vectores (VG) dentro de las partículas resistentes a la DNasa. Como tal, los títulos se dan en unidades de VG/mL. El vector almacenado durante varios meses a 4 °C debe volver a valorarse antes de su uso, ya que el vector puede agregar y/o unir las paredes del tubo, reduciendo el título de la preparación.

5. Transducción

1. Coloque la placa del tipo de célula deseado (p. ej., Huh7) en una placa de 96 pocillos con una confluencia objetivo del 50 % al 75 %, dependiendo de la duración de la transducción. Una mayor confluencia puede resultar en una reducción de la eficiencia de la transducción de AAV.
2. Agregue vector (p. ej., CMV.mScarlet) a las células sin conocer el título de la preparación cruda para aplicaciones en las que la dosis no es relevante, como probar un panel de cápsidas para la transducción en un nuevo tipo de célula. Realizar una serie de diluciones 1:3 de la preparación cruda en medios libres de suero (SF) para obtener la cantidad óptima de vector requerida para la aplicación. Aspire los medios de la placa de 96 pocillos y agregue 50-100 μL de preparación cruda diluida a los pocillos. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO₂.
   NOTA: El suero puede contener anticuerpos que pueden neutralizar el vector AAV y reducir la eficiencia de la transducción. Sin embargo, el suero se puede utilizar durante la transducción para tipos de células sensibles.
3. Retire el vector después de 48 h después de la transducción (hpt) y lave las células una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) precalentada. Los vectores también pueden eliminarse y sustituirse por medios que contengan suero a partir de 2 hpt para los tipos de células sensibles. Para muchas aplicaciones, realice la incubación durante la noche para transducir las células y reemplazar los pocillos con medios frescos que contengan suero por la mañana. Los tipos de células robustas, como Huh7 y U2-OS, no requieren un cambio de medio.
4. Finalice la transducción fijando las células en paraformaldehído (PFA) al 4% durante 10 min. También se pueden utilizar varios métodos de terminación en función de la aplicación (por ejemplo, lisis). Para la mayoría de los tipos de células, la expresión máxima se produce a las 48 hpt y, por lo tanto, es un criterio de valoración experimental común.

6. Variaciones en el método de transducción por tipo de célula

NOTA: Los diferentes tipos de células requieren diferentes condiciones de cultivo. Por lo tanto, la adición de vector para la transducción debe optimizarse en función de las necesidades del tipo de célula. A continuación se presentan protocolos de transducción muy específicos para los tipos de células incluidos en los resultados representativos, que ilustran algunas variaciones de los protocolos de transducción que un investigador puede desear probar para sus propias necesidades.

1. Organoides del intestino delgado de ratón
   1. Derivar organoides del intestino delgado (mSIO) de ratón a partir de una preparación de cripta del intestino delgado de ratones C57BL/6J. Incrustar organoides en una matriz de membrana basal al 90 % y cultivarlos en placas de 24 pocillos que contengan medio de crecimiento de organoides (sin antibióticos) o medio de pretransducción (medio acondicionado con Wnt3a al 50 % [producido internamente utilizando células L Wnt-3A en medio de crecimiento de organoides], 10 mM de nicotinamida, 10 μM de inhibidor de ROCK y 2,5 μM de CHIR99021) durante un paso (5-7 días) antes de la transducción a 37 °C y 5% de CO₂.
   2. Antes de la transducción, enjuague los organoides con D-PBS, rompa las cúpulas de la matriz de la membrana basal mediante pipeteo y disocie los organoides en pequeños grupos de células incubándolos en medio de disociación durante 10 minutos a 37 °C y pipeteando más.
   3. Detenga el proceso de disociación celular agregando 5% de FBS en DMEM/F-12 con 15 mM HEPES, transfiera los grupos celulares a tubos de centrífuga y recoja los grupos celulares por centrifugación durante 5 min a 1000 x g, temperatura ambiente.
   4. Vuelva a suspender los grupos celulares en un medio de transducción (medio de pre-transducción que contenga 10 μg/mL de polibreno o medio de crecimiento de organoides que contenga 10 μg/mL de polibreno) y transfiéralos a placas de 48 pocillos, seguido de la adición de preparaciones crudas de AAV que envasan CMV.mScarlet para la transducción.
   5. Realizar la transducción de organoides centrifugando la placa durante 1 h a 600 x g y 37 °C y luego incubar a 37 °C durante 6 h adicionales. Recoja los organoides transducidos en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, centrifugue durante 5 minutos a 1000 x g, temperatura ambiente, y póngalos en hielo.
   6. Después de retirar el sobrenadante, resuspender los organoides transducidos en una matriz de membrana basal al 90% en un medio de pretransducción o en un medio de crecimiento de organoides y gotas de semillas de 20 μL en un pocillo de un cubreobjetos con cámara precalentado.
   7. Después de la incubación durante 10 minutos en la incubadora, incrustar la gota en 350 μL de medio de pre-transducción o medio de crecimiento de organoides e incubar a 37 °C en la incubadora. Determinar la eficiencia de la transducción 2-5 días después de la transducción mediante la obtención de imágenes de los organoides transducidos en un microscopio confocal y estimar el porcentaje de células fluorescentes rojas por organoide.
2. Células BeWo
   1. A las 24 h antes de la transducción, placa de células BeWo de coriocarcinoma placentario humano a 10.000 células por pocillo de placa de 96 pocillos. Diluir las preparaciones crudas de AAV envasado CMV.mScarlet a 1:1 en medio F12-K BeWo sin suero hasta un volumen total de 50 μL por pocillo. Aspire el medio del pocillo y reemplácelo con 50 μL de AAV diluido por pocillo.
   2. Incubar las células a 37 °C durante la noche (~18 h) y luego añadir 100 μL de medio F12-K BeWo que contenga un 10% de FBS para aumentar el volumen total a 150 μL. Incubar las células durante 6 h adicionales para un total de 24 h después de la transducción (hpt).
   3. Para la obtención de imágenes, tiña las células vivas con el colorante Hoechst durante 30 minutos en medio F12-K, luego cambia el medio por DMEM sin fenol que contenga un 10 % de FBS, 1 suplemento de glutamax y 1 suplemento de piruvato de sodio para la obtención de imágenes. Realice imágenes de células vivas en un microscopio confocal utilizando juegos de filtros DAPI (para imágenes de Hoechst) y mCherry (para imágenes de mScarlet) con 37 °C y 5% de CO₂.
3. Células Hepa1-6 y Huh7
   1. Placa de células hepáticas Hepa1-6 murinas y células hepáticas humanas Huh7 en DMEM (4,5 g/L de glucosa, 110 mg/L de piruvato de sodio, 10% FBS) a 5.000 células por pocillo de una placa de 96 pocillos 24 h antes de la transducción.
   2. Añadir 50 μL de preparados crudos de AAV sin diluir para envases CMV.mScarlet directamente a las células e incubar a 37 °C durante 48 h. Lave las células una vez en PBS, fíjelas en PFA al 4% y tiña con tinte Hoechst durante 10 minutos. Realice la obtención de imágenes en un microscopio confocal utilizando los conjuntos de filtros DAPI (para la obtención de imágenes de Hoechst) y mCherry (para la obtención de imágenes de mScarlet).
4. Células C2C12 y HSkMC
   1. Placa de mioblastos murinos indiferenciados C2C12 y mioblastos indiferenciados de células musculares esqueléticas primarias humanas (HSkMC) a 5.000 células por pocillo de una placa de 96 pocillos, 72 h antes de la transducción.
   2. Diluir las preparaciones crudas de AAV que envasan CMV.mScarlet a 1:1 en DMEM (4,5 g/L de glucosa, Penn/Strep, 20% FBS) para mioblastos C2C12 o medios de crecimiento del músculo esquelético para mioblastos HSkMC. Diferencie los mioblastos de HSkMC a miotubos cambiando el medio a medio de diferenciación.
   3. Incubar mioblastos y miotubos en preparaciones diluidas de AAV durante 24 h a 37 °C. Tiña las células vivas con el colorante Hoechst durante 10 minutos y toma imágenes en un microscopio confocal utilizando los conjuntos de filtros DAPI (para imágenes de Hoechst) y mCherry (para imágenes de mScarlet).

Results

Encontrar la cápside óptima para la transducción de células cultivadas de interés
Se transducieron una variedad de tipos celulares para determinar el tropismo de varios serotipos de cápside (Figura 5). Los serotipos naturales AAV2¹⁴, AAV4 21, AAV5 22, AAV8 23, AAV9 24 y las variantes de cápside modificadas Anc80 25, DJ 26, LK03²⁷ y^{KP1 28} se empaquetaron con un genoma vectorial que expresaba mScarlet bajo un promotor de CMV, clonado utilizando los métodos proporcionados en este protocolo. Las preparaciones de vectores crudos sin ititrar se diluyeron en los medios de cultivo apropiados y las células se transducieron durante 24+ h y se obtuvieron imágenes (Figura 5B). La eficiencia de la transducción se calculó por la proporción de células totales que eran mScarlet+, o la proporción de células en un solo plano z que eran mScarlet+ (para organoides del intestino delgado de ratón; Figura 5C). No se proporcionan eficiencias de transducción (células mScarlet+) para los miotubos C2C12 y HSkMC diferenciados, sino más bien para los mioblastos C2C12 y HSkMC indiferenciados (Figura 5A).

AAV2 y KP1 fueron los serotipos más potentes en todas las líneas celulares probadas (Figura 5A). También se observó que tipos de células similares procedentes de diferentes especies se transducen con diferentes eficiencias. Por ejemplo, Hepa1-6 (una línea celular hepática derivada de murina) exhibe una marcada disminución en la transducción en comparación con Huh7 (una línea celular hepática derivada de humanos) cuando se usa AAV2 (Figura 5B). Además, las diferentes condiciones de los medios juegan un papel importante durante la transducción. Los organoides del intestino delgado de ratón (mSIO) cultivados en medios de pretransducción se transducen con menos eficacia en comparación con los cultivados en medios de crecimiento de organoides (Figura 5C). Además, AAV2 transduce eficientemente mioblastos HSkMC indiferenciados y miotubos HSkMC diferenciados (Figura 5B), aunque el análisis cuantitativo de los miotubos es difícil y, por lo tanto, no se proporciona.

Las altas eficiencias de transducción observadas para varios tipos de células en la Figura 5 muestran que las preparaciones de vectores crudos se pueden usar de manera efectiva para transducir una variedad de tipos de células sin pasos adicionales como la purificación y la valoración. Sin embargo, se debe prestar especial atención a la hora de elegir una cápside para maximizar la administración de transgenes. Muchas otras líneas celulares y cápsidas han sido probadas previamente y se han publicado, aunque con preparaciones de vectores purificados¹².

Un efecto independiente de las partículas vectoriales de las condiciones del medio puede afectar la eficiencia de la transducción. Sin embargo, generalmente se acepta que el tropismo (es decir, la absorción específica del tipo de célula y la expresión del vector) es una propiedad específica de la cápside²⁹. Todavía no se ha observado que una comparación entre las preparaciones crudas y purificadas de dosis igualadas afecte al tropismo celular. Por lo tanto, las preparaciones de vectores crudos se pueden utilizar de manera similar a los vectores purificados en cultivos celulares.

Figura 5: Transducción de vectores crudos de varios tipos de células . (A) Porcentaje de mScarlet+ después de la adición de varios vectores AAV que contienen un transgén mScarlet . (B) Células que expresan mScarlet liberadas del serotipo 2 de AAV. Barras de escala: 100 μm (Hepa1-6, Huh7, C2C12 y HSkMC), 200 μm (BeWo), 20 μm (mSIO). Abreviaturas: hpt = horas después de la transducción. (C) Los organoides del intestino delgado (mSIO) de ratón fueron tratados con rAAV en medios de pre-transducción o en medios de crecimiento de organoides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla complementaria 1: Hoja de trabajo de transfección de plásmidos triples. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 2: Hoja de trabajo de optimización de PEI. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Clonación
El protocolo de clonación no se limita al plásmido pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 utilizado anteriormente y puede modificarse fácilmente en función de las necesidades experimentales del investigador. Muchos plásmidos que contienen ITR están disponibles en línea para su compra. Por ejemplo, los plásmidos que contienen Cas9 y un sitio de clonación de sgRNA están disponibles, pero requieren pocos pasos adicionales, como el recocido de oligonucleótidos y el tratamiento con PNK³⁰. Además, se pueden encontrar plásmidos que contienen un sitio de clonación múltiple (MCS) con solo ITRs y sin elementos reguladores internos³¹. Si se van a utilizar plásmidos diferentes, las enzimas de restricción (ER) utilizadas para la digestión suelen ser los únicos elementos que pueden necesitar ser cambiados en este protocolo. Sin embargo, una limitación de rAAV es su limitada capacidad de carga. Debido a las limitaciones físicas de la cápside, el genoma del vector no debe exceder los 4,9 kb, incluidos los RTI.

Al aislar plásmidos de bacterias, es fundamental utilizar un kit midiprep o maxiprep con bajo o libre de endotoxinas para mitigar el daño a las células durante la transfección o transducción de plásmidos triples. El plásmido de los kits de minipreparación a menudo contiene impurezas más altas, concentraciones reducidas y menos ADN superenrollado, todo lo cual puede afectar la producción posterior de rAAV y, por lo tanto, no se recomienda.

Es fundamental comprender la estructura y las propiedades de los RTI durante la clonación. En primer lugar, es extremadamente difícil utilizar la PCR a través del ITR. Deben evitarse los diseños de clonación que requieran amplificación por PCR a través de ITR y, además, limitar el uso de la técnica de clonación de ensamblaje de Gibson. Como tal, la clonación con enzimas de restricción es el método preferido para clonar en plásmidos que contienen ITR. Además, ciertos cebadores para la secuenciación de Sanger pueden no ser compatibles si la región secuenciada contiene el ITR. En su lugar, se recomienda utilizar cebadores que se alejen de los RTI y se introduzcan en el cuerpo del genoma del vector para obtener resultados de secuenciación más precisos. En segundo lugar, los ITR son propensos a deleciones, reordenamientos y mutaciones cuando se transforman en bacterias para la amplificación de plásmidos^32,33. Para mitigar estos eventos, se recomienda utilizar cepas bacterianas competentes deficientes en recombinación, como Stbl3, e incubarlas a 30 °C para ralentizar las divisiones celulares. Por último, se ha observado que las colonias más pequeñas pueden corresponder a clones sin reordenamientos o deleciones, ya que las que no tienen RTI pueden conferir una ventaja de crecimiento y ser más grandes. Por lo tanto, se recomienda elegir colonias que sean pequeñas.

Producción de vectores
La producción exitosa del vector rAAV puede verse afectada por múltiples elementos. Un factor crítico es la salud de las células HEK293 o 293T utilizadas para la transfección. En general, lo ideal es un número de pasos bajo, ya que las células con muchos pasajes pueden presentar variaciones genotípicas y fenotípicas que pueden reducir los títulos de rAAV. Además, la densidad de las células sembradas debe tener una confluencia del 75% al 90% para una producción efectiva. Las células dispersas generan bajos rendimientos de vectores porque hay menos células disponibles para producir vectores, mientras que las células demasiado crecidas no se transfectarán de manera eficiente.

Las variaciones entre los lotes de reactivos, las existencias de células y la variabilidad general de un laboratorio a otro contribuyen a las diferencias en la eficiencia de la transfección y el título de producción. Un factor optimizable que puede conducir a mejoras en los títulos es la relación plásmido:PEI en las reacciones de transfección. Es fundamental utilizar PEI Max fresco (<1 mes de antigüedad). Se recomienda utilizar una relación plásmido:PEI de 1:1 como punto de partida, y si la transfección o la eficiencia de la transducción parecen deficientes, probar varias proporciones diferentes. La optimización de la titulación es más fácil si se utiliza un transgén con una lectura visual, como el transgén reportero CMV.Luc.IRES.EGFP utilizado en este documento como material de partida para la clonación. Para realizar la optimización, siga el paso 3 del protocolo utilizando una placa de 12 pocillos y reduciendo las masas de plásmidos y los volúmenes de reactivos en dos (la masa final del plásmido es de 2,6 μg). Ajuste el volumen de PEI en consecuencia para que corresponda a proporciones que van de 1:0,75 a 1:3, con incrementos crecientes de 0,25 (Figura 6). Diluir cada reacción con 950 μL de medio SF después de 15 min. Para mayor comodidad, se puede hacer una mezcla maestra que contenga los plásmidos triples y pipetear individualmente en tubos de 1,5 ml antes de agregar PEI. Recolecta el vector, transduce las células de interés y toma una imagen. El pocillo con la mayor eficiencia de transducción (proporción de células GFP+) corresponde al título más alto y a la relación más óptima de PEI:ADN.

Figura 6: Flujo de trabajo de optimización de PEI. Esquema de los pasos necesarios para la optimización del PEI. Se prueban múltiples proporciones de plásmido: PEI para determinar la proporción óptima. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Consideraciones sobre la cosecha y el título
La técnica de congelación/descongelación utilizada para recolectar el vector rAAV lisa eficazmente las células HEK293 de una manera compatible con el uso directo del lisado clarificado para transducir células cultivadas. Ciertos serotipos de rAAV, como AAV1, AAV8 y AAV9, se liberan de las células durante la producción del vector y pueden cosecharse del medio celular cultivado sin ciclos de congelación/descongelación³⁴. El método descrito aquí suele producir títulos del orden de 1 x 10 10 VG/mL cuando se utilizan cápsidas de AAV2, y 1 x^{10 11} VG/mL para AAV8. Si bien se pueden lograr títulos más altos mediante detergente u otra lisis química, estos son dañinos para las células en uso posterior y requieren que los rAAV se purifiquen aún más a partir del lisado. Un título más bajo es una compensación que un investigador debe considerar al determinar si las preparaciones crudas son apropiadas para sus necesidades de investigación, sin embargo, los títulos marginalmente más bajos producidos por los métodos descritos aquí pueden transducir muy bien muchos tipos de células (ver resultados representativos). Además de la eficiencia de la transfección y la salud celular, los títulos de vectores varían dependiendo de la cápside utilizada durante la producción de rAAV y del tamaño y secuencia del transgén dentro del VG³⁵.

Al cosechar preparaciones de vectores crudos, el ADN plasmídico que se utilizó durante la transfección de plásmidos triples puede estar presente y, aunque es raro, dar lugar a una transfección posterior durante la transducción. Además, las VG no empaquetadas pueden unirse al exterior de las cápsidas e invocar una respuesta inmune innata al ADN monocatenario desnudo y extraño^36,37. Por lo tanto, los tipos celulares sensibles pueden requerir que las preparaciones de vectores se digieran y purifiquen con DNasa para eliminar las VG y el plásmido no empaquetados.

Si se desea calcular el título de una preparación cruda, se puede realizar qPCR para cuantificar el número de VG empaquetadas dentro de partículas resistentes a la DNasa (DRP). Brevemente, una pequeña cantidad de preparación cruda se digiere con DNasa para eliminar el ADN plasmídico, los ácidos nucleicos contaminantes o los VG parcialmente envasados. A continuación, la muestra se somete a qPCR y se cuantifica el VG protegido en el interior de los DRP, lo que da como resultado un título con unidades de genoma del vector por mL de preparación cruda³⁸. No se recomienda realizar la valoración de vectores mediante ensayos basados en ELISA que cuantifiquen los títulos de la cápside. En comparación con el virus AAV de tipo salvaje, el rAAV sufre de una proporción de cápsidas vacías y parcialmente empaquetadas³⁹. ELISA cuantificará todas las cápsidas independientemente de su contenido genómico y sobreestimará las unidades transducibles presentes en una preparación, lo que requiere un VG empaquetado.

Consideraciones sobre la transducción
Son muchos los factores que influyen en las transducciones de rAAV y se deben tener en cuenta las consideraciones adecuadas para cualquier nuevo experimento. Dependiendo del promotor que impulsa la expresión transgénica, el inicio de la expresión puede ocurrir tan pronto como 4 h después de la transducción (hpt), y la expresión máxima generalmente se alcanza a los 48 hpt. Es importante tener en cuenta la duración del tiempo desde la siembra inicial de las células hasta el punto final experimental. Esto es para estimar la confluencia inicial de las células y asegurarse de que no crezcan demasiado al final del experimento. Si las células se vuelven demasiado confluentes, el comportamiento celular puede verse alterado debido a una respuesta de estrés y puede confundir los resultados experimentales. Algunos tipos de células, como U2-OS, pueden tolerar bastante bien el crecimiento excesivo o la inhibición del contacto. Además, pueden soportar largos períodos (48 h+) en medio acondicionado sin suero, producto de este protocolo de producción. Sin embargo, los tipos de células sensibles pueden requerir la adición de suero o la dilución de la preparación cruda con un medio de crecimiento especial para mantener la salud durante la transducción. Una eficiencia de transducción ligeramente reducida por el uso de medios que contienen suero es una compensación potencial para la salud celular y debe ser considerada por el investigador.

Normalmente, para células que se dividen rápidamente, una confluencia inicial de alrededor del 50% es óptima para aplicaciones que terminarán a 48 hpt. Sin embargo, la confluencia se puede ajustar en consecuencia en función de las necesidades del experimento. No se recomienda transducir líneas celulares inmortalizadas de tipo monocapa con más del 75% de confluencia debido a la disminución de las eficiencias de transducción. La mayoría de los tipos de células cultivadas se transducen con éxito y se sanan después de la incubación durante la noche con preparaciones crudas de rAAV, seguidas de un cambio a medios frescos que contienen suero por la mañana.

El serotipo de la cápside es un factor importante a tener en cuenta a la hora de producir rAAV para transducir una célula diana, ya que la cápside es el principal determinante del tropismo celular y la posterior expresión del transgén¹³. AAV2 es un serotipo ampliamente utilizado debido a su capacidad para transducir eficazmente muchos tipos de células cultivadas¹². Esta propiedad de AAV2 puede atribuirse a los proteoglicanos de sulfato de heparina (HSPG) que sirven como factor de unión primario para AAV2 y a los altos niveles de HSPG en las células cultivadas de la adaptación al crecimiento en una placa⁴⁰. Otras cápsides, como AAV9, son menos efectivas en la transducción de tipos celulares amplios y pueden explicarse por sus factores de unión de dependencia que no se expresan en este entorno⁴¹. Por lo tanto, recomendamos AAV2 como cápside de primera elección en células cultivadas si una célula diana deseada no ha sido probada previamente con rAAV en la literatura.

Tenga en cuenta que una limitación importante de las preparaciones de vectores crudos es que son inapropiadas para la transducción de modelos animales. Los estudios in vivo requieren que los preparados se purifiquen y se sometan a una evaluación de calidad.

Consideraciones sobre la expresión de transgenes y la posible integración
Los rAAV no dan lugar de forma fiable a la expresión permanente del transgén. Con el tiempo, las VG pueden silenciarse y la expresión transgénica puede ser cerrada después de varios pasajes⁴². Además, la mayoría de las VG siguen siendo episódicas, y las rAAV no contienen las proteínas Rep virales que mediarían la integración frecuente en el genoma del huésped como en una infección lisogénica viral de tipo salvaje o promoverían la replicación de las VG⁴³. Como resultado, los episomas en las células transducidas eventualmente se diluirán entre las células hijas a través de divisiones.

La integración a nivel basal es una posibilidad para todo el material de ADN transgénico suministrado. Sin embargo, los VG que contienen ITR son propensos a la integración con una frecuencia más alta⁴⁴. Por lo tanto, se puede observar la expresión permanente de un transgén en un pequeño subconjunto de células. Los usuarios deben considerar esta posibilidad, especialmente cuando utilizan rAAV para administrar enzimas que cortan el ADN, como Cas9, ya que las roturas de doble cadena pueden dar lugar a una frecuencia de integración y expresión permanente aún mayor⁴⁵. Si bien esto hace que rAAV sea un buen candidato para entregar plantillas de reparación dirigidas por homología para el marcaje endógeno o la adición de genes, se debe considerar la posibilidad de inserción de Cas9^19,46.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Snapgene DNA viewing sofrware	Snapgene
pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40	AddGene	105533
pAAV2/2 (Rep/Cap)	AddGene	104963
pAdΔ F6	AddGene	112867
LB Agar Carbenicillina	Sigma-Aldrich	L0418
Boekel Scientific Economy Incubadora digital	Boekel Scientific	133000
LB medio, polvo	MP Biomedicals	113002042
Carbencilina (disódica)	GoldBio	C-103-5
New Brunswick I26 Shaker	Eppendorf	M1324-0000
Tubos de centrífuga de 50	mL Centrífuga	430828
Corning 5810 R	Eppendorf	22627040
QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit	Qiagen	12945
PCR TIRAS DE 8 TUBOS EXTRAÍBLES	USA Scientific	1402-3900
Mastercycler nexus	Eppendorf	6333000022
dNTP	Thermo Fisher Scientific 18427013
5x Phusion Buffer	NEB	B0518S	Provisto con la compra de Phusion Polymerase
Phusion  Colorante de	NEB	M0530S
, naranja (6X)	NEB	B7022S
DNA Clean & Concentrador-100	Zymo	D4029
Zymoclean Gel Kit de Recuperación de ADN	Zymo	D4001
NotI-HF	NEB	R3189S
EcoRI-HF	NEB	R3101S
CutSmart Buffer (10x)	NEB	B6004S	Provisto con la compra de la enzima de restricción
UltraPure Agarose	Thermo Fisher Scientific	16500100
Bromuro de etidio	Sigma-Aldrich	E1510
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
T4 T4 Tampón de reacción de ADN ligasa	NEB	B0202S	Provisto con la compra de T4 Ligasa
Eppendorf Tubos Safe-Lock (1,5 ml)	Eppendorf	22363204
Precision Microprocessor Water Bath	Thermo Scientific	51221046
Tubos de cultivo de plástico estéril	Fisher Scientific	149566B
2.0 mL Tubo de microcentrífuga	Thomas Scientific	1149Y01
ZR Miniprep de plásmido - Classic	Zymo	D4015
Xma1	NEB	R0180S
Sma1	NEB	R0141S
Celdas HEK 293T	ATCC	CRL-3216
Corning	de 6 pozos
Gibco  DMEM, alto contenido de glucosa, piruvato	Thermo-Fisher	11995065
Sanyo MCO-18AIC(UV) Incubadora de CO2	Marshall Scientific	MCO-18AIC
PEI MAX (Clorhidrato de polietilenimina)	Polysciences	24765-100
Mezclador Vortex Genie 2	Ciencias de la Microscopía Electrónica	102091-234
Sanyo Congelador Ultrabajo Sanyo		14656-15267-16219
INCU-Line IL 10 con ventana transparente	VWR	390-0384
Microcentrífugas Eppendorf	Eppendorf	05-400-005
Falcon 96-well	Corning	353072
ratones C57BL/6J	Cepa JAX	#000664
medio de crecimiento de organoides	STEMCELL Technologies	6005
L Células Wnt-3A	ATCC	CRL-2647 nicotinamida
	Sigma	N0636-100G
Inhibidor de ROCK	STEMCELL Technologies	72302
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72052
Membrana basal Corning Matrigel Factor de crecimiento reducido (GFR)	Fisher	356231
placa de 24 pocillos	Fisher	08-772-1
D-PBS	Thermo Fisher Scientific	14-190-250
TrypLE Express	Fisher	12604013
DMEM/F-12 con 15 mM HEPES	STEMCELL Technologies	36254
polibreno	Millipore Sigma	TR-1003-G
Placas de 48 pocillos	Fisher	08-772-3D
Thermo Scientific  Nunc Lab-Tek Cubreobjetos con cámara	Fisher	12-565-470
Células BeWo	ATCC	CCL-98
F-12K Medio	ATCC	30-2004
Hepa1-6	ATCC	CRL-1830
Huh7	UC Berkeley BSD Instalación de cultivo celular	HUH-7
C2C12	ATCC	CRL-1772
HSkMC	ATCC	PCS-950-010
Medio de crecimiento de células musculares esqueléticas	Sigma	C-23060
Medio de diferenciación de músculo esquelético	Sigma	C-23061
Invitrogen  Microscopio digital de fluorescencia en color EVOS	Fisher Scientific	12-563-340
Perkin Elmer Opera Phenix	Perkin Elmer	HH14001000
PhenoPlate de 96 pocillos	Perkin Elmer	6055302
DMEM, alto contenido de glucosa, sin glutamina, sin rojo de fenol	Thermo-Fisher	31053028
Suplemento GlutaMAX	Thermo-Fisher 35050079
Piruvato de sodio	Thermo-Fisher	11360070
pAAV2/5 (Rep/Cap)	Addgene	104964
pAAV2/8 (Rep/Cap)	Addgene	112864
pAAV-DJ-N589X (Rep/Cap)	Addgene	130878
pAAV2/9n (Rep/Cap)	Addgene	112865
pAnc80L65AAP	Addgene	92307
KP1 (rep/cap)			regalado por el profesor Mark Kay (Universidad de Stanford)
LK03 (rep/cap)			regalado por el profesor Mark Kay (Universidad de Stanford)
pAAV4 (rep/cap)			regalado por el profesor Luk Vandenberghe (Facultad de Medicina de Harvard)
pAAV.Cas9.sgRNA	Addgene	61591
pAAV.MCS	Addgene	46954
gBlock (fragmentación de ADN sintético)	IDT