Formación ósea integrada a través de la osificación endocondral in vivo utilizando células madre mesenquimales

Summary

La terapia ósea a través de la osificación endocondral mediante la implantación de tejido cartilaginoso artificial producido a partir de células madre mesenquimales tiene el potencial de eludir los inconvenientes de las terapias convencionales. Los hidrogeles de ácido hialurónico son eficaces para escalar injertos de cartílago uniformemente diferenciados, así como para crear hueso integrado con vascularización entre injertos fusionados in vivo.

Abstract

La terapia convencional de regeneración ósea con células madre mesenquimales (MSC) es difícil de aplicar a defectos óseos más grandes que el tamaño crítico porque no tiene un mecanismo para inducir la angiogénesis. La implantación de tejido cartilaginoso artificial fabricado a partir de MSC induce la angiogénesis y la formación ósea in vivo a través de la osificación endocondral (ECO). Por lo tanto, este enfoque mediado por ECO puede ser una terapia de regeneración ósea prometedora en el futuro. Un aspecto importante de la aplicación clínica de este enfoque mediado por ECO es el establecimiento de un protocolo para preparar suficiente cartílago para ser implantado para reparar el defecto óseo. Especialmente no es práctico diseñar una sola masa de cartílago injertado de un tamaño que se ajuste a la forma del defecto óseo real. Por lo tanto, el cartílago a trasplantar debe tener la propiedad de formar hueso de forma integral cuando se implantan múltiples piezas. Los hidrogeles pueden ser una herramienta atractiva para ampliar los injertos de ingeniería tisular para la osificación endocondral con el fin de cumplir con los requisitos clínicos. Aunque muchos hidrogeles de origen natural apoyan la formación de cartílago MSC in vitro y ECO in vivo, aún no se ha determinado el material de andamio óptimo para satisfacer las necesidades de las aplicaciones clínicas. El ácido hialurónico (AH) es un componente crucial de la matriz extracelular del cartílago y es un polisacárido biodegradable y biocompatible. Aquí, demostramos que los hidrogeles de HA tienen excelentes propiedades para apoyar la diferenciación in vitro del tejido cartilaginoso basado en MSC y promover la formación de hueso endocondral in vivo.

Introduction

El hueso autólogo sigue siendo el estándar de oro para reparar defectos óseos debidos a traumatismos, defectos congénitos y resección quirúrgica. Sin embargo, el injerto óseo autógeno tiene limitaciones significativas, incluyendo dolor del donante, riesgo de infección y volumen óseo limitado que puede ser aislado de los pacientes 1,2,3,4. Se han desarrollado numerosos biomateriales como sustitutos óseos, combinando polímeros naturales o sintéticos con materiales mineralizados como el fosfato cálcico o la hidroxiapatit....

Protocol

Este protocolo utiliza ratones machos desnudos de 4 semanas de edad. Aloje cuatro ratones en una jaula bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h a 22−24 °C y 50%−70% de humedad relativa. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica y Dental de Tokio (ID de aprobación: A2019-204C, A2020-116A y A2021-121A).

1. Preparación de tampones y reactivos

1. Prepare el medio de crecimiento de células madre mesenquimales (medio de crecimiento MSC) añadiendo el kit de suplemento de medio de crecimiento MSC a....

Results

Los hidrogeles de AH encapsulados en MSC se cultivaron en medio condrogénico suplementado con TGFβ3, un inductor de la condrogénesis⁴¹ (paso 4.1). Comparamos las propiedades del AH con las del colágeno, que ha demostrado ser eficaz en la creación de injertos de cartílago artificial basados en MSC para la osificación endocondral, como se describió anteriormente³⁸. Las MSC indiferenciadas no se incluyeron como controles negativos en este estudio porque se ha demostrado que la.......

Discussion

El uso de materiales de andamiaje apropiados que promuevan la transición del cartílago hipertrófico al hueso es un enfoque prometedor para ampliar los injertos de cartílago hipertrófico diseñados basados en MSC y tratar defectos óseos de tamaño clínicamente significativo. Aquí, mostramos que el AH es un excelente material de andamiaje para apoyar la diferenciación del tejido cartilaginoso hipertrófico basado en MSC in vitro y para promover la formación de hueso endocondral in vivo³⁸

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solución	FUJIFILM Wako Pure Chemical	209-16941
Antisedan	Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbato-2-fosfato	Nacalai Tesque	13571-14
Bambanker	GC Lymphotec	CS-02-001
factor de crecimiento fibroblástico básico	Reprocell	RCHEOT002
albúmina sérica bovina	FUJIFILM Wako Pure Chemical	012-23881	7.5 w/v%
Countess Contador de células automatizado con portaobjetos de cámara de recuento de células y tinción de azul de tripán 0.4%	Invitrogen	C10283
dexametasona	Merck	D8893
Domitor	Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum	Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Merck	D6429	alto contenido de glucosa
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mix F-12 Ham	Merck	D6421
Suero fetal bovino	Hyclone	SH30396.03
Sulfato de gentamicina	FUJIFILM Wako Pure Chemical	1676045	10 mg/mL
Generador Haccpper	TechnoMax	CH-400-5QB	50 ppm agua ácida hipoclorosa
Células madre mesenquimales humanas	Lonza	PT-2501
HyStem Cell Kit de andamio de cultivo	Merck	HYS020
IL-1ß	PeproTech	AF-200-01B
ITS-G suplemento	FUJIFILM Wako Pure Chemical	090-06741	y tiempos; 100
L-Alanil-L-Glutamina	FUJIFILM Wako Pure Chemical	016-21841	200mmol/L (&veces; 100)
L-prolina	Nacalai Tesque	29001-42
L-tiroxina	Merck	T1775
MSCGM Medio de crecimiento de células madre mesenquimales BulletKit	Lonza	PT-3001
parafina	FUJIFILM Wako Pure Chemical	165-13375
PBS / pH7.4 100ml	Medicago	09-2051-100
TGF-β 3	Proteintech	HZ-1090
Vetorphale	Meiji Seika Kaisha
Visiocare Pomada	SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glicerofosfato	FUJIFILM Wako Pure Chemical	048-34332