Artículo de método

Formación ósea integrada a través de la osificación endocondral in vivo utilizando células madre mesenquimales

DOI:

10.3791/65573

⸱

14 de julio de 2023

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La terapia ósea a través de la osificación endocondral mediante la implantación de tejido cartilaginoso artificial producido a partir de células madre mesenquimales tiene el potencial de eludir los inconvenientes de las terapias convencionales. Los hidrogeles de ácido hialurónico son eficaces para escalar injertos de cartílago uniformemente diferenciados, así como para crear hueso integrado con vascularización entre injertos fusionados in vivo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La terapia convencional de regeneración ósea con células madre mesenquimales (MSC) es difícil de aplicar a defectos óseos más grandes que el tamaño crítico porque no tiene un mecanismo para inducir la angiogénesis. La implantación de tejido cartilaginoso artificial fabricado a partir de MSC induce la angiogénesis y la formación ósea in vivo a través de la osificación endocondral (ECO). Por lo tanto, este enfoque mediado por ECO puede ser una terapia de regeneración ósea prometedora en el futuro. Un aspecto importante de la aplicación clínica de este enfoque mediado por ECO es el establecimiento de un protocolo para preparar suficiente cartílago para ser implantado para reparar el defecto óseo. Especialmente no es práctico diseñar una sola masa de cartílago injertado de un tamaño que se ajuste a la forma del defecto óseo real. Por lo tanto, el cartílago a trasplantar debe tener la propiedad de formar hueso de forma integral cuando se implantan múltiples piezas. Los hidrogeles pueden ser una herramienta atractiva para ampliar los injertos de ingeniería tisular para la osificación endocondral con el fin de cumplir con los requisitos clínicos. Aunque muchos hidrogeles de origen natural apoyan la formación de cartílago MSC in vitro y ECO in vivo, aún no se ha determinado el material de andamio óptimo para satisfacer las necesidades de las aplicaciones clínicas. El ácido hialurónico (AH) es un componente crucial de la matriz extracelular del cartílago y es un polisacárido biodegradable y biocompatible. Aquí, demostramos que los hidrogeles de HA tienen excelentes propiedades para apoyar la diferenciación in vitro del tejido cartilaginoso basado en MSC y promover la formación de hueso endocondral in vivo.

Introducción

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El hueso autólogo sigue siendo el estándar de oro para reparar defectos óseos debidos a traumatismos, defectos congénitos y resección quirúrgica. Sin embargo, el injerto óseo autógeno tiene limitaciones significativas, incluyendo dolor del donante, riesgo de infección y volumen óseo limitado que puede ser aislado de los pacientes 1,2,3,4. Se han desarrollado numerosos biomateriales como sustitutos óseos, combinando polímeros naturales o sintéticos con materiales mineralizados como el fosfato cálcico o la hidroxiapatita 5,6. La formación ósea en estos materiales de ingeniería generalmente se logra utilizando el material mineralizado como material de cebado para permitir que las células madre se diferencien directamente en osteoblastos a través del proceso de osificación intramembrana (IMO)7. Este proceso carece de la etapa angiogénica, lo que resulta en una vascularización in vivo insuficiente del injerto después de la implantación 8,9,10 y, por lo tanto, los abordajes que utilizan dicho proceso pueden no ser óptimos para el tratamiento de grandes defectos óseos 11.

Se ha demostrado que las estrategias aplicadas para recapitular el proceso de osificación endocondral (ECO), un mecanismo innato en la esquelectogénesis durante el desarrollo, superan problemas significativos asociados con los enfoques tradicionales basados en OMI. En la ECO, los condrocitos de la plantilla del cartílago liberan el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), que promueve la infiltración vascular y la remodelación de la plantilla del cartílago en el hueso12. El enfoque mediado por ECO para la osteogénesis a través de la remodelación del cartílago y la angiogénesis, que también se activa durante la reparación de fracturas, utiliza tejido cartilaginoso creado artificialmente derivado de MSC como material de cebado. Los condrocitos pueden tolerar la hipoxia en defectos óseos, inducir angiogénesis y convertir un injerto de cartílago libre vascular en tejido angiogénico. Numerosos estudios han reportado que los injertos de cartílago basados en MSC generan hueso in vivo mediante la implementación de un programa ECO de este tipo 13,14,15,16,17,18,19,20,21.

Un requisito esencial para la aplicación clínica de este enfoque ecomediado es cómo preparar la cantidad deseada de injerto de cartílago en un entorno clínico. Preparar cartílago clínico de un tamaño que se ajuste al defecto óseo real no es práctico. Por lo tanto, el cartílago del injerto debe formar hueso integralmente cuando se implantan múltiples fragmentos22. Los hidrogeles pueden ser una herramienta atractiva para ampliar los injertos de ingeniería tisular para la osificación endocondral. Muchos hidrogeles de origen natural favorecen la formación de cartílago MSC in vitro y ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; sin embargo, aún no se ha determinado el material de soporte óptimo para cumplir con los requisitos de la aplicación clínica. El ácido hialurónico (AH) es un polisacárido biodegradable y biocompatible presente en la matriz extracelular del cartílago33. El AH interactúa con las MSC a través de receptores de superficie como CD44 para apoyar la diferenciación condrogénica 25,26,28,30,31,32,34. Además, los andamios de AH promueven la diferenciación osteogénica mediada por IMO de las células madre de la pulpa dental humana35, y los andamios combinados con colágeno promueven la osteogénesis mediada por ECO36,37.

En este trabajo se presenta un método para la preparación de hidrogeles de AH utilizando MSCs humanas adultas derivadas de la médula ósea y su uso para la condrogénesis hipertrófica in vitro y la posterior osificación endocondral in vivo38. Comparamos las características del AH con las del colágeno, un material ampliamente aplicado en la ingeniería de tejidos óseos con MSCs y un material útil para el escalado de injertos artificiales para la osificación endocondral17. En un modelo de ratón inmunodeprimido, se evaluó el potencial de ECO in vivo de las construcciones de AH y colágeno sembradas con MSC humanas mediante implantación subcutánea. Los resultados muestran que los hidrogeles de HA son excelentes como andamio para que las MSC creen injertos de cartílago artificial que permitan la formación de hueso a través de ECO.

El protocolo se divide en dos pasos. En primer lugar, se preparan construcciones de MSC humanas sembradas en hidrogel de hialuronano y se diferencian en cartílago hipertrófico in vitro. A continuación, las construcciones diferenciadas se implantan por vía subcutánea en un modelo desnudo para inducir la osificación endocondral in vivo (Figura 1).

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Protocolo

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Este protocolo utiliza ratones machos desnudos de 4 semanas de edad. Aloje cuatro ratones en una jaula bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h a 22−24 °C y 50%−70% de humedad relativa. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica y Dental de Tokio (ID de aprobación: A2019-204C, A2020-116A y A2021-121A).

1. Preparación de tampones y reactivos

  1. Prepare el medio de crecimiento de células madre mesenquimales (medio de crecimiento MSC) añadiendo el kit de suplemento de medio de crecimiento MSC al medio basal MSC y guárdelo a 4 °C.
  2. Prepare el medio Eagle Modificado de Dulbecco y el medio F12 de Ham (DMEM/F-12) añadiendo al medio un 10% de suero fetal bovino (FBS), 50 μg/ml de gentamicina, 200 μM de L-alanil-L-glutamina y 1 ng/ml de factor de crecimiento fibroblástico básico al medio y guárdelo a 4 °C.
  3. Prepare el medio condrogénico añadiendo un suplemento de ITS-G al 1%, albúmina sérica bovina al 0,12%, 50 μg/ml de gentamicina, 0,35 mM de L-prolina, 100 nM de dexametasona y 10 ng/ml de TGF-β3 al DMEM justo antes de su uso.
  4. Prepare el medio hipertrófico añadiendo 10 mM de β-glicerofosfato, albúmina sérica bovina al 0,12%, 10 nM de dexametasona, 200 μM de ascorbato-2-fosfato, 50 nM de L-tiroxina, 50 μg/ml de gentamicina y 50 pg/ml de IL-1β al DMEM justo antes de su uso.
  5. Rebozar una placa de cultivo de 24 pocillos con 200 μL de parafina derretida precalentada a 60 °C. Deje reposar a temperatura ambiente hasta que la parafina esté firme.

2. Expansión de las MSC humanas

NOTA: Antes de comenzar los experimentos, las MSC con un alto potencial de condrogénesis de MSC deben seleccionarse en microcultivos masivos como se describe en17.

  1. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, cultive MSC primarias derivadas de la médula ósea humana (pasaje 2) con medio de crecimiento MSC en una placa de 10 cm a una densidad de 5 x 103 células/cm2 a 37 °C en una incubadora de aire humidificado al 5% de CO2 y al 95%.
  2. Cambie el medio cada 2-3 días. Una vez que las células alcancen el 80%-90% de confluencia, aspire el medio de la placa de cultivo celular con una bomba de vacío, lave con 5 ml de PBS y luego aspire la solución con una bomba de vacío.
  3. Agregue 1 ml de solución de tripsina al 0,05 % / EDTA al 0,02 % a la placa. Incubar la placa durante 5-10 min a 37 °C.
  4. Agregue 1 ml de medio de crecimiento MSC para detener la reacción enzimática. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 ml.
  5. Combine la suspensión celular de otros platos en el tubo de 50 ml y manténgalo en hielo.
  6. Utilice el contador de células para contar las células mezclando 10 μl de la suspensión celular con 10 μl de tinción de azul de tripano al 0,4 %.
  7. Centrifugar la suspensión celular restante a 220 x g durante 3 min a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y agregue la solución de criopreservación a una concentración de 1.0 x 106 células por ml.
  8. Dispense 1 ml de la suspensión celular en cada criotubo y almacene a -80 °C durante 12 h antes de transferirlo a nitrógeno líquido. Las existencias congeladas resultantes (pasaje 3) se utilizan para este protocolo.
  9. Para los experimentos, siembre las MSC almacenadas en un plato de 10 cm a una densidad de 5 x 103 células/cm2. Cultivar células hasta que confluyan al 80%-90% (paso 4) en medio DMEM/F-12.

3. Preparación de hidrogeles encapsulados en MSC

  1. Tripsinar las células y preparar la suspensión celular como se describe en los pasos 2.3 a 2.6.
  2. Para hacer 10 construcciones (2,5 x 10 5 células por construcción), alícuota la suspensión celular que contiene 2,5 x 106 células en un microtubo de1,5 ml.
  3. Centrifugar la suspensión a 220 x g durante 3 min, eliminar el sobrenadante con una bomba de vacío y mantenerla en hielo.
  4. Lleve el ácido hialurónico (HA) modificado con tiol, el reticulante reactivo al tiol, el diacrilato de polietilenglicol y las botellas de agua desgasificada a temperatura ambiente.
  5. En condiciones estériles, agregue 1.0 ml de agua desgasificada a la botella que contiene HA (consulte las instrucciones del fabricante) con una jeringa con una aguja.
  6. El vórtice se calienta ocasionalmente a 37 °C hasta que la solución se vuelve clara, luego colóquelo en hielo. Los sólidos tardan menos de 30 minutos en disolverse por completo.
  7. En condiciones estériles, agregue 0,5 ml de agua desgasificada a la botella de reticulación con una jeringa con una aguja. Disolver invirtiendo varias veces, luego colocar sobre hielo.
  8. Añadir 120 μL de la solución de AH disuelta al gránulo de célula alícuota (2,5 x 106 células). Vuelva a suspender el gránulo celular pipeteando hacia adelante y hacia atrás.
  9. Agregue 30 μL de la solución reticulante disuelta al tubo que contiene el AH y las células (paso 3.8) y combine golpeando el tubo, y luego gire hacia abajo brevemente. Combine la solución de alta disponibilidad y la solución de reticulación en una proporción de 4:1.
  10. Dejar caer 15 μL de la solución combinada que contiene MSC (2,5 x 105 células) sobre la placa de 24 pocillos recubierta de parafina y dejar que se solidifique a 37 °C durante 30 min (Figura 2). Debido a la alta viscosidad, prepare al menos un 10% más de la mezcla de celda / hidrogel de lo necesario.
    NOTA: Las características del hidrogel han sido descritas anteriormente39.

4. Condiciones de diferenciación in vitro

  1. Agregue 0,5 mL de medio de diferenciación condrogénico a una construcción de hidrogeles de AH sembrados con MSC. Cambie el medio cada 2-3 días.
  2. Después de 3 semanas, cambie a un medio de diferenciación hipertrófico (0,5 ml por pocillo) y cultive los constructos durante 2 semanas más.

5. Implantación in vivo de MSCs

  1. Después de un total de 5 semanas de cultivo in vitro, implantar las construcciones por vía subcutánea en la espalda de ratones desnudos como se describió anteriormente38,40.
  2. Pesar ratones y administrar un anestésico combinado preparado con 0,75 mg/kg de peso corporal (p.v.) de medetomidina, 4,0 mg/kg de p.v. midazolam y 5,0 mg/kg de p.v. butorfanol mediante inyección intraperitoneal como se describe38.
  3. Confirmar la anestesia adecuada mediante la inmovilidad a los estímulos quirúrgicos y controlar la profundidad respiratoria mediante movimientos torácicos lentos y regulares y el suministro adecuado de oxígeno por el color de la mucosa rosada periódicamente durante la operación. Use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad durante la anestesia.
  4. Coloque el ratón sobre un paño quirúrgico estéril en posición prona, esterilice el sitio de la incisión con 50 ppm de agua ácida hipoclorosa (pH 5.0; HAW) y coloque un paño quirúrgico perforado sobre el ratón.
    NOTA: Esterilice todos los materiales quirúrgicos en un autoclave, gas de óxido de etileno o HAW. Los cirujanos deben lavarse los dedos y usar batas quirúrgicas y guantes.
  5. Haga dos incisiones en la piel de 5 mm de largo separadas por 2 cm en las áreas de los hombros y la cadera a lo largo de la línea central de la columna vertebral con unas tijeras.
  6. Inserte una espátula por vía subcutánea a través de la incisión para crear una bolsa subcutánea.
  7. Inserte dos o tres construcciones (~15 μL cada una, paso 5.1) en cada bolsillo con fórceps. Las construcciones de AH implantadas en el mismo bolsillo son propensas a la fusión con mucha frecuencia. Para evitar la fusión, inserte una construcción de AH en cada bolsillo.
  8. Cierre las incisiones con suturas de seda trenzada 4-0. Inyectar al ratón un antagonista de los anestésicos preparado con 0,75 mg/kg de p.v. de atipamezol como se describe38.
  9. Mientras los ratones se recuperan de la anestesia, colóquelos en jaulas de recuperación estériles que contengan ropa de cama estéril en el piso sin botellas de comida y agua y controle continuamente la temperatura corporal, el pulso y la respiración.
  10. No deje a los ratones desatendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Después de la recuperación completa, regrese a los animales a la sala de cría con los otros animales.
  11. Monitoree a los animales cada dos días durante el período de curación para detectar posibles complicaciones. Eutanasiar a los ratones por inhalación de dióxido de carbono con poco sufrimiento a las 4 y 8 semanas después de la implantación.
  12. Incidir la piel en los sitios injertados y retirar las construcciones implantadas con fórceps. Fijar los constructos en paraformaldehído al 4% durante 16 h y luego someterlos a análisis.

6. Análisis estadístico

  1. Reporte los datos cuantitativos como media ± desviación estándar (DE). Realizar análisis estadísticos utilizando software comercial.
  2. Utilice la prueba t de Student o ANOVA de un factor seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey para determinar diferencias significativas entre los grupos. P<0.05 y P<0.01 indican diferencias significativas entre dos grupos.

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Resultados

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Los hidrogeles de AH encapsulados en MSC se cultivaron en medio condrogénico suplementado con TGFβ3, un inductor de la condrogénesis41 (paso 4.1). Comparamos las propiedades del AH con las del colágeno, que ha demostrado ser eficaz en la creación de injertos de cartílago artificial basados en MSC para la osificación endocondral, como se describió anteriormente38. Las MSC indiferenciadas no se incluyeron como controles negativos en este estudio porque se ha demostrado que la...

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Discusión

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El uso de materiales de andamiaje apropiados que promuevan la transición del cartílago hipertrófico al hueso es un enfoque prometedor para ampliar los injertos de cartílago hipertrófico diseñados basados en MSC y tratar defectos óseos de tamaño clínicamente significativo. Aquí, mostramos que el AH es un excelente material de andamiaje para apoyar la diferenciación del tejido cartilaginoso hipertrófico basado en MSC in vitro y para promover la formación de hueso endocondral in vivo38

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Divulgaciones

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Los autores han declarado que no existen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

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Este trabajo contó con el apoyo de una subvención para la investigación científica (KAKENHI) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) (subvención nos. JP19K10259 y 22K10032 al MAI).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na SoluciónFUJIFILM Wako Pure Chemical 209-16941
AntisedanNippon Zenyaku Kogyo
ascorbato-2-fosfatoNacalai Tesque13571-14
BambankerGC LymphotecCS-02-001
factor de crecimiento fibroblástico básicoReprocellRCHEOT002 
albúmina sérica bovinaFUJIFILM Wako Pure Chemical 012-238817.5 w/v%
Countess Contador de células automatizado con portaobjetos de cámara de recuento de células y tinción de azul de tripán 0.4%InvitrogenC10283
dexametasonaMerckD8893
DomitorNippon Zenyaku Kogyo
DormicumAstellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle MediumMerckD6429alto contenido de glucosa
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mix F-12 HamMerckD6421
Suero fetal bovinoHycloneSH30396.03
Sulfato de gentamicinaFUJIFILM Wako Pure Chemical 1676045  10 mg/mL
Generador HaccpperTechnoMaxCH-400-5QB50 ppm agua ácida hipoclorosa
Células madre mesenquimales humanasLonzaPT-2501
HyStem Cell Kit de andamio de cultivoMerckHYS020
IL-1ßPeproTechAF-200-01B
ITS-G suplementoFUJIFILM Wako Pure Chemical 090-06741y tiempos; 100
L-Alanil-L-GlutaminaFUJIFILM Wako Pure Chemical 016-21841200mmol/L (&veces; 100)
L-prolinaNacalai Tesque29001-42
L-tiroxinaMerckT1775
MSCGM Medio de crecimiento de células madre mesenquimales
BulletKit		LonzaPT-3001
parafinaFUJIFILM Wako Pure Chemical 165-13375
PBS / pH7.4 100mlMedicago09-2051-100
TGF-β 3 ProteintechHZ-1090
VetorphaleMeiji Seika Kaisha
Visiocare PomadaSAVAVET/SAVA Healthcare
β-glicerofosfatoFUJIFILM Wako Pure Chemical 048-34332

Referencias

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