Aislamiento y purificación de vesículas extracelulares bacterianas a partir de heces humanas mediante centrifugación en gradiente de densidad

Summary

Este estudio describe un método para aislar y purificar vesículas extracelulares bacterianas (BEV) enriquecidas a partir de heces humanas mediante centrifugación en gradiente de densidad (DGC), identifica las características físicas de los BEV a partir de la morfología, el tamaño de partícula y la concentración, y discute las posibles aplicaciones del enfoque DGC en la investigación clínica y científica.

Abstract

Las vesículas extracelulares bacterianas (BEV) son nanovesículas derivadas de bacterias que desempeñan un papel activo en la comunicación bacteria-bacteria y bacteria-huésped, transfiriendo moléculas bioactivas como proteínas, lípidos y ácidos nucleicos heredados de la bacteria parental. Los BEV derivados de la microbiota intestinal tienen efectos en el tracto gastrointestinal y pueden llegar a órganos distantes, lo que tiene importantes implicaciones para la fisiología y la patología. Las investigaciones teóricas que exploran los tipos, las cantidades y las funciones de los BEV derivados de las heces humanas son cruciales para comprender la secreción y la función de los BEV de la microbiota intestinal. Estas investigaciones también requieren una mejora en la estrategia actual para aislar y purificar los BEV.

Este estudio optimizó el proceso de aislamiento y purificación de BEV mediante el establecimiento de dos modos de centrifugación en gradiente de densidad (DGC): Top-down y Bottom-up. La distribución enriquecida de los BEV se determinó en las fracciones 6 a 8 (F6-F8). La efectividad del enfoque se evaluó en función de la morfología de las partículas, el tamaño, la concentración y el contenido de proteínas. Se calcularon las tasas de recuperación de partículas y proteínas, y se analizó la presencia de marcadores específicos para comparar la recuperación y pureza de los dos modos de DGC. Los resultados indicaron que el modo de centrifugación de arriba hacia abajo tenía niveles de contaminación más bajos y lograba una tasa de recuperación y pureza similar a la del modo de abajo hacia arriba. Un tiempo de centrifugación de 7 h fue suficiente para alcanzar una concentración fecal de BEV de 10⁸/mg.

Además de las heces, este método podría aplicarse a otros tipos de fluidos corporales con la modificación adecuada de acuerdo con las diferencias en los componentes y la viscosidad. En conclusión, este protocolo detallado y fiable facilitaría el aislamiento y la purificación estandarizados de los BEV y, por lo tanto, sentaría las bases para el posterior análisis multiómico y experimentos funcionales.

Introduction

El intestino es ampliamente reconocido como el órgano que alberga las comunidades microbianas más abundantes en el cuerpo humano, con más del 90% de las bacterias involucradas en la colonización y multiplicación ^1,2. Numerosas pruebas han demostrado que la microbiota intestinal modula el microambiente intestinal y, al mismo tiempo, interactúa con la disfunción en órganos distantes, principalmente a través de una barrera intestinal alterada ^3,4. Cada vez hay más pruebas que indican una correlación entre el desequilibrio de la microbiota intestinal y la ....

Protocol

El Comité de Ética del Hospital de Nanfang, de la Universidad Médica del Sur, sancionó este estudio, que fue realizado con el consentimiento informado de los participantes. Todos los métodos empleados en este documento se adhirieron a las pautas operativas estándar proporcionadas por los Estándares Internacionales del Microbioma Humano (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Todos los procedimientos posteriores de manipulación de líquidos debían llevarse a cabo dentro de una cabina de bioseguridad o en un banco ultralimpio.

1. Recogida y alícuota de muestras fecales

1. Distribuya una muestra de heces, una bolsa....

Results

Determinar la distribución de las fracciones enriquecidas con BEV
Para determinar la distribución de las fracciones enriquecidas con vesículas extracelulares bacterianas (BEV), se estableció un control en blanco para medir los valores de absorbancia a DO 340 nm, y se calculó la densidad de cada fracción en función de las mediciones y las directrices de yodixanol (Paso 8.1). En la Tabla 2 se presentan los resultados de densidad, demostrando que las fracciones F4 a F9 exhibieron densida.......

Discussion

Las vesículas extracelulares bacterianas (BEV) son nanopartículas de bicapa lipídica secretadas por bacterias, portadoras de una gran cantidad de proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y otras moléculas bioactivas, que contribuyen a mediar los efectos funcionales de las bacterias²⁰. Se ha comprobado que los BEV derivados del intestino están implicados en el desarrollo de enfermedades, como la enfermedad inflamatoria intestinal, la enfermedad de Crohn y el cáncer colorrectal, y también afectan al met.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 % (p/v) de glutaraldehído (preparado a partir de una solución madre al 2,5 % en agua desionizada)	ACMEC	AP1126	Observación morfológica de BEV utilizando TEM en el paso 8.3.3
1 % (p/v) de metilcelulosa (preparada a partir de polvo original en agua desionizada)	Sigma-Aldrich	M7027	Observación morfológica de BEV utilizando TEM en el paso 8.3.6
1,5 % (p/v) de acetato de uranilo (preparado a partir de polvo original en agua desionizada)	Polysciences	21447-25	Observación morfológica de BEV utilizando TEM en el paso 8.3.5
1000 μ L, 200 μ L, 10 y mu; L Pipeta	KIRGEN	KG1313, KG1212, KG1011	Transfiera la solución
al 5 % (p/v) de solución de albúmina sérica bovina (preparada a partir del polvo original en tampón TBST)	Fdbio science	FD0030	Utilizado en Western blot para bloquear en el paso 8.5.6
5 y veces; tampón de carga	Fdbio science	FD006	Utilizado en Western blot y Coomassie brillante blue stain en el paso 8.5.1
75 % (v/v) de alcohol	LIRCON	LIRCON-500 mL	Desinfección
de superficies Placa de 96 pocillos	Rar	A8096	Medir los valores de absorbancia
Anticuerpo anti-Calnexina	Abcam	ab92573	Western blot (Anticuerpo primario)
Anticuerpo anti-CD63	Abcam	ab134045	Western blot (anticuerpo primario)
Anticuerpo anti-CD9	Abcam	ab236630	Western blot (Anticuerpo primario)
Anticuerpo antiflagelina	Sino Biological	40067-MM06	Western blot (anticuerpo primario)
Anticuerpo anti-Integrina beta 1	Abcam	ab30394	Western blotting (Anticuerpo primario)
Anticuerpo anti-LPS	Thermo Fisher	MA1-83152	Western blot (Anticuerpo primario)
Anticuerpo anti-LTA	Thermo Fisher	MA1-7402	Western blot (anticuerpo primario)
Anticuerpo anti-OmpA	CUSABIO	CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/	Western blot (anticuerpo primario)
Anti-sintenina anti-sintenina	Abcam	ab133267	Western blot (anticuerpo primario)
Anti-TSG101 anticuerpo	Abcam	ab125011	Western blot (anticuerpo primario)
Autoclave	ZEALWAY	GR110DP	Esterilización para suministros y medios utilizados en el experimento
Balance	Mettler Toledo	AL104	Equilibrar la muestra de tubo cargada con PBS Ensayo de
ácido bicinconínico	Fdbio ciencia	FD2001	Medir el contenido de proteínas de los BEV en el paso 8.2
	BioRender BioRender	https://app.biorender.com	Hacer el flujo de trabajo esquemático del aislamiento y la purificación de los BEV que se muestra en la Figura 1 Gabinete de
bioseguridad	Haier	HR1200- II B2	Realizar los procedimientos sobre el manejo de muestras de heces
Centrífuga 5810 R; Rotor F-34-6-38	Eppendorf	5805000092; 5804727002, adaptador: 5804774000	Preproceso para BEV (Paso 3)
Aparato de quimioluminiscencia	BIO-OI	OI600SE-MF	Utilizado en Western blot para la detección de señales en el Paso 8.5.12
Citación 5	BioTek	F01	Detector de microplacas para medir los valores de absorbancia (Paso 8.1) y fluorescencia (Figura 6)
Lipoproteína de baja densidad	ACMEC	AC12038	Definición de la distribución de los componentes interferentes
Equipo de electroforesis	Bio-rad	1658033	Utilizado en Western blot para la separación y transferencia de proteínas en los pasos 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5
Kit de quimioluminiscencia mejorada HRP	Fdbio science	FD8020	Se utiliza en Western blot para la detección de señales en el paso 8.5.12
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC8739	aislar BEV como control positivo. Protocolo: Disolver 25 g del polvo LB en 1 L de agua desionizada y autoclave. Transfiere el 800 μ L de Escherichia coli conservada en el medio. Cultivar a 37 ° C en el agitador de la incubadora. Luego centrifugar a 3, 000 & veces; g durante 20 min a 4 & grados; C, 12.000 y veces; g durante 30 min a 4 & grados; C, filtre el sobrenadante a través de 0.22 μ membrana m, y realizar una centrifugación a ultra velocidad a 160, 000 y veces; g durante 70 min a 4 °C. El pellet definido como BEV crudos de Escherichia coli se suspendió en 1,2 mL PBS (Paso 3, 4).
Tubos de halcón 50 mL	KIRGEN	KG2811	Preproceso para BEV (Paso 3)
Tampón de tinción de proteína Feto	Absci	ab.001.50	Tinción azul brillante de Coomassie en el paso 8.5.4
Papel de filtro	Biosharp	BS-TFP-070B	Observación morfológica de BEV utilizando TEM en el paso 8.3 (Secado de la solución)
Rejillas de cobre compatibles con Formvar/Carbono	Sigma-Aldrich	TEM-FCF200CU50	Observación morfológica de BEVs usando TEM en el paso 8.3
Polvo de HEPES	Meilunbio	MB6078	Preparación de tampones de iodixanol con diferentes concentraciones para centrifugación en gradiente de densidad
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Fdbio science	FDM007	Western blot (anticuerpo secundario)
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Fdbio ciencia	FDR007	Western blotting (anticuerpo secundario)
Agitador de incubadora	Qiangwen	DHZ-L	Cultivar Escherichia coli
Kimwipes&comercio; Toallitas para tareas delicadas	Kimtech Science	34155	Limpie la pared interna del tubo de ultracentrífuga en el paso 4.15
LB de caldo	Hopebio	HB0128	Cultivar Escherichia coli
Congelador de baja temperatura (-80 &° C)	Haier	DW-86L338J	Almacene las muestras
Metanol	Alalddin	M116118	Utilizado en Western blot para activar la membrana de PVDF en el Paso 8.5.5
Micro tubos 1.5 mL	KIRGEN	KG2211	Recuperar fracciones después de la centrifugación en gradiente
de densidad Micro tubos 2 mL	KIRGEN	KG2911	Recuperar fracciones después de la centrifugación en gradiente de densidad
Micro tubos 5 mL	BBI	F610888-0001	Recuperar fracciones después de la centrifugación en gradiente de densidad
Lector de microplacas	Thermo Fisher	Multiskan MK3	Mida el contenido de proteínas de los BEV en el paso 8.2
Filtro Millipore 0.22 μ m	Esterilización por filtración SLGP033RB miliporo Merck		; Material: polietersulfona, PES
NaCl	GHTECH	1.01307.040	Solución de centrifugación en gradiente de densidad
NaOH	GHTECH	1.01394.068	Solución de centrifugación en gradiente de densidad (ajuste de pH)
Optima™ XPN-100	Beckman Coulter	A94469	Ultracentrifugación para el aislamiento de BEV en los pasos 4, 7
OptiPrep™	Serumwerk Bernburg AG	1893	Solución madre de centrifugación en gradiente de densidad
Agitador orbital		Youning CS-100	Disolver las heces en el paso 2
Solución salina tamponada con fosfato	Procell	PB180327	Disolver las heces en el paso 2
Pipeta	Eppendorf	3120000267, 3120000259	Transfiera la solución
Pipeta pasteur de plástico	ABCbio	ABC217003-4	Eliminar el sobrenadante en el preprocesamiento en el paso 3.4
Membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF)	Millipore	ISEQ00010, IPVH00010	Utilizado en Western blot para la transferencia de proteínas en el paso 8.5.5
Gel de poliacrilamida prefabricado, 4– 20% 15 pocillos	ACE	F15420Gel	Utilizado en Western blot para la separación de proteínas en el paso 8.5.2, 8.5.3
Diluyente de anticuerpos primarios	Fdbio science	FD0040	Utilizado en western blot en el paso 8.5.8
Escalera de proteínas	Fdbio science	FD0672	Utilizado en Western blot y Coomassie brilliant blue stain en el paso 8.5
Solución rápida de transferencia de proteínas	UBIO	UW0500	Se utiliza en Western blot para la transferencia de proteínas en el paso 8.5.5
Rotor SW 32 Ti Rotor de cubeta oscilante Beckman	Coulter	369650	Ultracentrifugación para BEV Aislamiento en el paso 4, 7
Jeringa 20 mL, 50 mL	Jetway	ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL	Tampones de transferencia y eliminación de sobrenadante en
el preprocesamiento de polvo de TBS	Fdbio science	FD1021	Utilizado en Western blot en el Paso 8.5
Microscopio electrónico de transmisión (TEM)	Hitachi	H-7650	Observación morfológica de BEVs en el paso 8.3
Tween-20	Fdbio science	FD0020	Utilizado en western blot en el paso 8.5
Tubo de ultracentrífuga	Beckman	326823, 355642	Ultracentrifugación para el aislamiento de BEV en los pasos 4, 7
Banco ultralimpio	AIRTECH	SW-CJ-2FD	Realice los procedimientos sobre el manejo de líquidos
Baño de agua	Bluepard	CU600	Se utiliza para medir el contenido de proteínas de los BEV en el paso 8.2.5
ZetaView	Particle Metrix	S/N 21-734, software ZetaView (versión 8.05.14 SP7)	Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) para medir el tamaño de partícula y la concentración de los BEV en el paso 8.4