Producción y optimización de LTE, un sistema de expresión de proteínas libres de células derivadas de Leishmania tarentolae para la producción de proteínas recombinantes

Resumen

El extracto traslacional de Leishmania (LTE) es un sistema de expresión de proteínas eucariotas libres de células derivado del parásito unicelular, Leishmania tarentolae. Este protocolo optimizado hace que la fabricación de LTE sea sencilla y rentable. Es adecuado para diversas aplicaciones centradas en la expresión y el estudio multiparalelo de proteínas eucariotas complejas y sus interacciones.

Resumen

Este protocolo describe la producción y optimización de un Sistema de Expresión de Proteínas Libres de Células (CFPS) eucariotas derivado del flagelado unicelular Leishmania tarentolae, denominado Extracto Traslacional de Leishmania o LTE. Aunque este organismo evolucionó originalmente como un parásito de los geckos, se puede cultivar de manera fácil y económica en frascos o biorreactores. A diferencia de la Leishmania major, no es patógena para los seres humanos y no requiere precauciones especiales de laboratorio. Otra ventaja del uso de Leishmania para el CFPS es que la adición de un solo oligonucleótido antisentido al CFPS, dirigido a una secuencia líder de empalme conservada en el extremo 5' de todos los ARN codificantes de proteínas, puede suprimir la expresión de proteínas endógenas. Proporcionamos procedimientos para la disrupción celular y el procesamiento de lisados, que se han simplificado y mejorado en comparación con las versiones anteriores. Estos procedimientos comienzan con cultivos de matraces simples. Además, explicamos cómo introducir información genética utilizando vectores que contienen sitios de iniciación de traducción independientes de la especie (SITS) y cómo realizar una optimización sencilla de los lotes y un control de calidad para garantizar una calidad constante de la expresión de proteínas.

Introducción

En la década de 1960, los sistemas de expresión de proteínas libres de células desempeñaron un papel fundamental en el descubrimiento^{del código genético}. Sin embargo, los sistemas de expresión de proteínas libres de células procariotas, basados principalmente en E. coli, dominan actualmente tanto las aplicaciones de laboratorio como las comerciales. Si bien los sistemas basados en E. coli ofrecen ventajas como rentabilidad, escalabilidad y altos rendimientos de expresión, enfrentan desafíos cuando producen proteínas multidominio en sus formas activas y facilitan el ensamblaje de complejos proteicos ^2,3. En la actualidad, las formas comúnmente utilizadas de síntesis de proteínas eucariotas libres de células (CFPS) incluyen extracto de germen de trigo (WGE), lisado de reticulocitos de conejo (RRL) y lisado de células de insectos (ICL)^4,5,6. Este trabajo presenta un sistema alternativo sin células eucariotas, sencillo y escalable, basado en el parásito flagelado unicelular Leishmania tarentolae.

La Leishmania tarentolae puede cultivarse fácilmente en matraces utilizando medios rentables y también puede ampliarse en biorreactores para lograr una mayor densidad celular. La presencia de ARNm endógenos en el lisado celular, que de otro modo podrían competir con los mensajes introducidos, puede neutralizarse utilizando oligonucleótidos antisentido dirigidos a la secuencia líder de empalme de ARNm de Leishmania conservada⁷. A diferencia de su pariente cercano Leishmania major, que causa enfermedades humanas, L. tarentolae infecta al gecko moruno (Tarentolae mauritanica), por lo que es adecuado para el cultivo en ambientes de laboratorio PC2 sin necesidad de precauciones especiales. Anteriormente se ha utilizado como organismo transgénico para la expresión de proteínas in vivo⁸.

Para facilitar el cebado de plantillas en sistemas libres de células, se han diseñado secuencias universales basadas en estructuras poliméricas de ARN que mejoran la iniciación traduccional⁹. Estas secuencias de traducción independientes de la especie (SITS) son aplicables tanto a los sistemas libres de células procariotas como a los eucariotas y son adecuadas para introducir información genética en LTE. Si bien este protocolo no proporciona una explicación detallada de la construcción de vectores para la expresión de proteínas libres de células LTE, la optimización y el control de calidad requieren vectores adecuados que contengan fusiones de fluoróforos de las proteínas de interés deseadas aguas abajo del sitio SITS. Para ello, se han depositado vectores LTE apropiados en el repositorio de genes Addgene, como el vector pCellFree_G03, que codifica una fusión N-terminal de eGFP a la proteína deseada de interés utilizando sitios de clonación Gateway.

LTE ha demostrado su valor en una amplia gama de aplicaciones que requieren expresión de proteínas, incluido el análisis del autoensamblaje de proteínas^10,16, la producción de proteínas de membrana integral humana¹⁷, la investigación de candidatos a fármacos antivirales¹⁸, el desarrollo de enzimas biotecnológicamente útiles¹⁹, la creación de prototipos de biosensores de proteínas^20,21 y el estudio de productos biológicos a partir de anquilostomas²². LTE también ha sido fundamental en el mapeo de redes de interacción proteína-proteína en los campos de la virología y las estructuras celulares^21,32. Se ha evaluado el rendimiento de LTE de manera similar a otros sistemas eucariotas libres de células en la expresión de proteínas de longitud completa, monodispersas y no agregadas³³, al tiempo que ofrece una producción más rentable y escalable.

Este protocolo proporciona técnicas para cultivar y alterar el organismo huésped, preparar lisado y complementar una solución de alimentación (FS) para la expresión de proteínas de transcripción/traducción acopladas. Además, incluye un protocolo para optimizar los lotes de producción. En la versión inicial del sistema libre de células de Leishmania, se observó una variación no deseada de un lote a otro en los niveles de expresión, la fracción de proteínas de longitud completa y la presencia de agregados de proteínas, lo que llevó a la eliminación de los lotes³⁴. Posteriormente, se realizaron mejoras en el protocolo para abordar este problema²⁵. El protocolo actual se basa en estas mejoras, lo que permite optimizar los lotes individuales para la expresión y el tamaño máximos de la proteína. Esto se logra controlando de cerca la carga del disruptor celular (medida como densidad óptica a 600 nm; OD_{600 nm}) y normalizando la salida de lisado resultante utilizando absorbancia a 280 nm (Abs_{280 nm}). Además, incorpora un método para suplementar parcialmente el lisado con rNTP y magnesio durante la fabricación, con la posterior optimización de estos componentes de la solución alimenticia durante las expresiones de prueba. Aunque esta optimización se presenta como una opción en el protocolo, los autores la recomiendan encarecidamente.

Protocolo

Este protocolo incluye recetas detalladas de medios y pasos que implican cultivo, centrifugación, medición de la fluorescencia GFP mediante un lector de placas multimodo, medición de cultivo OD_{600 nm} y evaluación de lisado Abs_{280 nm}. También cubre la configuración y la obtención de imágenes de los geles de proteínas SDS-PAGE. Los materiales necesarios o sugeridos para este protocolo se enumeran en la hoja de cálculo Materiales. Es importante tener en cuenta que los recursos típicos de laboratorio, como los componentes de los medios, las centrífugas, los tubos, los espectrofotómetros y las configuraciones de electroforesis en gel, probablemente se puedan utilizar indistintamente, a menos que se especifique lo contrario. La Figura 1 proporciona un resumen del proceso de fabricación LTE.

Figura 1: Descripción general del protocolo de fabricación LTE. Esta caricatura proporciona un resumen conciso del protocolo de fabricación LTE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Crecimiento de los cultivos de Leishmania tarentolae

1. Prepare al menos 3 L de medio de crecimiento TBGG (Bactotriptona 12 g/L, Extracto de levadura 24 g/L, glicerol 8 mL/L, glucosa 1 g/L, KH₂PO₄ 2,3 g/L, K₂HPO₄ 2,5 g/L, ver Tabla de Materiales). Esterilice el medio utilizando un filtro de 0,22 μm al vacío o una configuración similar.
2. Almacene los medios a temperatura ambiente (RT), con las adiciones finales (hemina, antibióticos) añadidas justo antes de la inoculación con L. tarentolae. Se añade hemina (0,25% v/v en 50% trietanolamina) al 0,2% v/v, penicilina (10.000 unidades/mL) más estreptomicina (10.000 μg/mL) a 0,5% v/v.
   NOTA: El punto de partida de este protocolo es un cultivo mantenido de 2 x 10 mL de L . tarentolae de tipo silvestre. Los cultivos de mantenimiento se cultivan a 27 °C en matraces de cultivo de tejidos estándar de 50 mL con baja agitación (75 rpm). Estos cultivos de 10 mL se pueden mantener indefinidamente con diluciones de ~ 1/20 en estériles (TBGG + hemina, penicilina, estreptomicina) cada 2-3 días. Se recomienda una cabina de bioseguridad estándar en un laboratorio PC2; sin embargo, las contaminaciones bacterianas tienden a prevenirse con los antibióticos agregados, mientras que las contaminaciones fúngicas generalmente son superadas por L. tarentolae.
3. Durante dos días, amplíe los cultivos de mantenimiento de L. tarentolae a 200 mL (día 1) y luego a 2 L (día 2) mediante diluciones 1:10 con un volumen creciente de TBGG + hemina/antibióticos cada día. Realizar ambas diluciones en matraces de vidrio de 5 L esterilizados en autoclave (llenos hasta un máximo de 1 L). La segunda dilución debe ocurrir por la tarde entre las 3 y las 6 de la tarde, con la intención de comenzar la producción de lisado al día siguiente entre las 8 y las 11 de la mañana.
   NOTA: Este protocolo utiliza el volumen inicial mínimo para la producción de LTE (2 cultivos de 1 L). También es posible ampliar el cultivo hasta 10 L para la producción de LTE incorporando un paso de expansión adicional (por ejemplo, Día 1: 100 mL; Día 2: 1 L; Día 3: 10 L). Aunque este protocolo utiliza matraces deflectores (ver Tabla de Materiales) para cultivar L. tarentolae, opcionalmente, se pueden utilizar biorreactores convencionales diseñados para el crecimiento bacteriano con impulsores Rushton, siempre que la tasa de agitación se mantenga por debajo de 100 rpm. La mejora de la aireación y el control del pH en los biorreactores generalmente extienden el crecimiento de la fase logarítmica de los cultivos de L. tarentolae , lo que permite una cosecha más alta de_{600 nm} OD de 10 que se utilizará en el paso 1.4.
4. Registre el diámetro exterior de_{600 nm} del cultivo por triplicado mediante una dilución 1:10 en TBGG directamente en la cubeta del espectrofotómetro. Un rango de inicio adecuado para hacer lisado es OD_600nm = 4.0-8.0.
5. Proporcione tiempo de incubación adicional si OD_{600 nm} < 4.0. Un cultivo con DO_{de 600 nm} > 8 es utilizable y dará como resultado un mayor volumen de lisado de expresión libre de células, pero con menor calidad debido al inicio de la fase de crecimiento logarítmico tardío. Coloque los matraces de cultivo en hielo, a la espera de los pasos siguientes.
   NOTA: La medición precisa del diámetro exterior del cultivo final de_{600 nm} es fundamental, ya que se utiliza para calcular el volumen final de las células concentradas antes de la interrupción. Este cálculo sustituye a un método de pesaje de pellets utilizado en versiones anteriores de la fabricación de LTE para calibrar la concentración de células antes de la interrupción³⁴, con el fin de simplificar el protocolo. Asegúrese de diluir en TBGG para la medición de OD_{600 nm} , ya que de lo contrario, el choque osmótico cambia la forma de la celda, causando un error de medición. Mezcle con pipeta la dilución 1:10 para la medición de OD_{600 nm} (directamente en la cubeta) segundos antes de tomar la lectura espectrofotométrica, ya que las células de L. tarentolae se asientan rápidamente con una apariencia turbia distintiva. Si el volumen final del cultivo de expresión se considera aproximado, también se recomienda pesar los matraces en el momento de la cosecha (con la tara de los matraces vacíos adecuados) para obtener un volumen estimado mejor (a 1 g = 1 mL). El diámetro exterior máximo de_{600 nm} posible del crecimiento de L. tarentolas en matraces deflectores es de 15-20, aunque esto es inapropiado para la fabricación de lisado debido a que alcanza la fase estacionaria.

2. Concentración de cultivos de L. tarentolae

1. Las células de Leishmania deben lavarse y concentrarse aproximadamente 60 veces antes de la interrupción. Calcule el volumen objetivo para la concentración de celdas en función de OD_{600 nm} = 300 para el concentrado final. La ecuación es V = volumen de cosecha (mL) x (DO de cosecha_600nm/300). Por ejemplo, si se utiliza un cultivo de 2 L con un diámetro exterior de cosecha_{de 600} = 5, el volumen objetivo es de 33 mL.
   NOTA: El objetivo OD_600nm de 300 se puede modificar; La producción anterior de LTE ha utilizado valores en el rango de 150-350. Las concentraciones más altas de células que entran en disrupción tenderán a producir reacciones finales de expresión libre de células con mayores rendimientos de proteínas, pero con una mayor tendencia a que las proteínas vulnerables se agreguen. OD_600nm = 300 representa un objetivo predeterminado adecuado para la producción LTE.
2. Transfiera los cultivos cosechados a botellas centrífugas adecuadas y gírelas a 2500 x g durante 10 min a 4 °C. Decantar cuidadosamente el sobrenadante en los residuos de cultivo.
   NOTA: Es importante minimizar la pérdida de células en el sobrenadante desechado, ya que afecta el cálculo de la carga de interrupción. En los protocolos de producción de LTE anteriores, la concentración de células de L. tarentolae para la disrupción se calibraba girando el concentrado de células en un tubo de microcentrífuga de prueba y midiendo el peso de los pellets en comparación con el peso total³⁴. En cambio, este protocolo simplificado utiliza un objetivo teórico de_{DE 600 nm} para el concentrado, basado en el DE de cosecha medido de_{600 nm}, y supone una baja pérdida de células durante la concentración de células y el lavado.
3. Lavar el pellet de celda en tampón SEB (45 mM HEPES-KOH pH 7,6, 250 mM de sacarosa, 100 mM KOAc, 3 mM Mg(OAc)₂, mantenido en hielo) tres veces, cada vez centrifugando a 2500 x g durante 10 min a 4 °C. Para el primer lavado, vuelva a suspender cada 1 L de cultivo granulado en 100 mL de tampón SEB, luego combínelos en un solo matraz de centrífuga. Para el segundo lavado, use también 100 mL de SEB por cada 1 L del cultivo original.
   NOTA: Para la resuspensión final de pellets, agregue tampón SEB hasta el 50% del volumen de resuspensión objetivo final (paso 2.1). Esto permite que el concentrado agrupado se rellene cuidadosamente hasta exactamente el volumen objetivo final en el paso 2.4. Cada resuspensión debe ser lo más suave posible para evitar la lisis prematura de L. tarentolae, por ejemplo, girando suavemente el SEB añadido alrededor del pellet decantado o pipeteando el SEB sobre el pellet adherido a la pared del tubo de centrífuga. Puede ser más conveniente transferir los sobrenadantes a tubos de centrífuga más pequeños para el paso final.
4. Vierta el concentrado resuspendido en un cilindro volumétrico de vidrio lavado adecuado, luego rellene el volumen hasta el volumen objetivo (paso 2.1) con SEB frío adicional y mezcle suavemente.

3. Lisis del concentrado de L. tarentolae

1. Transfiera el concentrado celular al dispositivo de cavitación de nitrógeno (consulte la tabla de materiales) preenfriado a 4 ° C, presurícelo a 70 bares de nitrógeno e incube durante 45 minutos en hielo.
   NOTA: Si bien los disruptores de cavitación de nitrógeno no son elementos comunes de laboratorio, se recomiendan para la producción de LTE. Se han ensayado métodos alternativos como la congelación-descongelación celular y los disruptores de tipo prensa francesa; sin embargo, la actividad de expresión de proteínas fue <50% en comparación con el uso del método de cavitación de nitrógeno. El dispositivo de cavitación de nitrógeno debe limpiarse a fondo antes de su uso y entre pasadas, de forma similar a todos los recipientes reutilizados que entran en contacto con el lisado celular a partir de esta etapa (como el matraz receptor). Un régimen de limpieza adecuado consiste en lavar con detergentes de laboratorio seguido de un enjuague a fondo con agua desionizada.
2. Abra el respiradero del dispositivo de cavitación de nitrógeno y expulse el lisado resultante a un recipiente adecuadamente robusto, como un matraz receptor de vacío en hielo. Incline el matraz receptor para asegurarse de que todo el lisado resultante se asiente y pueda pipetearse en un tubo de centrífuga nuevo o en un recipiente similar.
   PRECAUCIÓN: Los disruptores de cavitación de nitrógeno se basan en la transición abrupta del concentrado celular de 70 bares de nitrógeno a la presión ambiente, lograda a través de un fuerte flujo de líquido primero y luego de nitrógeno a través de la válvula de salida del dispositivo. La ventilación debe realizarse con el equipo de protección personal (EPP) adecuado en una capucha de seguridad química. Existe el riesgo de romper el recipiente de destino y perder el lisado, por lo que utilizamos un receptor de vacío resistente en lugar de un matraz genérico. Si la válvula de salida del dispositivo es un tubo, evite colocar el tubo directamente dentro del receptor para evitar la acumulación excesiva de presión en el punto de ventilación.

4. Centrifugación del lisado celular

1. Transfiera el lisado a tubos de centrífuga con fuerza nominal g adecuada y centrifugar a 10.000 x g durante 15 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y colóquelo en tubos de centrífuga nuevos y similares.
2. Centrifugar el lisado a 30.000 x g durante 15 min a 4 °C y, a continuación, retirar el sobrenadante final a un tubo de centrífuga nuevo o a un recipiente similar colocado sobre hielo. Estimar el volumen total.

5. Filtración en gel de lisado celular

NOTA: La filtración en gel se utiliza para eliminar la sacarosa incluida en el tampón SEB. Si bien la sacarosa ayuda a estabilizar la maquinaria celular durante la disrupción celular, disminuye el rendimiento si se retiene en las reacciones de expresión de proteínas.

1. Instale un número suficiente de columnas de filtración de gel PD-10 alimentadas por gravedad (consulte la Tabla de materiales) en un formato de rejilla que les permita gotear en una bandeja de recolección o en un recipiente similar que se encuentre debajo, asegurando que puedan filtrar todo el volumen de lisado a 2,5 mL por columna. Preequilibrar las columnas pasando previamente 10 mL de tampón EB a 4 °C (45 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM KOAc, 3 mM Mg(OAc)₂) a través de ellas.
   NOTA: Todos los pasos a partir de este punto se benefician de ser realizados en una cámara frigorífica a 4 °C. Sin embargo, también es adecuado mantener todos los lisados y reactivos en una bandeja de hielo de sobremesa. Una excepción es la etapa de filtración de gel, en la que los autores colocan un estante de columnas dentro de un refrigerador a 4 °C mientras se vuelve a almacenar. En las versiones originales de este protocolo, las nuevas columnas de filtración de gel se "bloqueaban" almacenando inicialmente el lisado y descartando la primera salida. Aunque esto no se considera necesario, las columnas deben lavarse con tampón EB y almacenarse a 4 °C entre lotes de lisado. El primer lisado de salida puede tener una actividad de expresión de proteínas más baja que las salidas posteriores debido a cierta retención de fondo de los componentes del lisado en la nueva columna.
2. Agregue 2,5 mL de lisado a cada columna y espere hasta que pase a la columna. Agregue 0,5 mL adicionales de EB para asentar el lisado en la columna mientras se desecha el eluido.
3. Eluir el lisado filtrado en gel añadiendo 2,5 mL adicionales de EB a cada columna, recogiendo la salida colocando una bandeja fresca y limpia u otro receptáculo debajo de las columnas.

6. Suplementación con lisado celular

1. Utilice el espectrofotómetro de nanogotas (consulte la tabla de materiales) para medir Abs_{280 nm} del lisado filtrado en gel. Si supera los 60, diluirlo hasta alcanzar un Abs_{de 280 nm} = 60 utilizando un tampón EB adicional de 4 °C.
   NOTA: Si bien el control de la entrada de densidad celular en la interrupción con OD_{600 nm} determina aproximadamente la fuerza de salida del lisado, la normalización del Abs_{280 nm} después de la interrupción y el procesamiento del lisado mejora aún más la consistencia del lote del rendimiento del lisado. El lisado Abs de_{280 nm} se puede ajustar hacia arriba y hacia abajo, con consecuencias para el rendimiento y la agregación de la expresión de proteínas (consulte la sección de discusión). Si el lisado no suplementado indica un Abs_{de 280 nm} < 60, puede ser necesario incluir más biomasa de Leishmania en la etapa de interrupción, es decir, aumentar la carga del disruptor celular a_{DE 600 nm} > 300 en la etapa 2.1.
2. Agregue 5 veces la solución de alimentación (5 veces FS, Tabla 1) al lisado en una proporción de 2:5 y mezcle bien el vórtice. Coloque alícuotas en recipientes adecuados (por ejemplo, tubos de microfuga de 1,5 ml) y congélelo en nitrógeno líquido. Si se siguen los pasos opcionales 7.1-7.3 para la optimización de expresiones LTE que se indican a continuación, utilice el FS reducido rNTP.Mg 5x de la Tabla 1 en lugar del FS 5x predeterminado. Incluya 5 alícuotas de 100 μL para congelar para su uso en los experimentos de optimización.
   NOTA: La congelación con el FS predeterminado 5x en una proporción de 2:5 crea LTE suplementado listo para la expresión, utilizado a una expresión de 7 μL/10 μL (por lo tanto, el FS 5x se convierte en 1x FS en la reacción final). Sin embargo, los autores recomiendan seguir los pasos opcionales adicionales en los que se proporciona 0,6 veces la cantidad predeterminada de rNTP y magnesio en el FS 5x. A esto le sigue un paso de optimización en el que se añade una mezcla equimolar de los dos (denominada rNTP.Mg) para completar las reacciones de prueba a un valor optimizado. El FS parcial 5x también contiene un oligonucleótido que bloquea la expresión endógena del ARNm (ver sección de Introducción). La secuencia del oligonucleótido es CAATAAAGTACAGAAACTGATACTTATATAGCGTT.

7. Control de calidad y optimización de LTE final complementado

NOTA: Los pasos mínimos necesarios para determinar la adición "de recarga" adecuada de rNTP.Mg al rNTP reducido y al lisado suplementado con magnesio implican la expresión de eGFP o un fluoróforo similar (por ejemplo, sfGFP) sin un socio de fusión. Se añaden concentraciones crecientes de rNTP.Mg a las reacciones para determinar el punto en el que se optimiza el nivel de expresión (medido como RFU eGFP a través de un lector de placas multimodo). Las terminaciones prematuras de eGFP, que no son fluorescentes, se hacen evidentes al disminuir la RFU de eGFP a concentraciones de rNTP.Mg demasiado altas. Sin embargo, el mal funcionamiento de LTE de productos cortos ocurre con mayor frecuencia en proteínas expresadas más grandes (>50 kDa). Por lo tanto, es posible realizar esta optimización utilizando una plantilla más grande que eGFP, especialmente si hay una disponible en un vector de expresión adecuado, proporcionando una fusión de fluoróforos que se desea producir mediante LTE para una aplicación o estudio en particular (consulte la sección Resultados representativos).

1. Descongele una alícuota de 100 μL y configure seis reacciones de expresión de 10 μL, cada una compuesta por 7 μL de lisado parcialmente suplementado del paso 6.2, 1 μL de solución de recarga según la Tabla 2 y 2 μL de agua ultrapura que contenga suficiente plantilla de control de ADN para lograr una concentración final de 50 ng/μL en la reacción.
2. Incubar las reacciones durante 2 h a 25 °C y monitorizar el aumento de la fluorescencia de GFP mediante un lector de placas multimodo.
   NOTA: Los valores de configuración adecuados para GFP son excitación a 485 nm (ancho de banda de 5 nm), emisión a 516 nm (ancho de banda de 5 nm), con un intervalo de lectura de 1 min durante 2 h.
3. Clasifique los valores de expresión final para determinar la concentración de rNTP.Mg correspondiente a la RFU de eGFP más alta. Si se dispone de datos cinéticos, un exceso de rNTP.Mg también se indicará mediante un aumento bifásico de la RFU de eGFP durante el período de expresión de 2 h (véase la sección Resultados representativos).
4. Una vez que se determine la concentración de rNTP.Mg de recarga optimizada, agréguela a todas las expresiones de proteínas adicionales utilizando el lote de LTE que se suplementó parcialmente en los pasos anteriores.
   NOTA: Si la alícuota en el paso 6.2 se realiza con cuidado con volúmenes fijos, la recarga se puede agregar retrospectivamente a cada alícuota sin descongelar, por ejemplo, con las alícuotas colocadas en hielo seco. Estas alícuotas ahora se complementan por completo, ya que la recarga de rNTP.Mg correcta se mezclará a través de cada una de ellas cuando se descongelen y se mezclen para su uso.

Resultados

El propósito de la expresión de proteínas libres de células es producir proteínas de longitud completa en una forma activa plegada adecuada para una amplia gama de aplicaciones. El LTE (extracto de Leishmania tarentoleae ) se ha comparado previamente con otros sistemas de expresión libre de células procariotas y eucariotas, demostrando una alta capacidad para evitar el truncamiento y la agregación cuando funciona de manera óptima, particularmente en comparación con la expresión libre de células basada en E. coli ³³. Sin embargo, esto iba acompañado anteriormente de una variación significativa de la calidad de la producción de un lote a otro. El método actual incorpora mejoras adicionales para garantizar una calidad de salida constante, principalmente a través de la suplementación parcial de la solución de alimentación necesaria antes de la congelación inicial del LTE en alícuotas. A continuación, se optimiza el rNTP.Mg de entrada transcripcional en una solución de recarga que puede añadirse a cada reacción posterior o utilizarse para completar directamente las alícuotas congeladas. Cabe destacar que las reacciones de optimización también representan el uso típico de LTE para expresar proteínas de manera práctica, con reacciones realizadas a 25 °C durante 2 h.

Los datos de la optimización de la concentración de rNTP.Mg en reacciones libres de células proporcionan un conjunto de datos representativo. Los niveles de expresión suelen aumentar a medida que aumenta la entrada transcripcional (rNTP.Mg), lo que indica una expresión exitosa. Sin embargo, se alcanza un umbral en el que el sistema tiende a la expresión no productiva de productos truncados, particularmente en el caso de proteínas más grandes (>50 kDa). Esta expresión subóptima conduce a una pérdida de la señal de fluorescencia con el aumento de la rNTP.Mg, particularmente evidente con las fusiones de fluoróforos C-terminales, donde la traducción del polipéptido no llega al fluoróforo en sí. En el caso de las fusiones N-terminales, si bien no se produce necesariamente una reducción en las RFU (unidades de fluorescencia relativa) generales con un exceso de rNTP.Mg, la expresión fallida es visiblemente evidente en los geles SDS-PAGE como múltiples productos fluorescentes de tamaños decrecientes. Este enfoque aprovecha la capacidad de GFP (proteína fluorescente verde) para mantener la fluorescencia incluso cuando se visualiza en un gel SDS-PAGE convencional, siempre que las muestras no se calienten después de la mezcla. En su lugar, se mezclan con el tampón de carga de gel y se cargan directamente sobre el gel. Si bien los materiales y equipos de gel SDS-PAGE son generalmente intercambiables, el generador de imágenes en gel debe ser capaz de visualizar la fluorescencia de GFP. Una configuración típica para la visualización de GFP se proporciona con excitación a 485 nm (ancho de banda de 5 nm), emisión a 516 nm (ancho de banda de 5 nm) y un intervalo de lectura de 1 minuto durante 2 h.

Es posible optimizar el sistema utilizando solo la expresión de eGFP. La Figura 2A,B (recuadro) muestra los resultados de expresión típicos de las reacciones de optimización para dos lotes LTE, con RFU eGFP aumentando con el aumento de las concentraciones de rNTP.Mg, alcanzando un nivel óptimo de +0,6 veces rNTP.Mg (Figura 2A) y +0,3 veces rNTP.Mg (Figura 2B) para la RFU máxima. La solución de alimentación rNTP reducida incluye 0,6 veces rNTP.Mg, lo que da como resultado niveles de rNTP.Mg totales de 1,2 veces y 0,9 veces la cantidad predeterminada para estos lotes LTE. La Figura 2C ilustra la cinética del aumento de RFU durante la reacción para el lote LTE en la Figura 2B, demostrando una reacción bifásica con dos fases discretas a lo largo de la duración de la reacción.

Figura 2: Optimización de rNTP.Mg adición de recarga en LTE con rNTP 5x FS. (A) Niveles de expresión de eGFP después de 140 min de expresión de un plásmido de control a niveles de recarga de rNTP.Mg variables en la reacción de expresión libre de células (n = 3, media ± SD graficada). (B) Optimización de un lote de producción LTE diferente, que muestra una expresión reducida más allá de un cierto umbral de rNTP.Mg. (C) Cinética de acumulación de eGFP en las mismas reacciones que (B), con aumento de rNTP.Mg recarga. Estos datos también representan la cinética típica de la acumulación de proteínas en la expresión de lotes LTE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Sin embargo, hay que tener en cuenta que la eGFP, al ser una proteína pequeña (27 kDa) fácil de plegar, es probable que se exprese, pliegue y madure independientemente del sistema de expresión libre de células utilizado. El fallo del sistema es más probable cuando se expresan proteínas de interés más grandes, con productos truncados que se hacen más evidentes a tamaños de proteína de entrada superiores a 70 kDa³³. Por lo tanto, es superior optimizar el sistema con la(s) proteína(s) destinada(s) al uso real, con eGFP aún presente para la cuantificación, pero como una fusión N-terminal con la proteína de interés.

La Figura 3 representa una optimización típica del nivel de recarga de rNTP.Mg cuando se utiliza una plantilla de proteína más grande propensa a entregar productos truncados (eGFP-Sox18). Utilizando un formato SDS-PAGE de gel seminativo (es decir, sin muestras de calentamiento), es posible visualizar el fallo progresivo de la expresión. La adición óptima de rNTP.Mg a +0,1x (combinada con el rNTP.Mg de 0,6x en la solución de alimentación parcial, que totaliza 0,7x) reduce claramente la fracción de la banda de proteínas de longitud completa como parte de los productos de expresión fluorescente total, lo que significa una falla del sistema con un exceso de adición de rNTP.Mg.

Como se menciona en el protocolo, es posible omitir el paso de optimización del rNTP.Mg y agregar directamente la cantidad total de rNTP.Mg en la solución de alimentación "predeterminada" durante la suplementación inmediatamente después de la filtración en gel en el paso 6.2. Al hacer esto, el protocolo esencialmente vuelve a los métodos originales publicados para crear LTE³⁴. Sin embargo, los autores creen que adaptar el sistema para un rendimiento óptimo, como se demuestra en la Figura 3 (Carril D a Carril E), supera la complejidad adicional del protocolo y aumenta el valor de LTE como herramienta de expresión de proteínas.

Figura 3: Efecto del aumento de la recarga de rNTP.Mg en la expresión de eGFP-Sox18 en LTE parcialmente suplementado. Gel SDS-PAGE seminativo que representa el impacto del aumento de la recarga de rNTP.Mg en la expresión de eGFP-Sox18. Carril A: +0,1x (rNTP.Mg) de recarga, Carril B: +0,2x (rNTP.Mg), Carril C: +0,3x (rNTP.Mg), Carril D: +0,4x (rNTP.Mg). La fusión de eGFP N-terminal se visualiza mediante el escaneo de fluorescencia del gel. La banda principal en el carril A representa eGFP-Sox18 de longitud completa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Componente	Concentración de existencias	5x Solución de alimentación	μL de stock/mL 5x Solución de alimentación
		Predeterminado (rNTP reducido)	Predeterminado (rNTP reducido)
Espermidina	100 mM	1,25 mM	12
TDT	500 mM	10 mM	20
Fosfato de creatina	1000 mM	200 mM	200
HEPES-KOH pH7.6	2500 mM	100 mM	40
PEG3000	0,5 V/V	0,05 V/V	100
Cóctel de inhibidores de proteasa	120 veces	5 veces	43
Aminoácidos	3,6 mM (c/u)	0,68 mM (ea)	190
ATP	100 mM	8,5 (5,1) mM	85 (51)
GTP	100 mM	3,2 (1,9) mM	32 (19)
UTP	100 mM	2,5 (1,5) mM	25 (15)
Hoja de acción del cliente	100 mM	2,5 (1,5) mM	25 (15)
Mg(OAc)2	1M	16,7 (10) mM	16.7 (10)
Oligo líder anti-empalme	1 mM	0.05 mM	50
ARN polimerasa T7	5 mg/mL	0,5 mg/mL	100
Creatina Fosfoquinasa	5 unidades/μL	0,2 unidades/μL	42
Agua ultrapura			19 (93)

Tabla 1: Composición de 5x Solución de Alimentación (5x FS) para LTE. Se requiere 1 mL de 5x FS por cada 2,5 mL de lisado no suplementado después de la filtración en gel. La complementación con el FS 5x predeterminado crea un LTE listo para la expresión para su uso en reacciones de expresión en una proporción de 7 μL/10 μL. La receta de rNTP.Mg reducida (cantidades en cursiva) se recomienda para la optimización de la expresión LTE y contiene 0,6 veces los niveles predeterminados de rNTP y magnesio. Estos se pueden ajustar a niveles variables (de 0,6 a 1,1 veces) en el experimento de optimización posterior utilizando las adiciones descritas en la Tabla 2.

Recarga rNTP	ATP (100 mM)	GTP (100 mM)	UTP (100 mM)	CTP (100 mM)	MgOAc (1 M)	Agua ultrapura
(1 μL/10 μL rxn)	μL/200 μL	μL/200 μL	μL/200 μL	μL/200 μL	μL/200 μL
+0x	0	0	0	0	0	200
+0,1 veces	3.4	1.3	1	1	0.7	193
+0,2 veces	6.8	2.5	2	2	1.3	185
+0,3 veces	10.2	3.8	3	3	2	178
+0,4 veces	13.6	5.1	4	4	2.7	171
+0,5 veces	17	6.4	5	5	3.3	163

Tabla 2: Composición de (rNTP.Mg) soluciones de recarga para la optimización de LTE. Estas soluciones se utilizan para optimizar el LTE mediante la adición de 1 μL de solución de reposición por cada 10 μL de reacción de expresión de proteínas. Una vez que se determina un nivel de recarga en el experimento de optimización, se puede agregar de manera consistente a todas las reacciones de expresión de proteínas posteriores utilizando las mismas alícuotas de lote LTE. Alternativamente, se puede añadir directamente a las propias alícuotas a una adición de 1 μL por cada 7 μL (sin descongelar). Después de la descongelación y la mezcla, estos lisados se utilizan a 8 μL LTE por cada 10 μL de expresión de proteína, manteniendo el nivel de recarga rNTP.Mg establecido durante la optimización.

Discusión

Los protocolos para la creación de LTE se han publicado en la última década⁷ y han sido objeto de actualizaciones periódicas^25,34. Sin embargo, los recién llegados a la técnica a menudo se encuentran con una curva de aprendizaje empinada, lo que resulta en retrasos para lograr la expresión de proteínas de alta calidad y alto rendimiento. Otros grupos de investigación que trabajan con LTE³⁵ han reportado desafíos similares, particularmente en lo que respecta a variaciones significativas de lote a lote. El formato de protocolo basado en vídeo puede proporcionar potencialmente conocimientos de configuración adicionales y menos obvios que beneficien a los posibles usuarios³⁴. Se han introducido modificaciones en el protocolo, con el objetivo de aumentar la probabilidad de éxito, simplificar el procedimiento, reducir el tiempo y minimizar los errores relacionados con la complejidad.

En la disrupción celular, es crucial un control preciso sobre las células de carga en el disruptor celular de cavitación de nitrógeno³⁴. Lograr esto puede ser un desafío debido a la alta densidad celular después de la concentración celular y el lavado. En los protocolos originales, se utilizaron varios métodos, como el centrifugado de un pequeño volumen del cultivo concentrado final y la cuantificación de la célula fraccionada. Sin embargo, en este protocolo, se adopta un enfoque más simple. Se miden el volumen de cosecha del cultivo y el diámetro exterior de_{600 nm} , y estas mediciones se utilizan para calcular un volumen objetivo para el concentrado de células en mililitros, con el objetivo de un diámetro exterior final deseado de_{600 nm} de 300. Este cálculo supone que no se produce una pérdida celular significativa durante el lavado. Si hay sospecha de pérdida de células, se emplea un método alternativo que implica diluciones en serie triplicadas de 1/10 de las células concentradas después del lavado, lo que finalmente resulta en una dilución de 1/1000. Esto permite medir el diámetro exterior real del concentrado de_{600 nm}, asegurándose de que alcance el diámetro exterior objetivo de_{600 nm} = 300 antes de cargarlo en el disruptor.

Incluso con un control cuidadoso de la carga de disruptores celulares, puede ocurrir una variabilidad significativa en el contenido de proteínas del lisado posterior a la interrupción, como lo indica el Abs_280nm del lisado no suplementado filtrado en gel³⁴. Por lo tanto, se introduce una medición de Abs_{280 nm} antes de la suplementación con lisado, y el lisado se diluye para lograr un Abs_{280 nm} = 60. Dado que las reacciones de expresión de proteínas finalmente incluyen lisado de 0,5 v/v, esto da como resultado un lisado de reacción estandarizado con Abs_280nm = 30. El rendimiento del lisado configurado con un rendimiento inferior a_{Abs 280 nm} = 30 tiende a producir reacciones de larga duración y baja expresión, mientras que los valores superiores a_{Abs 280 nm} = 30 tienden a producir una mayor expresión pero una mayor tendencia a la agregación de proteínas de salida.

La optimización del rendimiento del lisado implica el ajuste de las entradas transcripcionales en la solución de alimentación que complementa el lisado, específicamente rNTP y magnesio, en los pasos de reacción opcionales 7.0-7.3. Es importante tener en cuenta que las rNTP y el magnesio tienen funciones complejas y múltiples en un sistema acoplado de transcripción-traducción como LTE²⁵. Sin embargo, se ha demostrado que LTE tiene una expresión aproximada de magnesio óptima a rNTP (mM) + 1,5. Dado que el propio lisado aporta 1,5 mM Mg a la mezcla de reacción final, esto proporciona una forma sencilla de variar y optimizar la entrada de rNTP sin cooptimizar el Mg variando el rNTP.Mg equimolar.

El rendimiento del lisado exhibe una variación significativa al aumentar rNTP.Mg, con la expresión de proteínas generalmente aumentando hasta un umbral en el que la optimización se invierte, lo que resulta en un mal funcionamiento de la expresión en forma de productos cortos en lugar de proteínas de longitud completa²⁵. Por lo tanto, la optimización final del sistema para identificar este umbral es beneficiosa. El protocolo LTE original empleaba una receta de solución de alimentación fija, con alguna optimización de Mg sugerida³⁴. Este enfoque se modificó posteriormente con una optimización más extensa de rNTP. Sin embargo, este método requirió la congelación instantánea del lisado en forma no suplementada para permitir la optimización en una alícuota, lo que tendió a disminuir los niveles de expresión de lisado eventuales. Esta reducción se atribuyó a la pérdida de las propiedades crioprotectoras de la solución de alimentación al congelar rápidamente el lisado no suplementado inmediatamente después de la etapa de filtración en gel. El protocolo actual logra un equilibrio al complementar con una solución de alimentación que contiene rNTP.Mg reducido antes de la congelación, que se puede rellenar hasta el nivel optimizado en el punto de expresión.

Se espera que estas mejoras en el protocolo aumenten la utilidad del sistema LTE para los usuarios novatos al mitigar las principales fuentes de variación y mejorar la consistencia de la producción de expresión de proteínas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
PD-10 SuperDex 25 columnas	Cytiva	17085101	Columnas de filtración de gel
Disruptor celular de cavitación de nitrógeno Disruptor celular	Industries	4635 o 4639	Disruptor celular
derivado de bovinos Hemin	Sigma-Aldrich	H5533	Aditivo de cultivo
Penicilina/Estreptomicina 10000U/ml	Thermo-Fisher	15140122	Mezcla
de antibióticosOptiplate 384	Perkin-Elmer	6007290	Placa multipocillo para expresiones de 10ul
Síntesis			IDT  Oligo con secuencia CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT
Creatina Fosfoquinasa	Sigma-Aldrich	9001-15-4	Enzyme
Tecan	Tecan		o similar Lector de placas multimodo
Chemidoc MP Imager	Biorad		o similar SDS-PAGE gel Imager
4-12% Bis-Tris Geles	Invitrogen	NW04125	SDS-PAGE
Biofotómetro	Eppendorf		o similar Cuvette Specrofotómetro
Nanodrop One	Thermofisher		Espectrofotómetro Nanodrop
Avanti Centrífuga JXN-26 Centrífuga	Beckman Coulter		o similar, con rotores/tubos de 10K y 50K g
Microcentrífuga 5424R Microcentrífuga	Eppendorf		o similar, con tubos de microcentrífuga de
1,5 mlIncubadora de matraces Inova S44i	Eppendorf		o similar Agitador de incubadora de matraces adecuado para matraces de 5L Matraces
cultivo de vidrio			Matraces de vidrio deflectores para el crecimiento del cultivo
Bactotriptona	BD	211705	Medio
de crecimiento Extracto de levadura	Merck	VM930053	Medio
de crecimiento Glicerol			Cualquier grado analítico
Glucosa			Cualquier grado analítico
KH2PO4			Cualquier grado analítico
K2HPO4			Cualquier grado analítico
UltraPure	water Invitrogen	10977-015	O salida de cualquier dispensador de agua tipo MilliQ