Método de inmovilización vertical para el análisis de microscopía time-lapse en cianobacterias filamentosas

Summary

Presentamos un método simple y accesible para la visualización de cianobacterias filamentosas en el plano XY. Se utilizó una matriz de agarosa de bajo punto de fusión, que permite la adquisición de imágenes de proteínas implicadas en la división, en orientación vertical. Por lo tanto, esta metodología se puede aplicar a cualquier organismo filamentoso y diferentes tipos de proteínas.

Abstract

Un evento principal en la división celular bacteriana es el proceso de septación, donde la proteína FtsZ es el elemento clave. FtsZ polimeriza formando una estructura en forma de anillo (anillo Z) en el centro de la célula que sirve como andamio para otras proteínas de división. La microscopía de súper resolución en modelos bacterianos Escherichia coli y Bacillus subtilis mostró que el anillo Z es discontinuo, mientras que los estudios de imágenes de células vivas demostraron que FtsZ se mueve a lo largo del anillo por un mecanismo conocido como cinta rodante. Para estudiar la dinámica de FtsZ in vivo, es necesaria una colocación especial de la celda en posición vertical para obtener imágenes de la estructura completa del anillo en el plano XY. En el caso de las imágenes de FtsZ en cianobacterias multicelulares, como Anabaena sp. PCC7120, mantener los filamentos en posición vertical es un desafío debido al tamaño de las células y la longitud de los filamentos. En este artículo, describimos un método que permite la inmovilización vertical de filamentos PCC 7120 de Anabaena sp. utilizando agarosa y jeringas de bajo punto de fusión, para registrar el anillo Z en un mutante que expresa una proteína de fusión FtsZ-sfGFP. Este método es una forma rápida y económica de registrar la dinámica de proteínas en el sitio de división utilizando microscopía confocal.

Introduction

La división celular bacteriana es el proceso en el que una célula madre genera dos células hijas, en la mayoría de los casos por el mecanismo conocido como fisión binaria. Uno de los primeros eventos en el proceso de septación es la localización de FtsZ en el centro de la celda¹. Esta proteína, que es estructuralmente homóloga a la tubulina², se conserva y distribuye ampliamente en la mayoría de las bacterias, y su polimerización genera una estructura contráctil conocida como anillo Z³. Este anillo sirve como andamio para otras proteínas de división y juntas forman una maquinaria molecular llamada divisoma. Varios estudios han demostrado que el anillo Z es altamente dinámico y que los protofilamentos FtsZ se mueven por cinta de correr ^4,5,6. Para estudiar el anillo Z en experimentos de lapso de tiempo, es aconsejable registrar el sitio de división en el plano XY para una mejor resolución y un muestreo rápido. Para lograr esto, es necesario desarrollar métodos de inmovilización celular vertical que comúnmente incluyen la nanofabricación de trampas celulares de microagujeros y dispositivos microfluídicos complejos⁷.

Las cianobacterias son microorganismos fotosintéticos que se clasifican como gramnegativos por su morfología celular. Sin embargo, filogenéticamente están más cerca de las bacterias grampositivas⁸. Estos organismos tienen genes de división celular que son comunes dentro de las bacterias grampositivas y gramnegativas, pero su divisoma también contiene elementos únicos⁹. PCC 7120 (en adelante Anabaena sp.) es cianobacteria filamentosa con un plano de división y es un modelo para el estudio de la división celular en cianobacterias multicelulares. En esta cepa, ha sido posible determinar el posicionamiento de FtsZ en el centro de las células¹⁰. Sin embargo, no hay estudios que muestren la dinámica in vivo de FtsZ en este modelo. En nuestro laboratorio, mediante apareamiento triparental y recombinación homóloga, obtuvimos un mutante totalmente segregado de Anabaena sp. que expresa la proteína FtsZ fusionada con sfGFP, que sustituyó al gen ftsZ endógeno completo. Desarrollamos un método de inmovilización celular rápido y sencillo que favorece la orientación vertical de los filamentos de cepa mutantes para experimentos time-lapse para visualizar las proteínas de división en cianobacterias filamentosas. Este método no necesita dispositivos microfluídicos que pueden ser costosos y difíciles de desarrollar. Como ejemplo, utilizamos este protocolo para visualizar el anillo Z en el mutante FtsZ-sfGFP mediante microscopía confocal.

Protocol

1. Consideraciones y selección del modelo celular

NOTA: Las cianobacterias tienen una fuerte autofluorescencia debido a la presencia de pigmentos fotosintéticos. Esta señal se encuentra en la parte roja del espectro, por lo tanto, las proteínas fluorescentes adecuadas para la obtención de imágenes en cianobacterias son las que están lejos de la emisión roja. Por ejemplo, GFP, YFP, Venus, Turquesa y BFP.

1. Seleccione un componente divisoma presente en la cepa de cianobacterias filamentosas objetivo. Para los experimentos, es necesario construir un mutante cianobacteriano filamentoso que exprese el componente divisoma seleccionado fusionado a una proteína fluorescente. En este protocolo, un mutante Anabaena sp. que expresa FstZ-sfGFP, como ejemplo. Esta cepa se obtuvo por apareamiento triparental con E. coli¹¹.
2. Compruebe el nivel de segregación del mutante que se utilizará. En el ejemplo, la segregación se determinó mediante la amplificación por PCR del gen diana. El mutante FtsZ-sfGFP utilizado en este protocolo es una cepa totalmente segregada que carece del gen ftsZ de tipo salvaje.

2. Condiciones de crecimiento

1. Hacer un nuevo subcultivo del mutante utilizando 10 mL de cultivo en fase estacionaria (cultivado durante aproximadamente 14 días a luz constante, a 25°C, para Anabaena sp.) y añadiendo a 90 mL de medio BG11 suplementado con antibióticos (Espectinomicina y Estreptomicina 10 μl ml-1 para el mutante FtsZ-sfGFP).
2. Cultivar el nuevo cultivo celular en luz constante y a la temperatura óptima hasta alcanzar la fase exponencial. El mutante FtsZ-sfGFP de Anabaena sp. se cultiva a 25 °C durante 7 días antes de la preparación de la muestra.

3. Preparación de muestras en matriz de agarosa

1. Tomar 2 mL del cultivo de crecimiento homogeneizado.
2. Centrifugar a 2.500 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
3. Mientras tanto, en un matraz de 50 ml, calentar 30 ml de agarosa de bajo punto de fusión al 3% en medio líquido BG11. Use un microondas ajustado al nivel de potencia medio y verifique la solución cada 15 s hasta que se disuelva por completo. Dejar enfriar a 37 °C.
   NOTA: Autoclave la solución de agarosa para evitar la contaminación.
4. Una vez realizada la centrifugación, deseche 1,9 ml del sobrenadante y resuspenda las células en el volumen restante pipeteando al menos tres veces hacia arriba y hacia abajo.
5. Mezclar las células resuspendidas con 900 μL de la solución de agarosa al 3% pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos tres veces.
   NOTA: La solución de agarosa debe ser líquida pero no demasiado caliente para evitar daños celulares. El siguiente paso debe realizarse rápidamente y antes de que la solución de agarosa forme una consistencia similar a un gel =.
6. Aspire cuidadosamente la matriz de agarosa en una jeringa de 1 ml. Es importante evitar la generación de burbujas mientras se aspira la muestra con la jeringa.
   NOTA: Antes de este paso, asegúrese de cortar la punta de la jeringa para eliminar el orificio de entrada estrecho.
7. Deje que la mezcla de muestra y agarosa se solidifique colocando la jeringa en posición horizontal a temperatura ambiente durante 2 h.
8. Retire la matriz de agarosa con cuidado con el émbolo y colóquela sobre una superficie limpia y plana.
9. Corte la muestra solidificada en rodajas, en un rango de espesor de 0,5 - 1 mm, manteniendo la integridad de la matriz.
   NOTA: Para obtener mejores resultados, corte la matriz de agarosa con un bisturí o cuchillas de afeitar delgadas.
10. Coloque las rodajas una al lado de la otra en un cubreobjetos. El número de discos en un cubreobjetos dependerá de sus dimensiones.
    NOTA: Para la microscopía de lapso de tiempo, se recomienda utilizar una cámara celular hecha para el análisis de microscopía (por ejemplo, cámaras magnéticas Attofluor o Chamlide). Estas cámaras permiten la adquisición de la muestra evitando la deshidratación. En este ejemplo, las muestras se preparan en cubreobjetos redondeados (25 mm) utilizando la cámara de Attofluor.
11. Agregue 2 ml de solución de agarosa derretida al 3% en la muestra colocada en la cámara para prevenir la deshidratación.
12. Espere hasta que la solución de agarosa esté completamente solidificada para formar un gel.

4. Adquisición de imágenes

1. Estandarizar los parámetros para visualizar la proteína fluorescente de interés en la cepa mutante en un microscopio confocal. Asegúrese de que el microscopio pueda detectar tanto la autofluorescencia como el marcador fluorescente seleccionado.
2. Visualice la muestra en la conformación de campo brillante con el máximo aumento y busque un filamento orientado verticalmente como se muestra en la Figura 1.
3. Encuentre el sitio de división de interés con un escaneo inicial utilizando la señal de autofluorescencia a lo largo del plano Z.
4. Utilice los parámetros del marcador de proteína fluorescente para visualizar la señal de la proteína de interés en el sitio de división.
5. Realizar experimentos time-lapse según el modelo biológico y la proteína de interés. Por ejemplo, en este caso se realizaron experimentos de lapso de tiempo de 10 s en 50 s para registrar la dinámica de FtsZ a lo largo del anillo Z en Anabaena sp. (Figura 2).

Results

Visualización del anillo Z en Anabaena sp. utilizando el método de inmovilización vertical
Para estudiar la dinámica de los componentes del anillo Z en bacterias, es necesario adquirir imágenes en células orientadas verticalmente. En esta posición, es posible visualizar el anillo Z y las principales proteínas del divisoma para monitorear la dinámica de las proteínas mediante microscopía de lapso de tiempo. La preparación clásica de muestras para bacterias no funciona para cianobacterias filam...

Discussion

El estudio de la dinámica de las proteínas divisómicas es sin duda un desafío. Particularmente, en las cianobacterias filamentosas, uno de los desafíos es la visualización del anillo Z en el plano horizontal, para lo cual las células deben estar orientadas verticalmente. El método que describimos aquí permite el posicionamiento del anillo Z en el plano XY para realizar los diferentes análisis. Este es el primer método simple para cianobacterias filamentosas que permite la visualización completa del anillo Z.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Jeringa de 1 ml	Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.	-	La jeringa de plástico médico desechable con aguja de 1 ml generalmente se usa para bombear líquido o líquido de inyección, en este experimento se usa para succionar la muestra y hacerla polimerizar.
Cámara de células Attofluor	ThermoFischer Scientific	A7816	La cámara de células Attofluor es un soporte de cubreobjetos duradero y práctico diseñado para ver muestras de células vivas en microscopios verticales o invertidos.
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Agarosa de bajo punto de fusión	Promega	V3841	La agarosa, de bajo punto de fusión, grado analítico, es ideal para aplicaciones que requieren la recuperación de fragmentos de ADN intactos después de la electroforesis en gel.
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