Método de inmovilización vertical para el análisis de microscopía time-lapse en cianobacterias filamentosas

Resumen

Presentamos un método simple y accesible para la visualización de cianobacterias filamentosas en el plano XY. Se utilizó una matriz de agarosa de bajo punto de fusión, que permite la adquisición de imágenes de proteínas implicadas en la división, en orientación vertical. Por lo tanto, esta metodología se puede aplicar a cualquier organismo filamentoso y diferentes tipos de proteínas.

Resumen

Un evento principal en la división celular bacteriana es el proceso de septación, donde la proteína FtsZ es el elemento clave. FtsZ polimeriza formando una estructura en forma de anillo (anillo Z) en el centro de la célula que sirve como andamio para otras proteínas de división. La microscopía de súper resolución en modelos bacterianos Escherichia coli y Bacillus subtilis mostró que el anillo Z es discontinuo, mientras que los estudios de imágenes de células vivas demostraron que FtsZ se mueve a lo largo del anillo por un mecanismo conocido como cinta rodante. Para estudiar la dinámica de FtsZ in vivo, es necesaria una colocación especial de la celda en posición vertical para obtener imágenes de la estructura completa del anillo en el plano XY. En el caso de las imágenes de FtsZ en cianobacterias multicelulares, como Anabaena sp. PCC7120, mantener los filamentos en posición vertical es un desafío debido al tamaño de las células y la longitud de los filamentos. En este artículo, describimos un método que permite la inmovilización vertical de filamentos PCC 7120 de Anabaena sp. utilizando agarosa y jeringas de bajo punto de fusión, para registrar el anillo Z en un mutante que expresa una proteína de fusión FtsZ-sfGFP. Este método es una forma rápida y económica de registrar la dinámica de proteínas en el sitio de división utilizando microscopía confocal.

Introducción

La división celular bacteriana es el proceso en el que una célula madre genera dos células hijas, en la mayoría de los casos por el mecanismo conocido como fisión binaria. Uno de los primeros eventos en el proceso de septación es la localización de FtsZ en el centro de la celda¹. Esta proteína, que es estructuralmente homóloga a la tubulina², se conserva y distribuye ampliamente en la mayoría de las bacterias, y su polimerización genera una estructura contráctil conocida como anillo Z³. Este anillo sirve como andamio para otras proteínas de división y juntas forman una maquinaria molecular llamada....

Protocolo

1. Consideraciones y selección del modelo celular

NOTA: Las cianobacterias tienen una fuerte autofluorescencia debido a la presencia de pigmentos fotosintéticos. Esta señal se encuentra en la parte roja del espectro, por lo tanto, las proteínas fluorescentes adecuadas para la obtención de imágenes en cianobacterias son las que están lejos de la emisión roja. Por ejemplo, GFP, YFP, Venus, Turquesa y BFP.

1. Seleccione un componente divisoma presente en la cepa de cianobacterias filamentosas objetivo. Para los experimentos, es necesario construir un mutante cianobacteriano filamentoso que exprese el componente divisoma....

Resultados

Visualización del anillo Z en Anabaena sp. utilizando el método de inmovilización vertical
Para estudiar la dinámica de los componentes del anillo Z en bacterias, es necesario adquirir imágenes en células orientadas verticalmente. En esta posición, es posible visualizar el anillo Z y las principales proteínas del divisoma para monitorear la dinámica de las proteínas mediante microscopía de lapso de tiempo. La preparación clásica de muestras para bacterias no funciona para cianobacterias filam.......

Discusión

El estudio de la dinámica de las proteínas divisómicas es sin duda un desafío. Particularmente, en las cianobacterias filamentosas, uno de los desafíos es la visualización del anillo Z en el plano horizontal, para lo cual las células deben estar orientadas verticalmente. El método que describimos aquí permite el posicionamiento del anillo Z en el plano XY para realizar los diferentes análisis. Este es el primer método simple para cianobacterias filamentosas que permite la visualización completa del anillo Z.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa de 1 ml	Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.	-	La jeringa de plástico médico desechable con aguja de 1 ml generalmente se usa para bombear líquido o líquido de inyección, en este experimento se usa para succionar la muestra y hacerla polimerizar.
Cámara de células Attofluor	ThermoFischer Scientific	A7816	La cámara de células Attofluor es un soporte de cubreobjetos duradero y práctico diseñado para ver muestras de células vivas en microscopios verticales o invertidos.
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Cubreobjetos Fisherbrand: Circles	ThermoFischer Scientific	12-546-2P	Fabricado con el mejor vidrio óptico de borosilicato, con un grosor y tamaño uniformes. Forma circular. Resistente a la corrosión.
Agarosa de bajo punto de fusión	Promega	V3841	La agarosa, de bajo punto de fusión, grado analítico, es ideal para aplicaciones que requieren la recuperación de fragmentos de ADN intactos después de la electroforesis en gel.
Microscopio LSM 880 de Zeiss Airyscan	Zeiss-El		microscopio Zeiss Airyscan LSM 880 es un microscopio focal de barrido láser que puede adquirir imágenes por debajo del límite de resolución (resolución lateral ~ 120 nm y resolución axial ~ 350 nm). Los detectores son altamente sensibles, lo que permite adquirir imágenes de superresolución a alta velocidad.
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