Aplicación del análisis de citometría de flujo para la medición de múltiples parámetros mitocondriales en organoides cerebrales 3D

Summary

Este protocolo informa de un método único de uso de un citómetro de flujo y múltiples anticuerpos para la evaluación simultánea de múltiples parámetros funcionales mitocondriales, incluidos los cambios en el volumen mitocondrial, las cantidades de las subunidades del complejo de la cadena respiratoria mitocondrial (MRC) y la replicación del ADN mitocondrial (ADNmt).

Abstract

La disfunción mitocondrial es un contribuyente primario o secundario común a muchos tipos de neurodegeneración, y los cambios en la masa mitocondrial, los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial (MRC) y el número de copias del ADN mitocondrial (ADNmt) a menudo aparecen en estos procesos. Los organoides del cerebro humano derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) recapitulan la disposición citoarquitectónica tridimensional (3D) del cerebro y ofrecen la posibilidad de estudiar los mecanismos de la enfermedad y seleccionar nuevas terapias en un sistema humano complejo. Aquí, informamos sobre un enfoque único basado en citometría de flujo para medir múltiples parámetros mitocondriales en organoides corticales derivados de iPSC. Este informe detalla un protocolo para la generación de organoides cerebrales corticales a partir de iPSC, la disociación unicelular de los organoides generados, la fijación, la tinción y el posterior análisis de citometría de flujo para evaluar múltiples parámetros mitocondriales. La doble tinción con anticuerpos contra la subunidad NADH del complejo MRC: Ubiquinona Oxidorreductasa Subunidad B10 (NDUFB10) o factor de transcripción mitocondrial A (TFAM) junto con el canal selectivo aniónico dependiente de voltaje 1 (VDAC 1) permite evaluar la cantidad de estas proteínas por mitocondria. Dado que la cantidad de TFAM corresponde a la cantidad de ADNmt, proporciona una estimación indirecta del número de copias de ADNmt por contenido mitocondrial. Todo este procedimiento se puede completar en un lapso de 2-3 h. Fundamentalmente, permite la cuantificación simultánea de múltiples parámetros mitocondriales, incluidos los niveles totales y específicos en relación con la masa mitocondrial.

Introduction

Las mitocondrias son orgánulos celulares esenciales y el sitio principal de la producción de trifosfato de adenosina (ATP). Además de proporcionar energía a las células, las mitocondrias también participan en múltiples procesos celulares, incluida la transmisión de información celular, la diferenciación celular y la apoptosis, y tienen la capacidad de regular el crecimiento celular y el ciclo celular. Se han identificado cambios en la función mitocondrial en diversas enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Parkinson (EP)^1,2, la enfermedad de Alzheimer (EA)³ y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA)⁴. La disfunción mitocondrial desempeña un papel en el proceso de envejecimiento, acumulando mutaciones somáticas del ADNmt y disminuyendo la función de la cadena respiratoria⁵.

En la neurodegeneración se producen varios tipos de disfunción mitocondrial, y la capacidad de medir dichos cambios es extremadamente útil cuando se estudian los mecanismos de la enfermedad y se prueban posibles tratamientos. Además, el establecimiento de sistemas modelo in vitro adecuados que recapitulen la enfermedad en células cerebrales humanas es vital para comprender mejor los mecanismos de la enfermedad y desarrollar nuevas terapias. Las iPSCs de pacientes con enfermedades neurodegenerativas han sido utilizadas para generar diversas células cerebrales que manifiestan daño mitocondrial 6,7,8,9. El desarrollo de organoides cerebrales en 3D derivados de iPSCs es un paso importante en el modelado de enfermedades. Estos organoides cerebrales derivados de iPSC proporcionan complejidad y contienen los antecedentes genéticos propios del paciente, proporcionando así un modelo de enfermedad que refleja con mayor precisión la patología en el cerebro del paciente.

Si bien se han realizado algunas investigaciones sobre estudios mitocondriales utilizando organoides cerebrales derivados de iPSC 10,11,12, las técnicas convenientes y confiables para determinar múltiples parámetros funcionales mitocondriales en organoides cerebrales derivados de iPSC siguen siendo limitadas. La citometría de flujo proporciona una poderosa herramienta para medir los parámetros mitocondriales a nivel de una sola célula, como hemos demostrado anteriormente¹³. Este estudio proporciona un protocolo detallado para generar organoides corticales a partir de iPSC, combinado con un nuevo enfoque basado en citometría de flujo para medir simultáneamente múltiples parámetros mitocondriales, incluida la masa mitocondrial, las subunidades del complejo de la cadena respiratoria y el número de copias de ADNmt (Figura 1). Es importante destacar que, al utilizar la masa mitocondrial como denominador, estos protocolos permiten medir tanto los niveles totales como los específicos por unidad mitocondrial.

Protocol

1. Diferenciación de iPSCs en organoides corticales

1. Preparación de placas recubiertas de matriz
   1. Descongele el vial de la matriz de membrana basal disponible comercialmente en hielo durante la noche. Diluir a 1:100 en frío Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's F12 DMEM/F12 (1% de concentración final). Hacer alícuotas y almacenarlas a -20 °C (ver Tabla de Materiales).
   2. Descongele la solución de la matriz de membrana a 4 °C (manténgala fría) y cubra el número requerido de pocillos (1 mL para un pocillo en una placa de 6 pocillos). Incubar a 37 °C durante 1 h.
   3. Saca la placa de la incubadora y deja que alcance la temperatura ambiente (RT) (déjala durante una hora).
      NOTA: Los platos se pueden almacenar hasta por 2 semanas en el refrigerador (recuerde sacarlo y calentar los pocillos recubiertos requeridos para ese día en RT hasta que ya no esté frío al tacto antes de usar). Se recomienda utilizar las placas dentro de los 3 días. Para un almacenamiento prolongado, agregue 1 ml de Essential 8 Medium (consulte la tabla de materiales) a la placa recubierta para evitar que el gel se seque.

2. Preparación del medio Essential 8 (E8) para el cultivo de iPSC

1. En un ambiente estéril, prepare el medio E8 combinando el medio basal E8 con el suplemento E8 (ver Tabla de Materiales). Se puede almacenar a 4 °C durante 2 semanas.
   NOTA: Descongele el suplemento E8 congelado a 4 °C durante la noche antes de preparar el medio completo. No se recomienda descongelar el suplemento congelado a 37 °C; use E8 Medium durante 2 semanas. Antes de usarlo, caliente E8 Medium requerido para ese día en RT hasta que ya no esté fresco al tacto.

3. Subcultivo de iPSCs

1. Precalentar placas recubiertas de matriz en RT o incubadora a 37 °C durante 20-30 min. Precaliente la cantidad de medio E8 necesaria en RT.
2. Aspire el medio de cultivo con una pipeta.
3. Enjuague las iPSC (consulte la Tabla de materiales) con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (libre de Ca²⁺/Mg²⁺ ) (DPBS-/-) (4 mL para un pocillo en una placa de 6 pocillos).
4. Agregue ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (0,5 mM) (1 mL para un pocillo en una placa de 6 pocillos). Incubar a 37 °C hasta que los bordes de las colonias comiencen a desprenderse de la placa (generalmente 3-5 min).
5. Aspirar la solución de disociación.
6. Agregue medio E8 precalentado (4 mL para un pocillo en una placa de 6 pocillos) y use alta presión para separar las colonias de iPSC.
7. Transfiera a dos pocillos diferentes en una placa de 6 pocillos recubierta de matriz (2 mL para un pocillo en una placa de 6 pocillos) e incube a 37 °C.
   NOTA: Agite suavemente antes de colocar la placa en la incubadora. La relación de división puede ser 1:2-1:4.
8. Intercambie medios diariamente hasta que las colonias obtengan un 80% de confluencia con buen tamaño y conexiones.
   NOTA: Vigile las colonias de un tamaño adecuado, caracterizadas normalmente por una forma circular bien definida y un diámetro que oscila entre 0,5 y 1 mm. Las colonias deben exhibir estructuras densas y compactas con bordes lisos y claramente delineados.

4. Formación de cuerpos embrioides (EB) e inducción neuronal

1. Prepare el medio de inducción neuronal (NIM) combinando los componentes enumerados en la Tabla de Materiales.
2. Aspire el medio y enjuague las células con DPBS -/- (4 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos).
3. Agregue Accutase precalentado (1 mL por pocillo en una placa de 6 pocillos) (ver Tabla de Materiales) en el pocillo e incube a 37 °C durante 10 min.
4. Pipetear suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo de 3 a 4 veces con una punta de pipeta de 1000 μL.
5. Neutralizar con 2 mL de DMEM con 10% de suero fetal bovino (FBS) y centrifugar el tubo cónico de 15 mL que contiene las células a 600 x g durante 5 min en RT. Aspirar el sobrenadante.
6. Vuelva a suspender los gránulos de celda pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo hasta obtener paletas de una sola celda.
7. Cuente y calcule la concentración de células vivas utilizando azul de tripán¹⁴ en un contador de células automatizado.
8. Calcule la relación de dilución y diluya las células en NIM para obtener una concentración final de células de 60.000 células vivas/mL.
9. Añada el inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK) Y-27632 (concentración final 50 μM) (ver Tabla de Materiales) a la suspensión celular y mezcle suavemente.
10. Agregue 150 μL de suspensión de una sola célula en cada pocillo de la placa de 96 pocillos de fijación ultrabaja (consulte la Tabla de materiales) y colóquela en la incubadora. Configurar como Día 0.
11. El día 1, revise las celdas y los formularios EB en cada pocillo.
    NOTA: Evalúe la formación exitosa de EB en función de su apariencia brillante, esférica y translúcida bajo un microscopio, su capacidad para permanecer flotando libremente y separadas, y la ausencia de células muertas, que aparecen como manchas oscuras.
12. El día 2, retire 75 μL de medio de cada pocillo con cuidado y agregue 150 μL de NIM junto con 50 μM de Y-27632 a cada pocillo.
13. En los días 4, 6 y 8, retire 100 μL de medio de cada pocillo y agregue 150 μL de NIM a cada pocillo.

5. Generación de organoides corticales

1. Prepare el medio de diferenciación neuronal menos vitamina A (NDM-) combinando los componentes enumerados en la Tabla de Materiales.
2. En el día 10, transfiera los EB de la placa de 96 pocillos de fijación ultrabaja a la placa de 6 pocillos de conexión ultrabaja con una pipeta de 5 mL. Transfiera ocho EB a cada pozo con cautela (Figura 2). Agregue 5 mL de NDM- a cada pocillo.
3. Coloque la placa en el agitador orbital dentro de la incubadora y comience a girar a 80 rpm.
4. En los días 12, 14 y 16, reemplace el NDM- con 4 mL después de aspirar 3 mL de medio viejo.

6. Maduración y cultivo a largo plazo de organoides corticales

1. Prepare un medio de diferenciación neuronal con vitamina A (NDM+) y factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). Para obtener más información, consulte Tabla de materiales.
2. El día 18, retire el medio de 3 mL y agregue 4 mL de NDM+.
3. Regrese el plato a la cultura de hilado.
4. Alimente cada 4 días y mantenga los organoides corticales diferenciados en NDM+ hasta su uso. Para el análisis posterior se utilizaron organoides corticales de 25 a 40 días de edad.
   NOTA: Los organoides corticales se pueden mantener por más tiempo (hasta 3-4 meses); Pero la viabilidad celular se reducirá debido a la falta de intercambio de nutrientes.

7. Caracterización celular por inmunocitoquímica y tinción de inmunofluorescencia

1. Utilice una pipeta de 1000 μL para recoger suavemente el organoide del medio y colóquelo suavemente en un medio con un medio mínimo en un portaobjetos de microscopio estándar.
2. Deje que se seque completamente a RT. Agregue un 4% de paraformaldehído (PFA) (300 μL por muestra) durante 30 min. Retire el PFA y luego enjuague dos veces con PBS.
   NOTA: El PFA es tóxico y se sospecha que es cancerígeno. Evite el contacto con la piel y los ojos, y manéjelo debajo de una campana de gases químicos.
3. Añadir solución de sacarosa al 30% (300 μL por muestra) a los portaobjetos e incubar durante la noche a 4 °C.
4. Bloquear y permeabilizar los organoides con tampón bloqueante (BB) (300 μL por muestra) que contenga PBS (con Ca²⁺/Mg²⁺), Triton X-100 al 0,3% y suero de cabra normal al 10% durante 2 h a RT (o toda la noche a 4 °C). Delinea los organoides con un bolígrafo de barrera hidrofóbica para mantener el tampón en el portaobjetos.
5. Superponga las muestras con el anticuerpo primario en tampón de bloqueo (300 μL por muestra), anti-SRY (región Y determinante del sexo)-caja 2 (SOX2, 1:100) y marcador antineural tuberina beta III (Tuj1, 1:1000), e incube durante la noche a 4 °C en la oscuridad (ver Tabla de Materiales).
6. Lavar en PBS durante 3 h con dos o tres cambios de tampón en una plataforma de balanceo suave.
7. Incubar con anticuerpo secundario (300 μL por muestra), anti-Alexa Flour 488 (1:800) y anti-Alexa Flour 594 (1:800), durante la noche a 4 °C en un cuarto oscuro humidificado. Añada al mismo tiempo la tinción nuclear Hoechst 33342 (1:5000) (véase la tabla de materiales).
8. Aspire el anticuerpo y enjuague rápidamente con PBS, luego agregue PBS que contenga 0,01% de NaAzide durante 1-2 días a 4 °C para evitar la contaminación.
9. Aspire el PBS y retire el exceso de solución. Monte los organoides con medio de montaje (consulte la Tabla de materiales), luego agregue un cubreobjetos. Evite la formación de burbujas de aire y colóquelo en una habitación oscura en RT durante al menos 12 h para permitir que el montaje se polimerice completamente.
   NOTA: La muestra ya está lista para ser imaginada bajo un microscopio de fluorescencia.

8. Disociación de organoides corticales

1. Agregue 30 mL de DPBS -/- en un tubo de centrífuga de 50 mL.
2. Recoja suavemente los organoides cerebrales en el tubo con una pipeta de 10 ml. Se utilizan al menos 3 organoides para una tinción, y deben tener más de 25 días pero menos de 40 días.
3. Sedimentar organoides durante aproximadamente 5 min. No centrifugar.
4. Aspire DPBS y agregue 2 mL de Accutase precalentado en el tubo. Incubar la muestra en el baño de agua durante 5 min a 37 °C.
5. Triturar 15 veces suavemente utilizando una punta de pipeta de 1000 μL sin generar burbujas. Incubar la muestra durante otros 5 minutos a 37 °C en un baño de agua.
6. Disociado suavemente mediante el uso de puntas de pipeta de 1000 μL 15 veces sin generar burbujas (Figura 3A).
   NOTA: Si todavía hay algunas células sin disociar, transfiera las células no disociadas a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml y luego incube durante otros 5 minutos a un baño de agua a 37 °C. A continuación, disocie suavemente utilizando puntas de pipeta de 1000 μL 20 veces.
7. Neutralizar con 4 mL de DMEM con 10% de FBS y centrifugar el tubo cónico de 15 mL que contiene las células a 600 x g durante 5 min en RT.
8. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender con 200 μL de DPBS utilizando puntas de pipeta de 1000 μL 10 veces sin generar burbujas.
9. Agregue 200 μL de DPBS para hacer un volumen total de 400 μL de suspensiones celulares en DPBS.
10. Filtre con el filtro o el tubo del filtro (use filtros de 35 o 40 μm y enjuague el filtro con DPBS antes de usar el filtro).
11. Separe la mitad de la solución en un tubo y utilícela como muestra sin teñir.

9. Medición por citometría de flujo de subunidades complejas MRC y TFAM en celdas fijas

1. Agregue colorante de tinción vivo y muerto (L/D) (1: 1000) (consulte la tabla de materiales) (ya sea con rojo lejano o infrarrojo cercano, según la configuración de los marcadores para citometría de flujo).
   NOTA: Si se abre un nuevo vial para colorante L/D, agregue 50 μL de DMSO para reconstituir y haga una alícuota de 10 μL para almacenarlos a -20 °C.
2. Mantener en RT y oscuro durante 30 min. Agregue 40 mL de DPBS -/-. Centrifugar a 600 x g durante 5 min.
3. Vuelva a suspender en suspensión de una sola célula después de desechar el sobrenadante.
4. Fijar y permeabilizar las células con 1 mL de metanol al 90% helado a -20 °C durante 20 min.
5. Bloquee las muestras en un tampón de bloque de 1 mL que contiene 0,3 M de glicina, 5% de suero de cabra y 1% de albúmina sérica bovina (BSA) en PBS (con Ca²⁺/Mg²⁺).
6. Lavar con tampón de flujo de 20 mL que contenga PBS (con Ca²⁺/Mg²⁺) con 0,2% de BSA una o dos veces.
7. Agregue los anticuerpos primarios anti-NDUFB10 conjugados con Alexa Fluor 405 (1:100), anti-VDAC 1 conjugado con Alexa Fluor PE (1:100) y anticuerpo anti-TFAM conjugado con Alexa Fluor 488 (1:200) durante 30 minutos (ver Tabla de materiales).
8. Lavar con tampón de flujo de 20 mL.
9. Aspire y deje aproximadamente 100 μL y reconstituya los gránulos celulares en tampón de flujo de 300 μL.
10. Transfiera las células a tubos de flujo de 1,5 mL. Manténgalo en la oscuridad y el hielo.
11. Analice en el citómetro de flujo (ver Tabla de Materiales). Se detectaron señales para Anti NDUFB10-Alexa 405 usando un filtro de paso de banda 450/50, TFAM-Alexa 488 usando un filtro de paso de banda 530/30, VDAC 1-Alexa 647 usando un filtro de paso de banda 670/14 y un tinte L/D en el filtro de paso de banda 780/60 (Figura 3B).

10. Adquisición y análisis de citometría de flujo

1. Utilice muestras sin tinción y con una sola tinción del organoide de control para establecer el voltaje de los ajustes del citómetro.
2. Utilice el tubo de control sin teñir para establecer los diagramas de dispersión del área de dispersión directa (FSC-A) y del área de dispersión lateral (SSC-A) en función del tamaño y la granularidad de la población de células (Figura 4A).
3. Cierre la puerta de los residuos para seleccionar células vivas de las parcelas FSC-A y SSC-A. Dobletes de salida de puerta usando altura de dispersión lateral (SSC-H) vs. Gráfico SSC-A (Figura 4B).
4. Seleccione las células vivas en función de la tinción del colorante L/D cambiando a APC-cy7 vs. Gráfico FSC-A (Figura 4C).
5. Usando las muestras no teñidas de cada línea, dibuje una puerta por encima de la población principal de los eventos en FSC-A vs. Gráficos de canales de fluorocromo (FITC, APC, BV 421).
6. La configuración compensa el citómetro de flujo¹⁵.
7. Utilice el control de isotipo para el control negativo para observar la tinción de fondo.
8. Realizar la adquisición de datos.
   1. Seleccione las células vivas en función de la tinción del colorante L/D cambiando a APC-cy7 vs. el gráfico FSC-A (Figura 4C).
   2. Utilice lo inmanchado como control negativo. Luego, mientras examina el FSC-A vs. los canales de fluorocromo (FITC, APC, BV 421) establecen una puerta por encima de la población principal de eventos de una sola célula (Figura 4D-F).
9. Realice análisis de datos utilizando el software FlowJo (ver Tabla de Materiales).
   1. Duplique las posiciones de las puertas en las muestras de células teñidas. Documente el número de células que presentan tinción positiva.
   2. Para cada población objetivo, evalúe la intensidad de fluorescencia media (MFI) de diferentes canales (FITC, APC, BV 421) trazados en el eje x de un histograma para identificar la señal mitocondrial. Los valores específicos para la subunidad NDUFB10 compleja I y TFAM se pueden determinar dividiendo el MFI de la expresión compleja o TFAM por el indicador de masa mitocondrial, VDAC 1.

Results

La Figura 1 proporciona una representación esquemática del proceso de diferenciación y las estrategias utilizadas para el análisis citométrico de flujo. Las iPSC humanas se cultivaron en placas de 96 pocillos no adherentes para formar EB y luego se transfirieron a placas de 6 pocillos no adherentes para obtener organoides corticales completamente desarrollados. La composición celular de los organoides se validó mediante microscopía confocal tras inmunotinción con marcadores neuronales

Discussion

Se presenta un protocolo para generar organoides cerebrales corticales a partir de iPSCs humanas y para realizar el análisis citométrico de flujo de parámetros mitocondriales en células individuales aisladas de estos organoides. La composición celular de los organoides se verificó mediante microscopía confocal con tinción inmunohistoquímica para marcadores de células neuronales y gliales. Se ha demostrado que la estrategia basada en citometría de flujo que combina con anti-NDUFB10, VDAC ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticuerpos utilizados en citometría
anti-DUFB10 Alexa Fluor 405	NOVUS biologicals	NBP2-72915AF405
anti-VDAC1 Alexa Fluor 647	Santa cruz technology	sc-390996
anti-TFAM Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308
L/D kit de tinción de células muertas de infrarrojo cercano fijable	Life technologies	L10119
Anticuerpos utilizados en la tinción por inmunofluoración
anti-Tuj1	Abcam	ab78078
anti-SOX2	Abcam	ab97959
anti-Alexa Flour 488	Thermo Fisher Scientific	A28175
anti-Alexa Flour 594	Thermo Fisher Scientific	A-21442
Commercial cells
AG05836 (RRID:CVCL_2B58)			Proporcionado por Gareth John Sullivan del Instituto de Ciencias Médicas Básicas del Universidad de Oslo, Noruega
Essential 8 Medio (medio de cultivo iPSC)
Essential 8 Medio basal	Thermo Fisher Scientific A1516901
Essential 8 Suplemento (50x) 2% (v/v)	Thermo Fisher Scientific A1517101
Store at 4 ° C y calentar a RT antes de usar.
Instruments
Heracell 150i Incubadoras de CO2	Fisher Scientific, EE. UU.
Agitadores orbitales - SSM1, SSL1	Stuart Equipment, Reino Unido
Cámara de microscopio CCD Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Alemania
Baño de agua Academia JB Básico Jba5 Beca JBA5 Instrumentos	Grant Instruments, EE. UU.
Sistema de aspiración de fluidos BVC control	Vacuubrand, Alemania
Microscopio confocal Leica TCS SP8 STED	Leica Microsystems, Alemania
Tubo halcón de 50 mL	Sigma-Aldrich CLS430828
BD LSR Fortessa	BD Biosciences, EE. UU.
Análisis del muestreador Flowjo	FlowJo LLC, EE. UU.
Pipeta de 10 mL	Sigma-Aldrich	SIAL1100
1, 10, 100, 1000 mL pipeta	Sigma-Aldrich
40 µ m Stariner de células	Sigma-Aldrich	CLS431750
fijación ultra baja placa de 96 pocillos	S-BIO	MS-9096UZ
Contador de células automatizado Countess II	Thermo Fisher Scientific
Neural differentiation medium  (NDM+)
DMEM/F12	Tecnologías de vida	11330032
Medio neurobasal	Tecnologías de vida	2110349
Suplemento de Glutamax 1% (v/v)	Life technologies	35050
Suplemento de N2 0,5% (v/v)	Life technologies	17502-048
B27 suplemento 1% (v/v)	Vida tecnologías	17504-044
β-Mercaptoetanol 50 µ M	Sigma-aldrich	M3148
BDNF 20 ng/mL	Peprotech	450-02
Ácido ascórbico 200 µ M	Sigma-Aldrich	A92902
Tienda en 4° C durante un máximo de 2 semanas
Medio de diferenciación neuronal menos viatmina A (NDM-)
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Medio neurobasal	Life technologies	2110349
Suplemento Glutamax 1% (v/v)	Life technologies	35050
Suplemento N2 0,5% (v/ v)	Life technologies	17502-048
B27 suplemento W/O vit. A 1% (v/v)	Life technologies	12587010
β-Mercaptoethanol 50 µ Tienda M	Sigma-aldrich	M3148
en 4° C durante un máximo de 8 días
Medio de inducción neural (NIM)
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Reemplazo de suero knockout 15% (v/v)	Life technologies	10828028
Suplemento Glutamax 1% (v/v)	Life technologies	35050
β- Mercaptoetanol 100 µ M	Sigma-Aldrich	M3148
LDN-193189 100 nM	Stemgent/Reprocell	04-0074
SB431542 10 µ M	Tocris	1614
XAV939 2 µ Tienda M	Sigma-Aldrich	X3004
en 4° C durante un máximo de 10 días
Neutralización media
IMDM	Tecnologías Life	21980032
FBS 10%	Sigma-Aldrich	12103C
Otros reactivos
Ca2+/Mg2+)	Thermo Fisher Scientific	14190250
Albúmina sérica bovina	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000
Tecnologías Accutase	Life	A11105-01
Tecnologías Geltrex	Life	A1413302
Tecnologías EDTA	Life	15575038
Tecnologías avanzadas DMEM / F12	Life	12634010
Tejido neural kit de disociación	Miltenyi biotec	130-092-628
Y-27632 dihidrocloruro Inhibidor de rocas	Biotechne Tocris	1254
Fluoromount-G™ Medio de montaje	SouthernBiotech	0100-20
PFA	Thermo Fisher Scientific	28908