Preparación de muestras de alimentos mediante homogeneización y digestión ácida húmeda asistida por microondas para la determinación de múltiples elementos con ICP-MS

El análisis elemental es un proceso analítico para determinar la composición elemental de varias muestras. Se puede utilizar para controlar la ingesta de metales en el cuerpo humano (especialmente metales pesados¹) ya que sus altas concentraciones pueden causar problemas de salud no deseados. Los metales pesados también son uno de los principales contaminantes ambientales, por lo tanto, es necesario el control de su presencia en el medio ambiente². Además, el análisis elemental puede emplearse para determinar el origen geográfico de los productos alimenticios³ y para controlar la calidad de los alimentos y los recursos hídricos⁴. Además, se utiliza para la determinación de micro y macronutrientes en los suelos⁵ y para obtener información sobre los procesos geológicos a lo largo de la historia mediante el examen de la composición química de minerales y sedimentos⁶. También se han realizado estudios para determinar la presencia de metales raros en residuos eléctricos y electrónicos para su posterior regeneración de metales⁷, para evaluar el éxito de los tratamientos farmacológicos⁸ y para verificar la composición elemental de los implantes metálicos⁹.

La espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) y la espectroscopia de emisión óptica con plasma acoplado inductivamente (ICP-OES) son técnicas comúnmente utilizadas para el análisis elemental de diversas muestras¹⁰. Permiten la determinación simultánea de múltiples elementos con límites de detección (LOD) y límites de cuantificación (LOQ) tan bajos como ng/L. En general, ICP-MS tiene valores de LOD¹¹ más bajos y un rango de concentración lineal más amplio en comparación con ICP-OES¹². Otras técnicas para determinar la composición elemental son la espectrometría de emisión óptica de plasma inducida por microondas¹³ y varias variantes de espectroscopia de absorción atómica (AAS), incluida la espectroscopia de absorción atómica de llama, la espectroscopia de absorción atómica electrotérmica², la espectroscopia de absorción atómica de vapor frío y la espectroscopia de absorción atómica de generación de hidruros¹⁴. Además, la determinación elemental con bajo LOD y LOQ es posible con diferentes métodos electroanalíticos, especialmente con voltamperometría de stripping anódico^15,16. Por supuesto, existen otros métodos para determinar la composición elemental de las muestras, pero no se emplean con tanta frecuencia como los métodos mencionados anteriormente.

La determinación elemental directa de muestras sólidas es factible utilizando espectroscopía de ruptura inducida por láser y fluorescencia de rayos X¹⁷. Sin embargo, para la determinación elemental con ICP-MS, ICP-OES y AAS es necesario convertir las muestras sólidas en estado líquido. Para ello, la digestión ácida se realiza utilizando ácidos y reactivos auxiliares (en la mayoría de los casos_H2O2). La digestión ácida se realiza a temperatura y presión elevadas, convirtiendo la parte orgánica de la muestra en productos gaseosos y convirtiendo los elementos metálicos en sales solubles en agua, disolviéndolos así en la solución¹⁸.

Hay dos tipos principales de digestión ácida, la digestión de vasos abiertos y la digestión de vasos cerrados. La digestión en recipiente abierto es rentable¹⁴ pero tiene limitaciones, como la temperatura máxima de digestión, que coincide con la temperatura de ebullición de los ácidos a presión atmosférica. La muestra se puede calentar en placas calefactoras, bloques calefactores, baños de agua, baños de arena² y microondas¹⁹. Al calentar la muestra de esa manera, gran parte del calor generado se pierde en el entorno²⁰, lo que prolonga el tiempo de digestión¹⁴. Otras desventajas de la digestión en recipientes abiertos incluyen un mayor consumo de productos químicos, la mayor posibilidad de contaminación del ambiente circundante y la posible pérdida de analitos debido a la formación de componentes volátiles y su evaporación de la mezcla de reacción²¹.

Los sistemas de recipientes cerrados son más convenientes para la digestión de muestras orgánicas e inorgánicas en comparación con los sistemas de recipientes abiertos. Los sistemas de recipientes cerrados utilizan una variedad de fuentes de energía para calentar las muestras, como el calentamiento por conducción y las microondas²². Los métodos de digestión que utilizan microondas incluyen la combustión inducida por microondas²³, los sistemas de cámara de reacción única²⁴ y la digestión ácida húmeda asistida por microondas (MAWD) de uso ^común25,26. MAWD permite la digestión a temperaturas de funcionamiento más altas, que oscilan entre 220 °C y 260 °C y presiones máximas de hasta 200 bar, dependiendo de las condiciones de trabajo del instrumento²⁷.

La eficiencia y la tasa de MAWD dependen de varios factores, incluyendo la composición química de las muestras, la temperatura máxima, el gradiente de temperatura, la presión en el recipiente de reacción, la cantidad de ácidos añadidos y la concentración de ácidos utilizados²⁸. En MAWD, la digestión ácida completa se puede lograr en unos pocos minutos debido a las condiciones de reacción elevadas en comparación con las digestiones más duraderas en sistemas de recipientes abiertos. Se requieren volúmenes y concentraciones más bajos de ácidos en MAWD, lo que está en línea con las pautas actuales de química verde²⁹. En MAWD, se necesita una cantidad menor de muestra en comparación con la digestión en recipiente abierto para realizar la digestión ácida, por lo general, hasta 500 mg de muestra son suficientes 30,31,32. Se pueden digerir grandes cantidades de muestras, pero requieren una mayor cantidad de productos químicos.

Dado que el instrumento para MAWD controla automáticamente las condiciones de reacción y la persona no entra en contacto directo con los productos químicos durante el calentamiento, MAWD es más seguro de operar que las digestiones de recipientes abiertos. Sin embargo, la persona siempre debe proceder con precaución al agregar productos químicos a los recipientes de reacción para evitar que entren en contacto con el cuerpo y causen daño. Los recipientes de reacción también deben abrirse lentamente, ya que la presión se acumula en su interior durante la digestión ácida.

Aunque la digestión ácida es una técnica útil para la preparación de muestras para la determinación elemental, la persona que la realiza debe ser consciente de sus posibles limitaciones. La digestión ácida puede no ser adecuada para todas las muestras, especialmente aquellas con matrices complejas y aquellas que son altamente reactivas o podrían reaccionar explosivamente. Por lo tanto, la composición de la muestra siempre debe evaluarse para seleccionar los productos químicos y las condiciones de reacción apropiados para una digestión completa que disuelva todos los elementos deseados en la solución. Otras preocupaciones que el usuario debe tener en cuenta y abordar son las impurezas y la pérdida de analitos en cada paso de la preparación de la muestra. La digestión ácida debe realizarse siempre de acuerdo con normas específicas o mediante protocolos.

El protocolo que se describe a continuación proporciona instrucciones para la homogeneización de muestras de alimentos en un mezclador de tamaño de laboratorio, un procedimiento para limpiar los componentes del mezclador, pesar adecuadamente la muestra, agregar productos químicos, realizar la digestión ácida mediante MAWD, limpiar los recipientes de reacción una vez completada la digestión, preparar las muestras para la determinación elemental y realizar una determinación cuantitativa de múltiples elementos con ICP-MS. Siguiendo las instrucciones que se dan a continuación, se debería poder preparar una muestra adecuada para la determinación elemental y realizar las mediciones de las muestras digeridas.

1. Homogeneización de muestras

1. Con un cuchillo de cerámica limpio, corte manualmente las muestras de alimentos (brócoli, champiñones, salchichas y fideos) en trozos más pequeños para acelerar el proceso de secado. Prepare suficientes muestras para un mínimo de 6 réplicas de la digestión ácida (asegúrese de que la masa mínima de las muestras secas sea de 1500 mg).
   NOTA: Al aumentar el área de superficie de la muestra, se expone una porción más grande de la muestra al aire circundante calentado, lo que aumenta la tasa de evaporación del agua.
2. Colocar la muestra en un vaso de precipitados de vidrio de 250 ml y secarla a 105 °C con un peso constante utilizando un secador.
3. Retire el vaso de vidrio con la muestra de la secadora e insértelo en el desecador.
4. Deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente.
   NOTA: Las muestras deben pesarse a una temperatura constante para garantizar que el peso refleje con precisión la masa. Las variaciones de temperatura pueden afectar el volumen y la densidad de las muestras medidas.
5. Abra el desecador y transfiera el vaso de vidrio con la muestra en la balanza analítica. Mida el peso del vaso de vidrio con la muestra.
6. Una vez completado el pesaje, vuelva a colocar la muestra en la secadora.
   NOTA: Si la muestra se encogió significativamente durante el secado, se podría transferir a un vaso de vidrio más pequeño utilizando una espátula de plástico para un pesaje más conveniente.
7. Repita el proceso como se describe en los pasos 1.3-1.6 hasta lograr un peso constante de la muestra.
8. Introduzca la muestra heterogénea seca en el vaso mezclador (véase la tabla de materiales), asegurándose de que no supere el volumen máximo del vaso mezclador.
9. Inserte el vaso mezclador en el mezclador y cierre la puerta de protección (Figura 1).
10. Presione el botón de inicio para activar las cuchillas para moler y mezclar la muestra.
11. Realice la molienda hasta que la muestra se convierta en un polvo fino o en una pasta homogénea. Para lograr dicho producto, repita el proceso de molienda varias veces.
12. Cuando la muestra esté homogeneizada, apague el mezclador, abra la puerta de protección y retire el vaso de precipitados del mezclador.
13. Retire la muestra homogeneizada del vaso mezclador y transfiérala a un vaso de precipitados de vidrio limpio de 50 ml con una espátula de plástico limpia (Figura 2).
    NOTA: Si la muestra es demasiado dura y podría dañar los componentes de la mezcladora, como las cuchillas y el vaso de precipitados de la mezcladora, se puede homogeneizar por otros medios, como triturarla en morteros. Los mezcladores no suelen ser adecuados para homogeneizar materiales duros, muestras congeladas o muestras fácilmente inflamables, lo que podría dañar los componentes del mezclador. Se desaconseja el uso de disolventes orgánicos en el mezclador.
    PRECAUCIÓN: Use equipo de seguridad y asegúrese de que la puerta de la batidora esté bien cerrada a medida que las cuchillas de la batidora giran a altas velocidades.

2. Limpieza del mezclador

1. Añada agua ultrapura (véase la tabla de materiales) a la marca del vaso mezclador vacío.
2. Inserte el vaso mezclador en el mezclador y realice el procedimiento de mezcla estándar.
3. Saque el vaso de precipitados de la batidora y vierta las aguas residuales. Si es necesario, repita el proceso con agua ultrapura varias veces hasta que el agua permanezca limpia incluso después de mezclar.
4. Retire las cuchillas y el sello de diafragma contaminados de la batidora y límpielos a fondo con agua ultrapura.
   NOTA: Utilice detergentes neutros para mejorar la eficiencia de la limpieza, especialmente cuando se trata de muestras con un alto contenido de grasa, ya que la grasa se adhiere fácilmente a la superficie del inventario del laboratorio.
   PRECAUCIÓN: Use el equipo de protección adecuado, como guantes, al quitar y limpiar las cuchillas para reducir el riesgo de posibles lesiones por sus bordes afilados.
5. Seque los componentes limpios en la secadora a 105 °C y vuelva a insertarlos en la batidora.
   NOTA: Asegúrese de que los componentes del mezclador estén completamente secos antes de volver a instalarlos en el mezclador, para evitar el arrastre del agua a la siguiente muestra.

3. Pesaje de muestras

1. Retire la tapa del recipiente de reacción TFM-PTFE de 100 ml de trifluorometoxilo-politetrafluoroetileno³³.
2. Coloque el recipiente de reacción abierto en la balanza analítica y asegúrese de que la balanza esté nivelada y puesta a cero antes de cada medición (Figura 3).
   NOTA: El pesaje debe realizarse a temperatura ambiente. Evite las áreas donde las fluctuaciones severas de temperatura y el flujo de aire puedan afectar el peso medido. Asegúrese de que el área de pesaje esté limpia y libre de contaminantes.
3. Transfiera la muestra homogeneizada al recipiente de reacción con una espátula de plástico y pese 250 mg de la muestra. No pese la muestra por debajo del límite de peso mínimo de la balanza analítica.
4. Una vez finalizado el pesaje, coloque la tapa de la tapa en el recipiente de reacción para proteger la muestra de la contaminación.
   NOTA: Exceder el límite de peso del procedimiento de digestión puede resultar en una digestión incompleta. Manipule la muestra y los recipientes de reacción con cuidado para evitar cualquier contaminación externa.

4. Adición de ácido

1. Vierta aproximadamente 40,0 ml de HNO₃ al 68 % en peso y 5,0 ml de 30 % en peso de H₂O₂ en vasos de precipitados de vidrio de 50 ml separados, respectivamente.
   NOTA: Los productos químicos deben ser de alta pureza con impurezas de metales traza de menos de 1,0 μg/L (ppb), idealmente en el rango de ng/L (ppt). Las impurezas de trazas de metales afectan la precisión y la repetibilidad de la determinación elemental.
2. Coloque los recipientes de reacción en una campana extractora, abra las tapas de la tapa y agregue los volúmenes mencionados a continuación de 68 % en peso de HNO₃ y 30 % en peso de H₂O₂ con pipetas automáticas de 1 ml o 5 ml, de acuerdo con las siguientes especificaciones:
   1. brócoli, champiñones, salchichas y fideos; por 250 mg de muestra añadir 5,0 mL 68% en peso de HNO₃ y 1,0 mL 30% en peso de H₂O₂. Prepare tres réplicas para cada muestra.
   2. Para determinar la precisión del método (en términos de recuperación, Rec), utilice el procedimiento descrito en el paso 4.2.1 y añada 37,5 μL de solución patrón multielemento ICP de 100 mg/L (véase la Tabla de materiales) en los recipientes de reacción utilizando una pipeta automática de 200 μL. Para cada muestra, prepare tres réplicas.
      NOTA: Se seleccionó el volumen de 37,5 μL porque corresponde a un aumento de 15,0 μg/L para las soluciones enriquecidas de las muestras en comparación con la concentración en las soluciones no enriquecidas de las muestras. Además, el aumento de la concentración para la solución enriquecida de las muestras corresponde a la concentración final que todavía se encuentra en el rango de concentración lineal para cada analito medido.
   3. Preparar una muestra en blanco utilizando el mismo volumen de 68 % en peso de HNO₃ y 30 % en peso de_H2O₂ que se utiliza para la digestión de muestras de alimentos en el paso 4.2.1. Para una muestra en blanco, no agregue la muestra a los recipientes de reacción.
      PRECAUCIÓN: El HNO₃ utilizado para la digestión es corrosivo y produce humos. Por esta razón, la adición de ácido debe realizarse en una campana extractora. Se debe emplear equipo de protección de laboratorio estándar (guantes, gafas de seguridad y bata de laboratorio). Si hay contacto con ácido, el área afectada debe enjuagarse inmediatamente con un chorro de agua fría y se debe buscar ayuda médica.
3. Coloque la tapa de la tapa en los recipientes de reacción y deje que las muestras reaccionen con el 68% en peso de HNO₃ y el 30% en peso de H₂O₂ durante 2-3 min.
4. Atornille la tapa de la rosca en el recipiente y apriete las tapas de la tapa.
5. Agite el recipiente de reacción con ligeros movimientos de la mano para incorporar completamente las muestras a los productos químicos.
   NOTA: No deje las muestras en las paredes o tapas de los recipientes de reacción, ya que existe la posibilidad de que no se digieran por completo.

5. Digestión ácida húmeda asistida por microondas

1. Encienda el sistema de microondas (consulte la Tabla de materiales) para la digestión ácida presionando el botón de inicio (Figura 4).
2. Abra la puerta del horno microondas y retire la rejilla.
3. Distribuya los recipientes de reacción cerrados simétricamente en el bastidor para garantizar una irradiación uniforme de las muestras mediante microondas.
4. Inserte la rejilla en la cámara del microondas y móntela en un soporte (Figura 5).
5. Cierre la puerta del horno microondas.
6. Establezca un programa de digestión adecuado en la pantalla táctil del horno microondas con una herramienta en forma de bolígrafo. Elija un gradiente de temperatura adecuado, la temperatura final y el número de muestras que se van a digerir. El programa de digestión recomendado para diferentes muestras de alimentos se enumera a continuación:
   1. Brócoli, champiñones, salchichas y fideos: 10 min de aumento a 160 °C, 10 min de aumento a 200 °C, 15 min a 200 °C, potencia máxima de 900 W.
7. Inicie el programa de digestión y controle el cambio en las condiciones de reacción en la pantalla. Detenga el proceso de digestión si la temperatura no aumenta de acuerdo con el programa prescrito.
   NOTA: Durante la digestión, se pueden ver picos repentinos de temperatura en la pantalla del horno microondas. Se producen cuando las muestras reaccionan exotérmicamente con los productos químicos. El sistema de microondas regulará automáticamente la temperatura ajustando la potencia de salida.
8. Espere hasta que se complete la digestión asistida por microondas y la temperatura de la muestra disminuya.
9. Abra la puerta del horno microondas y retire la rejilla de la cámara del horno microondas. Cierre la puerta y apague el instrumento.
10. Retire los recipientes de reacción de la rejilla y espere a que se enfríen a temperatura ambiente.
11. Abra lentamente las tapas de las tapas manualmente para liberar los gases formados durante la digestión ácida. Gire los recipientes de reacción en la dirección de la campana extractora (Figura 6).
12. Retire completamente la tapa y enjuague la tapa y las paredes del recipiente de reacción con una pequeña cantidad de agua ultrapura.
13. Transfiera cuantitativamente el contenido del recipiente de reacción a un matraz volumétrico de vidrio limpio de 25 ml a través de un embudo de vidrio enjuagando repetidamente la tapa y el recipiente de reacción con agua ultrapura.
14. Diluir la muestra con agua ultrapura hasta la marca del matraz aforado. Cierre el matraz aforado con un tapón y mezcle el contenido del matraz aforado.
    NOTA: Se debe realizar una dilución adicional de las muestras digeridas con agua ultrapura, ya que deben contener menos del 5% (V/V) de ácido^{residual 34} y menos de 2 g/L de elementos disueltos, también denominados sólidos disueltos totales³⁵.
15. Tome una jeringa de plástico de 20 ml y conéctela con un filtro de jeringa de poliamida (25 mm de diámetro, tamaño de poro de 0,20 μm). Llene la jeringa de plástico con la muestra diluida y filtre su contenido en un tubo de centrífuga de plástico de 50 ml aplicando presión. Utilice una jeringa de plástico nueva y un filtro de jeringa para cada muestra para evitar cualquier contaminación cruzada.
    NOTA: Las muestras deben filtrarse para eliminar cualquier material insoluble o partículas sólidas que puedan quedar sin digerir después de MAWD. Estas partículas pueden interferir con las mediciones de determinación elemental al obstruir los componentes del instrumento. Al filtrar las muestras, asegúrese de desechar el primer par de gotas. Utilice filtros hidrófilos (hechos de poliamida) para soluciones acuosas. Los filtros hidrófobos (PTFE) no son adecuados para la filtración de soluciones acuosas, ya que requieren una presión aplicada más alta, lo que podría provocar la ruptura de la membrana³⁶.
16. Cierre el tubo de centrífuga de plástico de 50 ml con un tapón de rosca y coloque la muestra en el refrigerador hasta las mediciones.
    NOTA: Las muestras digeridas se almacenan en el refrigerador a temperaturas más bajas para conservarlas y prolongar su tiempo de almacenamiento.

6. Limpieza del recipiente de reacción

1. Después de transferir las muestras digeridas a matraces aforuados de 50 ml, añadir 5,0 ml de HNO₃ al 68 % en peso y 5,0 ml de agua ultrapura con pipetas automáticas de 5 ml en los recipientes de reacción.
2. Cierre los recipientes de reacción con las tapas de la tapa e insértelos en la rejilla. Transfiera la rejilla a la cámara del horno microondas.
3. Aplicar el siguiente programa de microondas: aumento de 15 min a 160 °C, aumento de 10 min a 180 °C, potencia máxima 900 W.
4. Controle las condiciones de reacción durante el calentamiento. Una vez completado el calentamiento, deje que los recipientes de reacción se enfríen.
5. Abra el horno microondas, retire los recipientes de reacción de la rejilla y ábralos lentamente en la campana extractora.
6. Deseche el contenido de los recipientes de reacción en contenedores de residuos plásticos.
7. Enjuague los recipientes de reacción con agua ultrapura para eliminar cualquier exceso de material o productos químicos.
8. Seque los recipientes de reacción en la secadora a 105 °C antes del siguiente uso.
   NOTA: Se puede utilizar el mismo procedimiento de microondas (tiempo, potencia, gradiente de temperatura y volumen de productos químicos) utilizado para la digestión ácida de las muestras para limpiar los recipientes de reacción. Alternativamente, los recipientes de reacción se pueden limpiar sin el sistema de microondas sumergiéndolos en HNO₃ o HCl concentrado durante varias horas y enjuagándolos con agua ultrapura.

7. Determinación de elementos múltiples con ICP-MS

1. Saca del refrigerador los tubos de centrífuga de plástico de 50 ml que contienen las muestras digeridas y deja que se calienten a temperatura ambiente.
2. Diluir las muestras por un factor de 10 para disminuir la concentración de ácido en la muestra digerida y disminuir la concentración del componente de la matriz de la muestra. Con una pipeta automática, transfiera 2,50 ml de la muestra a un matraz aforado de vidrio de 25 ml y luego llénelo hasta la marca con agua ultrapura.
3. Transfiera las muestras diluidas a los tubos de plástico de 15 ml y colóquelas en las posiciones adecuadas en el muestreador automático.
4. Prepare el instrumento ICP-MS (ver Tabla de Materiales) para las mediciones:
   1. Encienda la ventilación y el enfriador que suministra agua de refrigeración al ICP-MS y enfría sus componentes.
   2. Utilice el software compatible para asegurarse de que la solución de enjuague (1 % en peso de HNO₃) fluya continuamente desde el muestreador automático hasta el ICP-MS sin pulsaciones.
   3. Cilindros de gas Open Ar (99,999% de pureza) y He (99,999% de pureza) para suministrar ambos gases al ICP-MS. Compruebe el flujo de gas en el software y ajústelo si es necesario.
      NOTA: Utilice la celda de colisión con gas He cuando se esperen interferencias espectrales debidas a la formación de iones poliatómicos (por ejemplo, ⁴⁰Ar¹⁶O⁺ que interfieren con ⁵⁶Fe⁺)³⁷.
   4. Ponga en marcha el plasma y calibre el instrumento utilizando la solución de afinación (consulte la Tabla de materiales).
   5. Una vez calibrado el instrumento (posición de la antorcha, voltaje de ganancia, voltaje de la lente, masa/resolución, calibración de pulso/analógico (P/A), calibración de base de datos (DB) y validación), seleccione el método de medición deseado y realice las mediciones.
5. Cuando se trabaja con muestras desconocidas, se realiza una determinación semicuantitativa para obtener información sobre qué elementos están presentes en la muestra y su concentración aproximada.
   NOTA: Es aconsejable diluir adicionalmente las muestras para la determinación semicuantitativa, ya que los detectores tienen un límite de concentración de elementos que pueden detectar a la vez. Las concentraciones de muestra más bajas pueden prolongar la vida útil de los componentes del instrumento.
6. Después de obtener los datos sobre las concentraciones aproximadas de los elementos en las muestras, cree un método para la determinación elemental cuantitativa en el software. Seleccione las condiciones de funcionamiento del ICP-MS (Tabla 1) y seleccione los elementos deseados (en este caso Cu, Fe, Mn y Zn). Determine el número y las concentraciones de soluciones del patrón necesarias para crear una curva de calibración (a veces denominada curva analítica o curva de trabajo) (Tabla 1).
   NOTA: Prepare al menos seis concentraciones diferentes como puntos de calibración para la curva de calibración.
7. Preparar soluciones de patrón para la curva de calibración. Utilizando pipetas automáticas, pipetear el volumen requerido de soluciones patrón multielemento de 100 mg/L en matraces volumétricos de vidrio de 25 mL, para preparar soluciones de patrones con las siguientes concentraciones: 1,0 μg/L, 2,5 μg/L, 5,0 μg/L, 10,0 μg/L, 20,0 μg/L, 30,0 μg/L, 40,0 μg/L y 50,0 μg/L. Llene los matraces hasta la marca con 1 % en peso de HNO₃. Además, prepare un blanco de calibración con la solución HNO₃ al 1 % en peso.
8. Transfiera las soluciones preparadas de patrón y muestras a los tubos de plástico de 15 ml, colóquelos en el muestreador automático y ponga en marcha el instrumento siguiendo el procedimiento descrito en el paso 7.4.
9. Realizar la medición cuantitativa de los elementos seleccionados utilizando la metodología de la curva de calibración.
10. Una vez completadas las mediciones, apague el plasma, cierre los suministros de gas Ar y He, apague el enfriador ICP-MS y apague el sistema de ventilación.

Homogeneización
Todas las muestras se secaron hasta obtener una masa constante con el secador de laboratorio para eliminar la humedad. La transferencia de la muestra a un desecador permitió que se enfriara a temperatura ambiente sin retener la humedad del entorno circundante. A continuación, las muestras de alimentos se homogeneizaron utilizando el mezclador de laboratorio para obtener un polvo fino. Las partículas homogeneizadas resultantes fueron uniformes en tamaño y distribuidas uniformemente, asegurando que las submuestras (muestras extraídas de una muestra más grande) utilizadas para la digestión ácida fueran representativas. Las muestras se podían extraer fácilmente del vaso mezclador con la ayuda de una espátula de plástico, excepto la muestra de carne seca, que era más difícil de eliminar debido a su mayor contenido de grasa. El mayor contenido de grasa hizo que la muestra se adhiriera parcialmente a las paredes de vidrio del vaso mezclador. La comparación de muestras frescas, secas y homogeneizadas se muestra en la Figura 2.

Los componentes del instrumento tuvieron que limpiarse varias veces con agua ultrapura para eliminar todas las partículas de comida que quedaban en la batidora.

Es esencial asegurarse de que la masa pesada de la muestra no supere el valor máximo permitido en los recipientes de reacción. El pesaje se realizó mediante una balanza analítica a temperatura constante, y se utilizó una espátula de plástico para evitar la contaminación con metales que puedan surgir de las espátulas metálicas.

Digestión ácida
Todas las muestras utilizadas en el protocolo fueron muestras de alimentos que contenían diversas cantidades de carbohidratos, proteínas y grasas. El HNO3, en combinación con elH2O2, es adecuado para la digestión de estas moléculas, y no se requieren otros productos químicos. Los productos químicos se trataron en una campana extractora, ya que el HNO3 forma humos. Después de agregar los productos químicos en los recipientes de reacción TFM-PTFE, se montaron tapas de cubierta en la parte superior de los recipientes de reacción y se sellaron bien para evitar una posible contaminación y pérdida de analito. Los recipientes de reacción se distribuyeron simétricamente en el bastidor para garantizar una irradiación de microondas uniforme dentro del sistema de microondas.

Durante la digestión ácida, la puerta del sistema de microondas estaba cerrada y la puerta no se podía abrir hasta el final del protocolo. Todo el proceso de digestión ácida se puede monitorear en la pantalla del dispositivo, mostrando el cambio de temperatura con el tiempo (Figura 7).

Una vez completada la digestión ácida y enfriadas las soluciones de las muestras digeridas a temperatura ambiente, se abrieron los recipientes de reacción en la campana extractora. Se abrieron lo más lentamente posible. Si la presión se libera demasiado rápido, incluso pequeñas gotas de la mezcla de reacción pueden escapar, lo que resulta en la pérdida de analito. Cuando se abrieron los recipientes de reacción, se liberó un gas amarillo o amarillo-anaranjado (Figura 8). La coloración de los humos se puede atribuir al NO2, que forma humos anaranjados a temperaturas más altas. El aumento de presión en los recipientes de reacción se debió a la oxidación de las muestras de alimentos conHNO3, lo que resultó en la formación de gases como CO2,H2O, NO, etc. Después de desgasificar los recipientes de reacción, una solución de color amarillo claro o incolora de la muestra digerida permaneció en el recipiente de reacción, lo que indica que se había logrado una digestión ácida total por MAWD. Esto se confirmó aún más por la ausencia de partículas visibles dejadas en la solución.

El paso final de la preparación de la muestra consistió en diluir las muestras digeridas con agua ultrapura para reducir la acidez residual (AR). Los valores altos de RA interfieren con las mediciones al aumentar la señal de fondo. La dilución también disminuye la concentración de iones metálicos en la muestra líquida26. Al transferir la solución de muestras digeridas a matraces aforados, los componentes del recipiente de reacción se enjuagaron a fondo con agua ultrapura para transferir completamente el analito. Un problema que se produce es que pequeñas gotas de agua ultrapura, que pueden contener el analito de interés, se adhieren a las paredes de los recipientes de reacción. Después de la dilución con agua ultrapura hasta la marca de 25 ml, todas las muestras se volvieron incoloras. Las soluciones finales de las muestras digeridas contenían sales solubles en agua, ya que los elementos metálicos presentes en la muestra reaccionaban conHNO3 para formar nitratos altamente solubles. Las técnicas de análisis elemental pueden determinar los iones metálicos que forman las sales solubles en agua. Al filtrar las soluciones diluidas, es importante desechar las primeras gotas para asegurarse de que se eliminen las partículas o contaminantes. Después de la filtración, las soluciones se sellaron herméticamente para evitar fugas y luego se almacenaron en el refrigerador.

La principal limitación del procedimiento de digestión ácida es el rendimiento de las muestras. El sistema MAWD solo puede digerir un número limitado de muestras a la vez. Además, cada paso de digestión y posterior preparación de la muestra puede tardar varias horas en completarse. Además, la limpieza de los recipientes de reacción también requiere mucho tiempo, pero es crucial para minimizar el riesgo de contaminación cruzada entre muestras.

Determinación de elementos múltiples con ICP-MS
Para cada elemento, se construyó una curva de calibración. Se obtuvieron graficando la intensidad en función de las concentraciones de analitos (Figura 9). Los rangos de concentración lineal para todos los elementos medidos estuvieron en el rango de 1,0 μg/L a 50,0 μg/L.

El LOD y el LOQ para cada elemento se calcularon utilizando la Ecuación 1 y la Ecuación 2, respectivamente. En ambas ecuaciones, sen blanco representa la desviación estándar de las diversas mediciones de calibración en blanco (10 repeticiones)38,39, mientras que b1 representa la pendiente de la curva de calibración.

(1)

(2)

Los LOD obtenidos fueron 0,5 ng/L, 2,8 ng/L, 2,8 ng/L y 3,2 ng/L para Mn, Cu, Fe y Zn, respectivamente. Los LOQ obtenidos fueron 1,6 ng/L, 9,2 ng/L, 9,5 ng/L y 10,8 ng/L para Mn, Cu, Fe y Zn, respectivamente.

Se realizaron seis digestiones repetidas de cada muestra. Se realizaron tres digestiones repetidas de cada muestra sin añadir la muestra con soluciones de patrón, y se realizaron tres digestiones repetidas con la adición de una solución de una cantidad conocida de analito patrón para probar la exactitud (prueba de recuperación de picos40) y la precisión de toda la metodología. Para determinar la precisión antes del procedimiento de digestión, se pipetearon 37,5 μL de solución estándar multielemento ICP de 100 mg/L en los recipientes de reacción que contenían la muestra, lo que dio como resultado un aumento de la concentración de 15,0 μg/L en muestras enriquecidas que se diluyeron en un factor de 10. Esto también correspondió a un aumento de 15,0 μg por gramo de muestra por cada ion metálico medido. La exactitud y la precisión se determinaron mediante Rec y desviación estándar relativa (RSD), respectivamente.

La precisión de un método analítico puede evaluarse mediante la prueba de recuperación de la espiga. Para ello, se añade a la muestra una solución de una cantidad conocida de patrón de analito, que luego se digiere en las mismas condiciones de reacción que las muestras que no están enriquecidas41. El Rec se calcula utilizando la Ecuación 3, donde γ i es la concentración medida de las muestras enriquecidas después de la digestión, mientras que γt representa la concentración determinada de la muestra sin espiga considerando el aumento de la solución añadida del patrón analicto. Los γi y γt son promedios de las tres réplicas. Se considera que el método analítico es preciso cuando Rec se encuentra en el rango de 80,00%-120,00%42.

(3)

La precisión de un método analítico se evalúa con RSD. Describe la cercanía de concordancia entre los resultados independientes, que se obtuvieron a través de varias mediciones replicadas. La DSR se calcula utilizando la Ecuación 4, donde sm representa la desviación estándar de las mediciones repetidas para la determinación de la concentración, mientras que representa el valor promedio de las concentraciones determinadas. El método analítico se considera preciso si el valor de RSD es inferior al 20,00%43.

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Todas las muestras se diluyeron con agua ultrapura en un factor de 10 antes de las mediciones de ICP-MS (para el primer conjunto de mediciones). La dilución disminuyó la concentración de los componentes de la matriz introducidos en el analizador. Además, al diluir la muestra, la AR disminuye. Una AR alta podría comprometer la eficiencia de la ionización del plasma o provocar problemas de interferencia en la matriz. Si la concentración de los analitos después de la primera serie de mediciones es inferior al límite de detalle, el factor de dilución debe ser inferior a 10. La cuantificación de los iones metálicos se llevó a cabo mediante una curva de calibración. Los valores de los resultados calculados deben tener la misma precisión (el mismo número de cifras significativas) que la solución del patrón empleado para la calibración. El contenido de iones metálicos en la muestra se expresó como μg por gramo de peso (μg/g). Esto se logró multiplicando la concentración másica medida de la muestra analizada por el factor de dilución para obtener la concentración en la muestra digerida original. A continuación, esta concentración de masa se multiplicó por el volumen de la muestra digerida (25 ml) y luego se dividió por la masa pesada inicial de la muestra homogeneizada (la masa ponderada inicial es la masa de la muestra que se pesó en el recipiente de reacción para el MAWD). Todos los valores se notifican como un promedio de tres réplicas.

El contenido de los elementos que figuran a continuación se indica como ± sm. El contenido de Cu, Mn y Zn en la muestra de brócoli fue de 5,9 ± 0,5 μg/g, 32,5 ± 2,7 μg/g y 42,8 ± 0,2 μg/g, respectivamente. La concentración másica determinada de Fe en muestras de brócoli superó el límite superior del rango de concentración lineal de la curva de calibración (es decir, 50,0 μg/L). Por lo tanto, la solución de la muestra se diluyó con agua ultrapura en un factor de 2, y se realizó la medición ICP-MS de esta solución. Los resultados mostraron que el brócoli contenía 63,0 ± 1,9 μg/g de Fe.

Para el hongo, el contenido de Zn, Fe, Cu y Mn fue de 35,6 ± 1,4 μg/g, 30,4 ± 1,3 μg/g, 18,5 ± 1,0 μg/g y 5,4 ± 0,3 μg/g, respectivamente. Las salchichas contenían 42,2 ± 0,9 μg/g de Fe, 25,1 ± 2,6 μg/g de Zn y 1,0 ± 0,1 μg/g de Cu. La determinación multielemento con ICP-MS de la solución digerida, que se diluyó 10 veces, mostró que la concentración de Mn era inferior al límite inferior del rango de concentración lineal (es decir, 1,0 μg/L). Por lo tanto, la solución original de la muestra de salchicha se diluyó solo en un factor de 5 y se repitió la determinación de elementos múltiples con ICP-MS. Se determinó que el contenido de Mn en las muestras de salchichas era de 0,9 ± 0,3 μg/g. Los fideos contenían 5,4 ± 2,8 μg/g de Zn, 10,3 ± 1,2 μg/g de Fe, 1,6 ± 0,3 μg/g de Cu y 7,5 ± 0,2 μg/g de Mn.

El Rec para todos los analitos medidos en las cuatro muestras estuvo en el rango de 80,00%-120,00%, lo que indica la precisión del método analítico. Los cálculos mostraron que el método analítico era preciso, ya que los valores de RSD estaban por debajo del 20,00%, aparte de la RSD para Zn en muestras de fideos. Los resultados se presentan en la Tabla 2.

Figura 1: Mezclador de laboratorio utilizado para la homogeneización de muestras de alimentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Comparación de muestras frescas, secas y homogeneizadas. (A-D) Muestras frescas de brócoli, champiñones, salchichas y fideos. (E-H) muestras secas de brócoli, champiñones, salchichas y fideos. (I-L) muestras homogeneizadas de brócoli, champiñones, salchichas y fideos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Pesaje de la muestra en una balanza analítica. Esto se realiza desde arriba abriendo la solapa superior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Sistema de microondas. El sistema de microondas para la digestión ácida con pantalla táctil lateral para seleccionar las condiciones de reacción y controlar el proceso de digestión ácida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Componentes utilizados para la digestión ácida asistida por microondas. (A) Rejilla con 14 recipientes de reacción para la digestión ácida dentro de la cámara del horno microondas. (B) Los recipientes de reacción TFM-PTFE constan de 3 partes. Una vez que los recipientes están cerrados con tapas, ni la muestra ni los gases pueden escapar o entrar en los recipientes de reacción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: El interior de los recipientes de reacción cuando se abren en la campana extractora. (A) La coloración amarillo-anaranjada de los humos se debe al NO2 producido durante la digestión ácida. (B) La coloración amarilla de la solución de la muestra digerida después de que la mayoría de los gases hayan escapado del recipiente de reacción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Cambio de temperatura con el tiempo. Un gráfico que muestra el cambio de temperatura en función del tiempo durante la digestión ácida con MAWD. T2 representa la temperatura de la mezcla de reacción dentro de los recipientes de reacción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Apertura de los recipientes de reacción debajo de la campana extractora, donde se liberan los gases amarillo-anaranjados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Ejemplo de una curva de calibración para Mn. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Instrumento ICP-MS utilizado para la determinación de elementos múltiples. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Cuadro 1: Condiciones de funcionamiento del instrumento ICP-MS. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Valores de Rec y RSD de brócoli, champiñones, salchichas y fideos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Los autores no tienen nada que revelar.