Artículo de método

Mejora de la fiabilidad de los biobancos de tumores de próstata con una técnica de muestreo y caracterización histológica mejoradas

DOI:

10.3791/65635

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17 de noviembre de 2023

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1Department of Pathology, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, 2Department of Urology, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, 3Biobanco La Fe, Instituto de Investigación Sanitaria La Fe, 4Department of Medicine, Jaume I University of Castellon, 5Department of Surgery, University of Valencia, 6Department of Pathology, University of Valencia

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un método para facilitar la recolección de muestras de prostatectomía radical. El objetivo es mapear, caracterizar y micro-macro diseccionar muestras de tejido de los especímenes en base a criterios anatomopatológicos antes de almacenarlas en un Biobanco.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La adquisición de muestras de tejido tumoral frescas y bien caracterizadas es fundamental para realizar estudios "ómicos" de alta calidad. Sin embargo, puede ser particularmente desafiante en el contexto del cáncer de próstata (CP) debido a la naturaleza única de este órgano y la alta heterogeneidad asociada con este tumor. Por otro lado, caracterizar histopatológicamente las muestras antes de su almacenamiento sin causar alteraciones significativas en los tejidos también es un desafío intrigante. En este contexto, presentamos un nuevo método de adquisición, mapeo, caracterización y microdisección de tejido prostático resecado basado en criterios anatomopatológicos.

A diferencia de los protocolos publicados anteriormente, este método reduce el tiempo necesario para el análisis histopatológico de la muestra prostática sin comprometer su estructura, que es crucial para evaluar los márgenes quirúrgicos. Además, permite la delineación y micro-macro disección de muestras frescas de tejido prostático, con un enfoque en áreas tumorales histológicas definidas por criterios patológicos como la puntuación de Gleason, lesiones precursoras (neoplasia intraepitelial prostática de alto grado - PIN) y lesiones inflamatorias (prostatitis). Estas muestras se almacenan en un Biobanco para su posterior análisis de investigación.

Introducción

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El cáncer de próstata (CP) es el2º cáncer más frecuente en hombres y la5ª causa de muerte en todo el mundo1. El tratamiento y el pronóstico del paciente dependen de la estadificación y el grado (puntuación de Gleason) del tumor, como lo demuestran las tasas de supervivencia a 5 años más altas de los tumores localizados y de grado bajo (grado 6 de Gleason) (99%) en comparación con los grados de Gleason altos y los tumores metastásicos (31%)2.

La recidiva local del CP y el fracaso del tratamiento se han relacionado con la alta heterogeneidad genética intratumoral característica de este tumor tipo3. Además, se considera que el CP es una enfermedad multifocal con varios focos tumorales que exhiben diferentes características morfológicas, histológicas y moleculares4, que pueden originarse de forma independiente o derivar de un ancestro común de las células tumorales5. Estudios previos han demostrado que la evolución del tumor difiere entre los pacientes en función de factores genéticos específicos que pueden promover la metástasis o confinar el linaje celular a la próstata5. Por lo tanto, la caracterización molecular de los diferentes focos tumorales es crucial no solo para proporcionar un diagnóstico y pronóstico más precisos, sino también para adaptar un tratamiento eficaz y personalizado para el paciente.

En este contexto, la investigación biomédica y los enfoques multiómicos integradores ofrecen oportunidades sin precedentes para clasificar los cánceres en diferentes subtipos, identificar biomarcadores diagnósticos y pronósticos, y descubrir marcadores relacionados con la respuesta al tratamiento. Además, estos abordajes contribuyen a una mejor comprensión de la biología de esta enfermedad 6,7. Las muestras biológicas, ya sean tejidos o biofluidos, pueden analizarse utilizando diversas plataformas multiómicas (genómica, transcriptómica, proteómica, metabolómica, etcétera) para descubrir las características biológicas que subyacen a la fisiopatología del cáncer, abordando así las limitaciones actuales relacionadas con la heterogeneidad genética y fenotípica6. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la calidad de los datos derivados de los estudios ómicos depende de la calidad de las muestras recogidas de los tumores, de su caracterización precisa y de su posterior procesamiento y almacenamiento8.

En este contexto, la obtención de tejido fresco de CP para la investigación presenta un desafío metodológico debido a la dificultad de la toma de muestras tumorales exitosas9. Los métodos previos incluían la toma de muestras aleatorias después de una prostatectomía radical, con malos resultados10. Sin embargo, los enfoques más recientes incorporan protocolos dirigidos basados tanto en imágenes de resonancia magnética (RM) como en datos de biopsia, lo que resulta en una mayor eficacia en la recolección de muestras tumorales11.

Por otro lado, la caracterización histopatológica de las muestras antes de su almacenamiento sin alteraciones significativas de los tejidos también plantea un reto interesante. En consecuencia, en muchos casos, la determinación histopatológica de las muestras se realiza después de su análisis (p. ej., análisis metabolómico de RMN HR 1H)12. Esta práctica conlleva gastos innecesarios, consumo de tiempo y la pérdida de un número importante de muestras que finalmente se excluyen del análisis (por ejemplo, muestras que, tras el análisis histopatológico, resultan no ser muestras tumorales). En otros casos, la caracterización histopatológica de las muestras se realiza antes de su análisis. De hecho, algunos estudios previos han intentado estandarizar métodos para proporcionar muestras de investigación representativas de alta calidad a partir de especímenes de prostatectomía radical para genómica y metabolómica13,14. Sin embargo, la eficiencia del muestreo es significativamente mayor cuando se realiza a partir de secciones ya confirmadas histológicamente (88%) que rompen el tejido, en comparación con cuando se realiza a partir de secciones no confirmadas (45%)1.

Aquí, se presenta una nueva metodología para superar estas limitaciones, con el objetivo de obtener muestras de PC frescas y bien caracterizadas antes de su almacenamiento en el Biobanco. Este método se ha desarrollado a través de esfuerzos colaborativos entre diferentes servicios clínicos (Urología, Anatomía Patológica y el Biobanco del Hospital La Fe). Es importante destacar que los Biobancos desempeñan un papel esencial en la recolección, procesamiento, conservación y almacenamiento de muestras biológicas, garantizando la alta calidad de las muestras y los datos, así como el cumplimiento de los requisitos éticos y legales 8,15,16.

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Protocolo

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Este método se desarrolló a través de esfuerzos colaborativos que involucraron a diferentes servicios clínicos (Urología, Anatomía Patológica y el Biobanco del Hospital La Fe). El estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano, y recibió la aprobación del Comité de Ética para la Investigación Biomédica del Instituto de Investigación Sanitaria Hospital Universitario y Politécnico La Fe (Valencia, España). Todas las muestras se almacenaron en el Biobanco del Hospital La Fe (PT13/0010/0026). El procedimiento general se detalla en la Figura 1.

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Figura 1: Esquema general del procedimiento. Representación esquemática del procedimiento escalonado descrito en la sección de protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Focalización tumoral

  1. Antes de la cirugía, utilice imágenes de resonancia magnética multiparamétricas o biparamétricas (mpMRI o bpMRI)17,18 para localizar el tumor y mapear su posición dentro de la glándula prostática. Combinar la información obtenida de la resonancia magnética con los hallazgos de la ecografía transrectal o del tacto rectal si este último arroja resultados discordantes.
  2. Para mejorar la localización del tumor, se deben revisar los resultados de las biopsias de próstata transrectales preoperatorias guiadas por ecografía y por resonancia magnética.
    NOTA: En el procedimiento diagnóstico del cáncer de próstata, las biopsias se toman directamente de la próstata por vía transrectal. Estas biopsias incluyen la toma sistemática de muestras de la próstata (con cilindros distribuidos por toda la glándula) y cilindros dirigidos directamente a los hallazgos sospechosos en la resonancia magnética. Para orientar la recuperación de estas muestras, se utiliza la ecografía transrectal, que se combina con los hallazgos de la resonancia magnética de forma cognitiva («fusión cognitiva») o con un «software de fusión de resonancia magnética y ecografía real» cuando esté disponible.

2. Prostatectomía radical y recolección de próstata

  1. Realizar una prostatectomía radical estandarizada asistida por robot mediante abordaje transperitoneal, siguiendo los pasos descritos por Huynh et al.19.
    1. Comience con el acceso abdominal, la insuflación y la colocación del puerto de la cámara (consulte la tabla de materiales). Coloque los cinco puertos restantes bajo visión directa. Ajuste el neumoperitoneo a 12 mm.
    2. Liberar la vejiga mediante una incisión en el peritoneo y diseccionar el espacio perirrectal.
    3. Abra la fascia pélvica a cada lado.
    4. Realizar una disección completa de los aspectos anterior y lateral de la próstata y la vejiga.
    5. Realizar la apertura del cuello vesical, identificar y seccionar la uretra proximal para acceder a las caras posteriores de la próstata y la vejiga.
    6. Diseccionar las vesículas seminales y el espacio recto19.
    7. Diseccionar los aspectos laterales de la próstata, preservando los haces neurovasculares.
    8. Asegurar la hemostasia de los vasos en el espacio retropúbico.
    9. Diseccionar el ápice y seccionar la uretra distal.
    10. Completar la anastomosis vesicouretral.
    11. Extraer la próstata y realizar el cierre de la incisión19.
  2. Recoja la próstata fresca en un recipiente seco. Es crucial no fijar ni incrustar la muestra en parafina.
  3. Transportar la muestra quirúrgica fresca, que incluye toda la próstata, al Biobanco para el procesamiento de la muestra.

3. Procesamiento de la próstata y recogida de muestras

  1. Seleccione las zonas de próstata objetivo para la toma de muestras en función de la información sobre la ubicación del tumor obtenida de la resonancia magnética nuclear preoperatoria, los resultados de la biopsia preoperatoria y la palpación directa de la muestra de prostatectomía. Registre esta información en un formulario que incluya los datos de identificación del paciente, las áreas de próstata finalmente muestreadas y el número de muestras recolectadas.
    NOTA: Cuando los hallazgos de la resonancia magnética, los resultados de la biopsia preoperatoria y la palpación directa de la muestra de prostatectomía coincidan con la resonancia magnética, dirija todas las muestras a esa o esas ubicaciones (entre 4 y 6 cilindros). Si hay alguna discordancia, aumente el número de cilindros y apunte por separado a todas las zonas que sean sospechosas de estar afectadas por cualquiera de esos métodos.
  2. Utilice una aguja automática desechable (cirujano) para extraer muestras cilíndricas de las áreas seleccionadas (paso 1.1). Luego, identifique (patólogo) la zona exterior del cilindro, sujete el cilindro con pinzas de tejido, colóquelo en un portaobjetos y marque la zona exterior con tinta de tejido. Repita este proceso con todos los cilindros tomados.
  3. Coloque los cilindros recolectados horizontalmente en un disco portamuestras (consulte la Tabla de materiales) lleno de medio de inclusión de criostato y transfiéralos a la placa de enfriamiento del micrótomo para su corte.
  4. Una vez colocado en la platina, fije el disco portamuestras al portamuestras y córtelo con movimientos cuidadosos de la rueda siguiendo los siguientes pasos:
    1. Utilice el compuesto de temperatura de corte óptimo (compuesto OCT, consulte la Tabla de materiales) para incrustar la muestra de tejido antes de la sección congelada en un micrótomo-criostato.
    2. A continuación, corte la muestra con un micrótomo criostato a -25 °C. Recoja secciones delgadas de tejido en forma de cilindro (10 μm) en portaobjetos de microscopio tratados. Asegúrese de recolectar solo unas pocas micras de tejido para garantizar una cantidad adecuada de tejido tumoral intacto para su almacenamiento en el Biobanco.
    3. Reúna dos o tres secciones delgadas por portaobjetos y tiña manualmente para controlar la coloración final. El ojo del técnico garantiza una tinción óptima y se puede volver a teñir cualquier cosa necesaria. Siga estos pasos:
      1. Fije los portaobjetos en etanol al 96%, hidrátelos en agua destilada y tiña con hematoxilina Harris (consulte la tabla de materiales) durante 1 minuto para teñir los núcleos. Elimine el exceso de hematoxilina enjuagando los portaobjetos con agua destilada.
      2. Trate los portaobjetos con hidróxido de amonio al 30% para que la hematoxilina se vuelva azul. Retire el exceso de solución con enjuagues de agua destilada.
      3. Manchar portaobjetos con eosina (ver Tabla de Materiales) durante 30 s.
      4. A continuación, deshidrate los portaobjetos con valoraciones crecientes de alcohol, transparentes con xileno (100%) y móntelos con DPX (una mezcla de disestireno, un plastificante, y xileno, utilizado como medio de montaje de resina sintética que reemplaza al bálsamo de xileno, consulte la Tabla de materiales). Durante estos pasos, sumerja los portaobjetos y retírelos del frasco de la solución de Coplin.
      5. Por último, coloque un cubreobjetos sobre el tejido teñido y utilice un medio con un índice de refracción adecuado (véase la Tabla de materiales) para observarlo al microscopio.

4. Caracterización de la muestra

  1. Analizar la muestra bajo un microscopio óptico (patólogo), discriminando las áreas de carcinoma y determinando la puntuación de Gleason del tumor. Documente todos estos datos y marque las zonas tumorales precisas en los portaobjetos.
  2. Durante este paso, etiquete el portaobjetos con la ubicación precisa del tumor y su respectivo Gleason Score20. Además, marcar la localización de la PIN (Neoplasia Intraepitelial Prostática) en base a la identificación morfológica.

5. Micro-macro-disección y almacenamiento de muestras

  1. Marque claramente los diferentes componentes histológicos con marcadores distintos en el portaobjetos (patólogo) y correlacione directamente con el tejido congelado en el disco.
  2. A continuación, con una cuchilla quirúrgica, se diseccionan macro-micro las áreas de la muestra marcadas en el portaobjetos dentro del disco OCC, dividiéndolas en tejido tumoral, peritumoral, PIN y prostático normal.
  3. A medida que el medio de inclusión comience a descongelarse, manipule el tejido con pinzas y colóquelo en criotubos correctamente etiquetados.
    NOTA: Almacene cuidadosamente cada fragmento disecado dentro del tubo correspondiente, siguiendo el diagnóstico histológico de los crio-cortes.
  4. Almacene los criotubos marcados con muestras histológicas completamente caracterizadas en el Biobanco a -80 °C para su uso posterior en estudios de investigación.
    NOTA: Los pasos descritos en esta sección pueden ser realizados por un técnico capacitado bajo la supervisión del patólogo. La muestra quirúrgica debe transportarse al Biobanco lo antes posible para evitar la degradación de los tejidos y los ácidos nucleicos. De acuerdo con las guías de referencia, se deben realizar esfuerzos para evitar el tiempo de isquemia prolongado (>30 min)21. Las muestras pueden conservarse en el Biobanco indefinidamente siempre que se mantengan los principios de calidad de la muestra.

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Resultados

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Los resultados revelan que esta técnica ha permitido obtener material tumoral en el 61% de los casos estudiados (25 de 41 casos) (Tabla 1).

Tabla 1: Datos histopatológicos de las muestras estudiadas. Resumen de los datos histopatológicos de las muestras utilizadas en el estudio. El cilindro de diagnóstico se refiere a la muestra de biopsia de próstata obtenida con fines diagnósticos, mientras que el cilindro procesado corresponde al cilindro obtenido de la mue...

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Discusión

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En cualquier estudio de investigación, la obtención de muestras de calidad es un requisito esencial para reducir los sesgos sistemáticos y obtener resultados fiables22. Por lo tanto, el control de variables preanalíticas como la temperatura a la que se procesan y almacenan las muestras, el tiempo transcurrido desde la recolección de la muestra hasta el almacenamiento, el uso de materiales esterilizados o los efectos que la adición de conservantes u otros aditivos puede tener en las muestras deben ...

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Divulgaciones

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Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.L. reconoce un contrato postdoctoral "Margarita Salas" (número 21-076), y MAM-T un contrato de investigación "María Zambrano" (número MAZ/2021/03 UP2021-021). Ambos contratos han sido financiados por la Unión Europea-Next generation EU.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pinza CadiereIntuitivePN1052082-US 10/2021 Número dereferencia: 471049. 18 usos.
Portaobjetos convencionalesKnittel Glass2021Ground/ Frosted end
Cryostat MicrotomoThermo Fisher Scientific---Criostato CryoStar NX50
CryotubesGreiner Bio-One GmbHRef.: 122280.CRYO S. PP, con tapón de rosca, estéril.
Sistema quirúrgico Da VinciIntuitivePN1052082-US 10/2021XI modelo Instrumentos
disecciónBayer---Dos pinzas y una cuchilla quirúrgica 
DPX Eukitt Medizin- und Labortechnik GmbH6.00.01.0001.06.01.01
EosinAgilent157252
Pinzas bipolares fenestradasIntuitivePN1052082-US 10/2021 Número depieza: 471205. 14 vidas.
Fuerza bipolarIntuitivoPN1052082-US 10/2021 Número depieza: 471405. 12 usos.
CongeladoresThermo ScientificMODELO 907. -80 º C
HematoxilinaAgilent157251
Portaobjetos de inmunohistoquímicaAgilent-DakoK802021-2
Destornillador de aguja grandeIntuitivoPN1052082-US 10/2021Número de pieza: 471006. 15 usos.
Pinza bipolar MarylandIntuitivePN1052082-US 10/2021Número de pieza: 471172. 14 usos.
MicroscopioOlympus---Olympus cx40
Hojas de micrótomoPFM Medicala35
Tijeras curvas monopolaresIntuitivePN1052082-US 10/2021Número de pieza: 470179. 10 usos.
Compuesto OCTNEG-50LOT.117340
PlusSpeed S Dispositivo de biopsia de un solo uso con punta biseladaPeter Pflugbeil GmbH PSS-1825-S
Pinza ProGaspIntuitivePN1052082-US 10/2021Número de pieza: 471093. 18 usos.
Portamuestras DiscDavidson Cryo Chuck. BradleyProductos30 mm 
Tinta de sedaPelikan2021Tinta 4001 negro brillante (301168)
XylolQuimipurRef. 169
de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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