Toma de muestras de líquido cefalorraquídeo y sangre de la vena lateral de la cola en ratas durante los registros de EEG

La toma de muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR) y sangre son importantes para identificar y validar biomarcadores de epilepsia, tanto en la investigación preclínica como en la clínica ^1,2. Hoy en día, el diagnóstico de la epilepsia y la mayor parte de la investigación sobre biomarcadores de epilepsia se centra en el EEG y la neuroimagen ^3,4,5. Estos enfoques, sin embargo, presentan varias limitaciones. Además de las mediciones rutinarias del cuero cabelludo, en muchos casos, el EEG requiere técnicas invasivas como electrodos de profundidad⁶. Los métodos de imagen cerebral tienen poca resolución temporal y espacial y son relativamente caros y requieren mucho tiempo ^7,8. Por esta razón, la identificación de biomarcadores no invasivos, de bajo costo y basados en biofluidos proporcionaría una alternativa muy atractiva. Además, estos biomarcadores de biofluidos podrían combinarse con los enfoques diagnósticos disponibles para mejorar su capacidad de predicción.

Los pacientes diagnosticados de epilepsia son sometidos rutinariamente a EEG ^9,10 y muestras de sangre 11,12,13,14, y muchos también a la retirada del LCR para excluir causas potencialmente mortales (i.e., infecciones agudas, encefalitis autoinmune)¹⁵. Estas muestras de sangre y LCR se pueden utilizar en investigaciones clínicas con el objetivo de identificar biomarcadores de epilepsia. Por ejemplo, Hogg y sus colaboradores han encontrado que un aumento en tres fragmentos plasmáticos de ARNt precede a la aparición de convulsiones^{en la} epilepsia ^humana. Del mismo modo, los niveles de interleucina-1beta (IL-1β) en el LCR y el suero humanos, expresados como proporción de los niveles de IL-1β en el LCR sobre el suero, pueden predecir el desarrollo de epilepsia postraumática después de una lesión cerebral traumática¹⁶. Estos estudios destacan la importancia del muestreo de biofluidos para la investigación de biomarcadores de epilepsia, pero enfrentan múltiples limitaciones intrínsecas a los ensayos clínicos, por ejemplo, el factor cofundador de los fármacos antiepilépticos (FAE) en sangre, la frecuente falta de información etiológica, los controles inadecuados, el número modesto de pacientes y otros^17,18.

La investigación preclínica ofrece otras oportunidades para investigar moléculas en biofluidos como posibles biomarcadores de epilepsia. De hecho, es posible extraer plasma y/o LCR de animales mientras se realizan registros de EEG. Además, el muestreo se puede realizar repetidamente a lo largo de varios días del experimento, y se puede utilizar una serie de controles emparejados por edad, sexo y agresiones epilépticas para mejorar la solidez del estudio. Aquí, se describe en detalle una técnica flexible para obtener LCR de cisterna magna con extracción paralela de plasma de la vena de la cola en ratas monitoreadas por EEG. La técnica presentada tiene varias ventajas sobre los métodos alternativos. Mediante el uso de un enfoque de aguja de mariposa, es posible recolectar LCR varias veces sin comprometer la función de los electrodos de EEG o implantes de cabeza similares. Esto representa un refinamiento de los procedimientos de retirada del catéter intratecal, que se asocian con un riesgo relativamente alto de infección. Además, el enfoque de caída libre utilizado para la extracción de sangre es superior a otros enfoques de extracción de sangre en la vena de cola debido al riesgo altamente reducido de hemólisis, debido al hecho de que la sangre no pasa a través de tubos y no se aplica presión de vacío. Si se realiza en condiciones estrictas libres de gérmenes, existe un riesgo particularmente bajo de infección para los animales. Además, al iniciar las extracciones de sangre al final de la cola de los animales, el muestreo se puede repetir varias veces. Estas técnicas son fáciles de dominar y se pueden aplicar en muchos estudios preclínicos de trastornos del sistema nervioso central.

Todos los procedimientos experimentales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Ferrara y por el Ministerio de Salud italiano (autorización: D.M. 603/2022-PR) de acuerdo con las directrices descritas en la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas de 24 de noviembre de 1986 (86/609/CEE) sobre la protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos. Este protocolo se ajusta específicamente para análisis adicionales de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) de pequeños ácidos ribonucleicos no codificantes (sncRNA) en el LCR de rata y plasma obtenidos bajo control de EEG en animales epilépticos. A su elección, vea el video de JoVE relacionado para una mejor comprensión y mejoras de la cirugía 19,20,21.

1. Preparación de animales para implantación quirúrgica de electrodos o telémetros

NOTA: La técnica de cirugía estereotáxica varía según el sistema de EEG utilizado. La siguiente sección de métodos proporciona una descripción de los pasos que son comunes para los dos tipos de cirugías.

1. Utilice ratas Sprague-Dawley (SD) (machos, de 7 a 8 semanas de edad, con un peso de 250 a 290 g) mantenidas de acuerdo con las leyes locales para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Alojar a los animales en condiciones estándar con libre acceso a comida y agua potable.
2. Proceda con el manejo de las ratas durante unos días antes de la cirugía y los procedimientos del protocolo experimental.
3. Utilizar un aparato estereotáxico para la implantación de electrodos o telémetros. Siga los estándares contemporáneos para cirugías asépticas. Utilice electrodos y transmisores estériles y que funcionen bien.
4. Afeita la cabeza del animal con la maquinilla de afeitar eléctrica. Inducir la anestesia en el animal con la mezcla de ketamina (45 mg/kg) y xilacina (7,5 mg/kg) administrada por vía intraperitoneal (i.p.), luego añadir la anestesia isoflurano (1,4% en aire; 1,2 mL/min) administrada a través de una máscara facial y fijar la cabeza del animal en el aparato estereotáxico.
5. Asegure la profundidad adecuada de la anestesia probando el reflejo de retirada del pedal después de pellizcar las almohadillas de los pies en las patas traseras de ambos animales y mantenga la anestesia con isoflurano hasta el final de la cirugía. Compruebe regularmente la profundidad anestésica durante todo el procedimiento.
6. Aplique una cantidad suficiente de ungüento ocular en los ojos de ambos animales para evitar daños en la córnea debido a la pérdida del reflejo de parpadeo causada por la anestesia.
7. Limpiar a fondo el cuero cabelludo del animal con desinfectante líquido y realizar un corte longitudinal de 2 cm de largo con un bisturí esterilizado. Abra el cuero cabelludo y aplique clips quirúrgicos en los colgajos de piel para mantenerlo abierto.
8. Suavemente, separe el periostio para exponer el bregma y el área del cráneo a través de la cual se insertará el electrodo de registro.

2. Implantación quirúrgica de electrodos anclados

NOTA: Antes de establecer el procedimiento de extracción de LCR por punción de este protocolo (ver paso 9 para más detalles), se realizaron extracciones repetidas de LCR a través de una cánula guía en algunas ratas no anestesiadas que se movían libremente. Se utilizaron animales canulados a los que se les implantaron electrodos atados para evaluar el impacto de los implantes de doble cabezal en el registro de EEG a largo plazo junto con múltiples muestras de LCR. En estos experimentos específicos, a las ratas se les implantó una cánula guía ficticia colocada en la cisterna magna, cuya punta se insertó 7 mm en ella estereotácticamente, de acuerdo con protocolos publicados previamente²². Los abordajes de la cirugía de doble implante fueron similares a los adoptados por algunos trabajadores en el pasado para las cánulas guía de microdiálisis y el implante de electrodos atados^23,24.

1. Use un brazo del marco estereotáxico, monte el portaelectrodos en él y coloque el electrodo en posición vertical en el soporte. Mueva la punta del electrodo exactamente por encima del bregma. Anota las coordenadas anteroposteriores y mediolaterales del bregma y tradúcelas a las coordenadas deseadas.
2. Baje el electrodo hasta que su punta casi toque el cráneo. Marque el punto de perforación y taladre el cráneo en el lugar marcado. Tenga cuidado de no dañar el cerebro y las meninges.
3. Haz cuatro o más agujeros para anclar los tornillos y atorníllalos en el cráneo. Preste atención al tamaño del electrodo al hacer los orificios para los tornillos de anclaje. El tamaño del electrodo no debe interferir con los tornillos de anclaje colocados.
4. Baje lentamente el brazo estereotáctico que lleva el electrodo en el eje dorsoventral, ingrese al tejido cerebral y deténgase en la posición deseada. Fije el cable de tierra del electrodo alrededor de uno de los tornillos atornillados en el cráneo.
5. Coloque el cemento metacrílico en el electrodo y los tornillos que cubran aproximadamente la mitad de la altura del pedestal del electrodo. Deje al descubierto la mitad superior del electrodo, que encaja en el extremo del cable de anclaje.
6. Suelte el electrodo del soporte y levante el brazo estereotáctico. Liberar al animal del aparato estereotáxico y darle cuidados postoperatorios.
7. Coloque al animal en una jaula de recuperación separada y obsérvelo cada 10 minutos hasta que esté despierto y deambulatorio. Regrese el animal a su jaula de alojamiento estándar y a otra compañía de animales no anestesiados solo después de que se haya recuperado por completo.

3. Implantación quirúrgica de los telémetros

NOTA: Utilice únicamente telémetros estériles. Si se reutilizan los telémetros, límpielos y esterilícelos antes de la cirugía de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En este protocolo, se utilizó un telémetro de ciencia de datos (DSI) para el registro de EEG.

1. Encienda el transmisor de telemetría con un imán y pruebe la señal con una radio de frecuencia AM. Verifique si hay una señal fuerte y clara antes de la cirugía. Si es necesario, deseche los telémetros que no funcionen.
2. Prepare los cables del telémetro acortándolos a longitudes óptimas para ratas adultas. Despegue el recubrimiento de silicona de dos cables (negativo y positivo), exponiendo aproximadamente 5 mm del cable de acero helicoidal. Cree un mango en bucle de unos 2 mm de largo y 1 mm de ancho en la punta de los cables.
3. Afeita el flanco del animal por debajo y por detrás del hombro izquierdo. Desinfectar el área de cirugía con desinfectante a base de peróxidos estabilizados y actividad de amonio cuaternario. Deja actuar el desinfectante durante 15 min.
4. Realizar una incisión lateral de unos 2 cm justo detrás del hombro del animal y hacer una bolsa subcutánea de unos 5 cm³ de espacio para la colocación del transmisor. Coloque el transmisor paralelo al eje longitudinal del cuerpo, con los cables dirigidos hacia la dirección rostral.
5. Fije el transmisor a la pared interna de la bolsa subcutánea con una sutura de algodón 3-0. Con unas tijeras de punta roma, cree el túnel subcutáneo (de aproximadamente 2,5 cm de longitud) a través del flanco y el cuello del animal, conectando así el bolsillo del transmisor con la incisión de la línea media realizada en el cuero cabelludo del animal en el paso 1.6.
6. Tome ambos cables telemétricos con pinzas y tire de ellos hacia arriba a través del túnel, de modo que sobresalgan de la salida de la incisión del cuero cabelludo. Sostenga los cables fuera de la incisión del cuero cabelludo con pinzas para heridas.
7. Utilice el marco estereotáxico para individualizar las coordenadas deseadas para el plomo positivo (rojo) y taladre el orificio en el cráneo para la punta del plomo positivo (similar al paso 2.1.). Haz un agujero más para anclar el tornillo hacia arriba a la tribuna y atorníllalo en el cráneo.
8. Inserte la punta de plomo positivo debajo de la escutelaria y la duramadre y colóquela sobre la superficie del cerebro. Enganche la punta en bucle del cable negativo (blanco) en el tornillo. Coloque una pequeña cantidad de cemento metacrílico alrededor de la salida del cable positivo y el cable negativo para inmovilizarlos en el cráneo.
9. Fije los cables a la pared interna de la piel del cráneo con una sutura de algodón 3-0. Asegúrese de que los cables fijos y la sutura de fijación no interfieran con el sitio de extracción del LCR (es decir, una superficie depresible con la apariencia de un rombo entre la protuberancia occipital y la columna vertebral del atlas).
10. Cierre la incisión del cuero cabelludo y la incisión del flanco con una sutura de algodón 3-0. Aplica desinfectantes en las heridas. Solo después de que se hayan secado, aplique una crema antibiótica sobre las heridas suturadas.

4. Cuidados postoperatorios

1. Monitoree a los animales durante aproximadamente 1 hora después de la cirugía hasta que estén erguidos y moviéndose alrededor de la jaula. Manténgalos sobre una almohadilla térmica para evitar la hipotermia. Administrar a los animales un antibiótico sistémico para prevenir la infección y un analgésico sistémico para prevenir el dolor postquirúrgico durante 2-3 días.
2. Permita que las ratas se recuperen durante al menos 7 días después de los procedimientos quirúrgicos. Vigile a los animales al menos una vez al día durante 3 días para detectar signos de dolor o angustia.

5. Inducción del estado epiléptico en ratas

NOTA: Para un protocolo detallado de inducción del estado epiléptico (EE) necesario para reproducir la epilepsia del lóbulo temporal mesial (mTLE) en ratas, consultar Guarino et ^al.25.

1. Después de una semana de recuperación postquirúrgica, asignar los animales aleatoriamente a los grupos: (i) animales control que recibirán vehículo y (ii) animales epilépticos que recibirán pilocarpina. Utilizar un número proporcionalmente mayor de animales para el grupo epiléptico, ya que no todas las ratas a las que se les administró pilocarpina sobrevivirán o desarrollarán SE.
2. El día antes de la inducción de SE, administrar a los animales una dosis única de 127 mg/kg de cloruro de litio disuelto en solución salina al 0,9% (3M) como un volumen de 1 mL/kg por sonda gástrica. Administrar el litio del animal, que aumenta la eficacia de la pilocarpina²⁶, aproximadamente 14 h antes de la inducción de EE con el fin de disminuir la variabilidad en el tiempo de inicio de la EE.
3. Aproximadamente 14 h después de la administración de litio, administrar a las ratas una sola inyección de metilescopolamina (1 mg/kg, por vía subcutánea).
4. Exactamente 30 minutos después de la administración de metilescopolamina, administre a las ratas una sola inyección de pilocarpina (50 mg/kg, i.p.) para inducir el SE. Administre metilescopolamina y vehículo (solución de NaCl al 0,9%) a las ratas de control.
   1. La inyección de pilocarpina induce un comportamiento típico en animales: convulsiones parciales tempranas (movimientos de vibrisas y movimientos de cabeza dentro de los 5 minutos posteriores a la administración de pilocarpina) que evolucionan a convulsiones generalizadas recurrentes (EE) dentro de los 25-30 minutos. En el caso de las ratas que no desarrollen EE en un plazo de 30 minutos, administrar una dosis adicional de pilocarpina (25 mg/kg, i.p.) y, si aún no desarrollan EE, excluirlas del estudio (EE no respondedoras).
5. Observe y puntúe el comportamiento convulsivo en ratas cada 5 minutos a partir de inmediatamente después de la inyección de pilocarpina. Usa la escala de Racine para obtener una puntuación^{de 27}.
6. Interrumpir la EE 2h después del inicio mediante la administración i.p. de un cóctel de fármacos: diazepam (10 mg/kg), fenobarbital (25 mg/kg) y escopolamina (1 mg/kg).
7. Vuelve a dar a las ratas este cóctel después de 4 h. Finalmente, después de otras 4 h, administrar a las ratas i.p. la última mezcla de fármacos (diazepam 10 mg/kg más escopolamina 1 mg/kg) para detener completamente la actividad convulsiva.
8. Inyectar solución salina a los animales (1 ml de solución de NaCl al 0,9%, pH ajustado a 7,0) y alimentarlos con una solución de sacarosa al 10% durante 2-3 días después de la SE para favorecer la recuperación de la pérdida de peso corporal que sigue a la SE.
9. Asigne aleatoriamente a los animales supervivientes post-SE a diferentes grupos experimentales de acuerdo con los requisitos del protocolo experimental específico. Utilizar los siguientes criterios de inclusión/exclusión para experimentos posteriores en ratas epilépticas: desarrollo de EE convulsiva dentro de 1 h después de la administración de pilocarpina, aumento de peso en la primera semana después de la EE y la posición correcta del electrodo en el área cerebral de interés para los registros de EEG²⁵.

6. Video-EEG atado en ratas epilépticas y análisis de la actividad convulsiva

NOTA: Esta sección describe el procedimiento experimental para registrar las señales de EEG en ratas de una sola casa que se mueven libremente en condiciones estándar. La jaula no debe contener objetos en los que el animal o el cable de grabación puedan atascarse. Dependiendo de la cuestión científica a abordar, se pueden analizar varios parámetros. En el caso de la investigación de la epilepsia, los trazos del EEG se examinan para reconocer las convulsiones eléctricas y motoras. Los parámetros más comunes utilizados para identificar una convulsión son la amplitud, la frecuencia y la duración de la actividad eléctrica paroxística.

1. Coloque al animal en una jaula limpia en la sala de grabación para permitir la habituación y reducir el estrés inducido por el nuevo entorno. Coloque la jaula del animal en una jaula de Faraday para evitar la contaminación de la señal EGG con el campo electromagnético ambiental.
2. Conecte un extremo del cable de grabación al dispositivo de grabación. Utilice un voltímetro para medir el potencial eléctrico y diferenciar entre electrodos de tierra y de referencia.
3. Conecte el otro extremo del cable de grabación al electrodo fijado en la cabeza de la rata. Para este objetivo, sostenga la cubierta de cemento en la cabeza del animal cuando inserte el enchufe del cable en el conector del electrodo y evite aplicar presión sobre la cabeza de la rata.
4. Contrarreste el peso del cable de grabación para permitir el libre movimiento del animal y evitar el riesgo de torcer el cable. Para ello, utilice un brazo de contrapeso o conmutadores. Incluso si el cable de grabación está contrapesado, coloque la comida dentro de la jaula en lugar de en un soporte de alimentación, en el que los animales tienen que levantarse para alcanzar la comida.
5. Antes de iniciar el registro, verifique todos los ajustes utilizados para adquirir y procesar los datos del EEG.
   NOTA: Este protocolo no proporciona una introducción al aparato requerido para realizar el registro de EEG, sin embargo, se deben aplicar filtraciones y frecuencias de muestreo adecuadas para evitar artefactos y ruido en las señales de EEG.
   1. Para un experimento de rutina, ajuste la frecuencia de muestreo a 500 Hz y la ganancia de amplificación a 5000x. Filtre la señal utilizando un filtro de 0,005 Hz además de un filtro de muesca para descartar la actividad eléctrica circundante en la banda de 50 Hz (específica para países europeos).
6. Inicie las grabaciones de video y EEG y asegúrese de que los rastros coincidan con una señal de EEG esperada verificando la potencia en bandas de frecuencia específicas a lo largo del tiempo. Registre un período de referencia antes de iniciar las intervenciones en los animales.
7. Revise periódicamente los rastros de animales y EEG. No es raro que un cable de grabación se desprenda del conector del electrodo en la cabeza de la rata. Si esto sucede, vuelva a conectar el electrodo en la cabeza de la rata a un cable de grabación y verifique si hay una señal de EEG clara.
8. Analice la señal de EEG de forma manual o automática utilizando software disponible en el mercado. Si se analiza manualmente, realice una pantalla a través del registro de EEG para identificar actividades similares a las convulsiones. Si se va a utilizar software, configure los parámetros clave de un evento de convulsión, como la amplitud, la frecuencia y la duración de la actividad eléctrica.
   NOTA: La convulsión única puede caracterizarse por una actividad eléctrica con una amplitud 3 veces superior a la basal, una frecuencia igual o superior a 5 Hz y una duración de al menos 5 s²².
9. Independientemente del método utilizado, confirme las posibles convulsiones comprobando la grabación de vídeo sincronizada recogida simultáneamente con el EEG.

7. Video-EEG de telemetría en ratas epilépticas y análisis de la actividad convulsiva

NOTA: En esta sección se describe el procedimiento experimental para registrar las señales de EEG de radiotelemetría en ratas de una sola casa que se mueven libremente en condiciones estándar. El protocolo se basa en un sistema de telemetría disponible comercialmente. Sin embargo, varios sistemas de telemetría difieren ligeramente en sus especificaciones funcionales y técnicas. El sistema debe elegirse en función de los requisitos del laboratorio y los objetivos de la investigación.

1. Coloque la jaula del hogar del animal sobre el receptor de señal. Conecte el receptor de señal al sistema de adquisición de datos y éste a un ordenador con el software de adquisición.
2. Encienda el implante de telemetría de radiofrecuencia colocando un imán cerca del telémetro insertado en el flanco de la rata. Pruebe la señal con un dispositivo de radio. Use un dispositivo de radio universal para probar los telémetros y escuche un pitido claro que indica que el telémetro está activado, mientras que un sonido chisporroteante indica que el telémetro está desactivado.
   NOTA: Se debe tener en cuenta la vida útil de la batería del transmisor de radiofrecuencia antes de definir la duración de las grabaciones.
3. Configure el software de adquisición y sincronice la señal de telemetría y el sistema de video para adquirir simultáneamente EEG y datos de video. Asigne un receptor de señal a cada transmisor implantado y establezca los valores de calibración del transmisor. Ajuste la frecuencia de muestreo a 1000 Hz, la detección de ruido entre -500 mV y +500 mV, y el intervalo de integración a 100 ms. No utilice filtros de paso bajo y alto.
4. Inicie las grabaciones de telemetría y vídeo. Realizar un registro basal a largo plazo antes de adquirir la actividad epiléptica. Analice la señal de EEG como se describe en los pasos 6.8 y 6.9.

8. Procedimiento de extracción de sangre de la vena de la cola

NOTA. El sistema de extracción de sangre al vacío consiste en una aguja de mariposa (23 G x 3/4 x 12 (0,8 mm x 19 mm x 305 mm). La técnica de extracción de sangre puede ser realizada fácilmente por un operador y el procedimiento dura unos 5 minutos.

1. Cubra la aguja de mariposa y su tubo con 1% de K₂EDTA en agua destilada poco antes de las extracciones, es decir, aspire y expulse la solución de K₂EDTA del sistema utilizando la jeringa de 1 ml. Cortar el tubo justo detrás de la aguja para recoger la sangre gota a gota, sin aspiración (Figura 1A).
2. Colocar a la rata en una cámara de inducción y anestesiarla con isoflurano (1,4% en aire; 1,2 mL/min). Cambie al marco estereotáxico y mantenga la anestesia a través de una máscara facial. Coloque la almohadilla térmica debajo del animal, manteniendo una parte de su cola en contacto directo con la almohadilla.
3. Mueva suavemente la espalda del animal hacia un lado para que la vena lateral de la cola se mantenga en la parte superior.
4. Sumerja la cola en agua tibia (42 °C) durante 2 minutos para dilatar la vena lateral. Limpie la cola con etanol al 70% para que la vena sea más visible. Ponga una luz cálida en la cola con una bombilla incandescente normal.
5. Inserte la aguja de mariposa 21G en la vena lateral de la cola con una profundidad de 5 mm y un ángulo de 20°. Recolectar sangre en un tubo de recolección al vacío de 500 μL que contenga 5 mg de K₂EDTA como anticoagulante (Figura 1B, C).
6. Retire la aguja y detenga el flujo de sangre ejerciendo presión en el lugar de la punción. Regresa a la rata a su jaula de origen.
7. Invierta suavemente el tubo 10 veces para mezclar el anticoagulante en la sangre. Haz agujeros de aproximadamente 1,5 cm de profundidad en el hielo para acomodar los tubos de recolección. Coloque la muestra en hielo de forma suave y vertical.
8. Centrifugar la muestra de sangre en una centrífuga refrigerada (4 °C) a 1300 x g durante 10 min para separar el plasma. Realice este procedimiento en un plazo máximo de 1 hora.
9. Tome unos 200 μL de plasma, evitando la capa de glóbulos rojos y blancos. Coloque el plasma extraído en el microtubo estéril de 0,2 ml. Si es necesario, almacenar a 4 °C hasta 1 h después de la centrifugación.
10. Reserve 5 μL de la muestra para el control de calidad. Almacenar la muestra a -80 °C hasta el análisis.
    NOTA: No utilice la aspiradora, incluso si algunos investigadores lo recomiendan²⁸, ni ordeña la cola durante los procedimientos descritos en el paso 8.5 para obtener más sangre, ya que disminuye la calidad de la muestra para los próximos análisis de cuantificación de sncRNA (consulte los Resultados representativos para obtener más detalles). Hay que tener en cuenta que en ratas, la cantidad máxima de sangre que se puede extraer a la vez es <10% de su volumen sanguíneo total (es decir, alrededor de 1,6-1,9 ml en una rata de 250-300 g) y <15% del volumen sanguíneo total (alrededor de 2,64 ml) en 1 mes²⁹. En este protocolo, se utiliza un máximo de 500 μL de extracción de sangre en una sola ocasión hasta cinco veces en un solo animal^30,31.

9. Procedimiento de recogida del líquido porcina clásica

NOTA. La técnica puede ser realizada fácilmente por un solo operador, y el procedimiento requiere alrededor de 2-4 minutos. Los materiales utilizados para la recolección de LCR son agujas de mariposa de vacío de bajo costo y de un solo uso y tubos de extracción. En este protocolo, se utiliza un equipo de infusión con alas de mariposa conectado a una jeringa estéril para crear el vacío (Figura 2A).

1. Prepare la aguja de mariposa 23G, cortando su protección de manga de plástico de modo que el extremo de la aguja desnuda quede expuesto 7 mm para evitar que penetre más de 7 mm de profundidad en la cisterna magna durante la extracción (Figura 2B).
2. Conecte la aguja de mariposa equipada con un tubo de polímero a una jeringa de 1 ml.
3. Colocar a la rata en una cámara de inducción y anestesiarla con isoflurano (1,4% en el aire; 1,2 mL/min). Cambie el flujo de isoflurano al marco estereotáxico y mantenga la anestesia administrada a través de una máscara facial. Retira el pelaje de la parte trasera, la cabeza y el cuello de la rata con una navaja.
4. Fija la cabeza de la rata con barras en las orejas. Baje la cabeza del animal hacia abajo aproximadamente 45° verticalmente, bajando por la barra nasal del marco estereotáxico (Figura 2C). Inspeccione la parte posterior de la cabeza del animal y encuentre una superficie ligeramente deprimida con aspecto de rombo, entre la protuberancia occipital y la espina del atlas.
5. Frote esta superficie con etanol al 70% para hacerla más visible y desinfectarla.
6. Inserte la aguja de mariposa verticalmente en el centro de la superficie deprimida en forma de rombo en la cisterna magna para la recolección de LCR hasta que se bloquee el movimiento cortando a medida la protección de la aguja de la manga de plástico (Figura 2D). Retire suavemente el pistón de la jeringa de 1 ml para permitir que el líquido cefalorraquídeo fluya lentamente a través de la aguja.
7. Recoja aproximadamente 100 μl del líquido cefalorraquídeo en un tubo de polímero (Figura 2D). Evite la entrada de sangre o cualquier otra contaminación visible. Pellizca el tubo de polímero muy cerca de la aguja de mariposa y corta el tubo en este punto.
8. Introduzca la muestra clara (no contaminada) en la jeringa. Deseche la muestra contaminada, si la contaminación visible entra en el tubo colector.
9. Expulsar la muestra en el microtubo estéril de 0,2 ml y almacenar en hielo durante un máximo de 1 h.
10. Desinfecte el sitio de extracción del líquido cefalorraquídeo en la cabeza del animal. Retira a la rata del marco estereotáxico y vuelve a colocarla en su jaula.
11. Reserve 2 μL de la muestra para el control de calidad. Almacene el resto de la muestra a -80 °C para su posterior análisis.
    NOTA: En ratas, si se realizan múltiples extracciones de LCR repetidamente, el volumen recomendado que se debe extraer en cada recolección es de 100 μL³². En este protocolo, se realizó un máximo de 100 μL de LCR en una sola ocasión con 5 veces la retirada máxima en 15 días en un solo animal.

10. Análisis espectrofotométrico de la calidad de la muestra

NOTA: Después de la recolección adecuada de muestras de LCR y plasma, las muestras están listas para análisis de espectrofotómetro y no requieren ningún manejo específico. Medir la absorbancia de hemoglobina mediante espectrofotometría UV a 414 nm para evaluar el riesgo de hemólisis en las muestras. Utilice un valor de absorbancia de corte de 0,25 en muestras de ratas. La elección de este límite puede depender del análisis posterior de qPCR y de sus requisitos específicos para la cuantificación de sncRNAs.

1. Encienda el espectrofotómetro UV. Seleccione el método para la medición de la absorbancia en una sola longitud de onda de 414 nm para PLASMA o CSF. Haga clic en Siguiente.
2. Enjuague la cubeta de 1 mm con agua purificada. Coloque 5 μL de etanol al 70% en el punto de medición de la cubeta. Secar con una toalla de papel y frotar con papel de seda sin pelusa. Comprueba si es perfectamente transparente.
3. Poner 1,5 μL de agua purificada en la cubeta de 1 mm y cerrarla. Inserte la cubeta en la cámara de medición del espectrofotómetro y mida la absorbancia de la muestra en blanco haciendo clic en el botón Blank . Compruebe que el valor de absorbancia a 414 nm es de 0,000.
4. Seque la cubeta con una toalla de papel y límpiela con papel de seda sin pelusa. Comprueba si es perfectamente transparente.
5. Coloque 1,5 μL de la muestra en la cubeta de 1 mm y ciérrela. Inserte la cubeta en la cámara de medición del espectrofotómetro. Mida la muestra, haciendo clic en el botón Muestra . Compruebe la absorbancia de la muestra a 414 nm y anótela.
6. Proceder a cuantificar la absorbancia de hemoglobina en todas las muestras disponibles. Mida la muestra en blanco antes que cualquier muestra de plasma o LCR, haciendo clic alternativamente en los botones Blanco y Muestra .
7. Conserve las muestras con A414 nm < 0,25 a -80 °C y deseche las muestras si A414 nm > 0,25.
8. Enjuague la cubeta de 1 mm con agua purificada y etanol al 70%, secuencialmente. Seca la cubeta.
9. Cierre la cubeta vacía en la cámara de medición para evitar que se forme polvo. Apague el espectrofotómetro.

El resultado de diferentes procedimientos de LCR y extracción de sangre realizados en 9 ratas control y 18 ratas epilépticas crónicas, todas ellas implantadas con electrodos al mes post-EE, se informa en términos de tasa de éxito. Después de la implantación, todas las ratas fueron monitoreadas por video-EEG durante 1 mes, durante el cual se extrajo el LCR más sangre 5 veces cada 3 días durante las dos últimas semanas del experimento (es decir, en los días 52, 55, 58, 61 y 64 después de la EE; dpSE). Se utilizaron datos de extracciones múltiples en diferentes animales para comparar la tasa de éxito de la recolección de LCR en las ratas con implantes de doble cabeza (canuladas para la extracción de LCR) con la tasa de éxito de la recolección de LCR (realizada mediante punción de cisterna magna) solo en animales implantados con electrodos atados o de telemetría (Tabla 1). En diferentes animales, se evaluó el impacto de la extracción de sangre al vacío o el ordeño de cola en la calidad de las muestras de plasma (Tabla 2). Para ello, se utilizó el análisis de espectrofotometría UV a 414 nm para la detección de hemoglobina libre. Para los análisis estadísticos se utilizó software comercial y se utilizó el ANOVA de Kruskal-Wallis o de una vía con pruebas de comparación múltiple de Tukey post-hoc (p<0,05 considerada estadísticamente significativa). Los datos se expresan como media ± SEM.

Tasa de éxito de múltiples muestreos de LCR en ratas canuladas y punzadas
Se han muestreado LCR 5 veces en 2 semanas en 3 grupos de ratas: (i) ratas con implantes de electrodos canulados y atados (grupo de animales con TC); en estos, la extracción del LCR se realizó a través de una cánula guía ficticia y una unión de tubo de PTFE a una jeringa de 1 mL cuando no estaban anestesiados y se movían libremente bajo video-EEG; (ii) ratas perforadas (paso 9) e implantadas con electrodos atados (grupo PT); (iii) ratas con electrodos punzantes e implantados con electrodos de telemetría (grupo PTe). Se utilizaron un total de 9 animales por grupo (6 ratas epilépticas y 3 control). Se evaluó el número de cobros exitosos más de 5 veces. La tasa de éxito fue similar en ratas perforadas: 86,7% ± 5,8% en animales atados y 88,9% ± 4,8% en animales implantados con electrodos de telemetría. En cambio, en las ratas canuladas, la tasa se redujo aunque no fue significativamente diferente (71,1% ± 8,9%, Tabla 1). Estos resultados indican que la cánula en la cabeza de los animales puede interferir con la toma repetida de muestras de LCR y comprometer los estudios longitudinales. La técnica de punción es más adecuada para extracciones múltiples de LCR en animales implantados con electrodos.

Impacto del ordeño al vacío y de cola en el método de recolección de plasma
Se recolectó sangre 5 veces de 9 ratas (6 epilépticas y 3 ratas control) a los días 52, 55, 58, 61 y 64 post-SE y la calidad del plasma se evaluó para hemólisis visualmente y por espectrofotometría UV a 414 nm. Para obtener la primera muestra en cada rata, se empleó la extracción al vacío a través de una aguja de mariposa de 21G unida a una jeringa de 1 mL. Con la segunda muestra, se empleó el sistema de extracción de gotas y agujas de mariposa 21G al ordeñar la cola simultáneamente. Para obtener la 3ª-5ª muestra, se utilizó el procedimiento de retirada de gotas sin ordeñar la cola (descrito en el paso 9).

Cuando se empleó un vacío, el plasma fue de color rosa bajo la inspección visual, y el valor medio de absorbancia de las muestras de 9 ratas fue de 0,647 ± 0,067 (Tabla 2, Figura 3). Resultados similares se obtuvieron si se empleó el ordeño de cola durante el procedimiento: plasma de color rosado con absorbancia media de 0,620 ± 0,043 (Tabla 2, Figura 3). Por el contrario, con la extracción de gotas habilitada por la gravedad y el sistema de aguja de mariposa de 21 G, los valores medios de absorbancia plasmática se redujeron significativamente (0,226 ± 0,017 a 58 dpSE; 0,223 ± -0,09 a 61 dpSE; 0,226 ± 0,018 a 64 dpSE; Tabla 2, Figura 3) con respecto al método de ordeño al vacío o de cola. Además, las muestras de plasma en gota eran principalmente transparentes. Los valores más altos de absorbancia (52 y 55 dpSE) se correlacionaron con el color rosado de las muestras (datos no mostrados). Estos resultados pueden sugerir que el último método es el mejor para obtener muestras de muy alta calidad para los análisis.

Figura 1: Pasos clave del flujo de trabajo de muestreo de plasma. (A) Materiales necesarios para la extracción de sangre y rata en el marco estereotáxico, listos para la recolección; (B, C) Aumentos de la cola con aguja de mariposa de 21G insertada en la vena lateral de la cola y la gota de sangre cayendo por las paredes del tubo de recolección con un anticoagulante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Pasos clave del flujo de trabajo de toma de muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR). (A) Materiales necesarios para la extracción del LCR y rata en el marco estereotáxico, poco antes de la recolección; (B) La preparación de la aguja de mariposa 23G cortando su protección de manga de plástico de modo que el extremo de la aguja desnuda quede expuesto durante 7 mm para garantizar una penetración correcta en la cisterna magna; (C) La cabeza de la rata se inclina hacia abajo 45° durante la retirada. (D) Aumento en el sitio romboidal con una aguja de mariposa insertada en la cisterna magna. Observe el líquido cefalorraquídeo que se eleva en el tubo, indicado por la punta del marcador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Evaluación de la calidad de las muestras de plasma. Grado de hemólisis medido a 414 nm para hemoglobina libre por espectroscopia UV en muestras de plasma de 9 animales en 5 puntos temporales (52, 55, 58, 61 y 64 días post estado epiléptico, dpSE) utilizando diferentes métodos: día 52 - la técnica de vacío; Día 55 - El ordeño de la cola; En los días 58-64 se emplearon las técnicas de caída. La disminución de la hemoglobina libre en plasma obtenida por la técnica de gota en comparación con los métodos de vacío y ordeño de cola fue significativa (*p <0,05 según ANOVA de una vía y prueba de comparación múltiple post-hoc de Tukey). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Tasas de éxito de los retiros de LCR. Comparación de las tasas de éxito de la retirada repetida del LCR en tres grupos experimentales de animales, expresada como porcentaje de retiradas exitosas a lo largo de 5 días. El valor 1 se asignó a la extracción exitosa de > 100 μL de LCR transparente; el valor cero se asignó a los retiros < 100 μL y/o de LCR poco claro. Abreviaturas: N/A - la ausencia de recogida debido a la pérdida de cánula durante el procedimiento de muestreo (sólo animales de TC); TC - canulada y atada; PT - perforado atado; PTe - electrodos de telemetría perforados implantados. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Evaluación de la hemólisis en muestras de plasma. Resultados de las mediciones de hemólisis en 5 puntos temporales utilizando tres métodos diferentes de muestreo de sangre: día 52 - la técnica de vacío; Día 55 - El ordeño de la cola; Días 58-64 Las técnicas de caída. Los valores >0,3 de absorbancia se correlacionaron con el color rosado de las muestras. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Los autores no tienen nada que revelar.