El protocolo muestra repetidas recolecciones de líquido cefalorraquídeo y sangre de ratas epilépticas realizadas en paralelo con un monitoreo continuo de video-electroencefalograma (EEG). Estos son fundamentales para explorar posibles vínculos entre los cambios en varias moléculas de fluidos corporales y la actividad convulsiva.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Toma de muestras de líquido cefalorraquídeo y sangre de la vena lateral de la cola en ratas durante los registros de EEG
En este artículo
Resumen
Resumen
Debido a que la composición de los fluidos corporales refleja muchas dinámicas fisiológicas y patológicas, las muestras líquidas biológicas se obtienen comúnmente en muchos contextos experimentales para medir moléculas de interés, como hormonas, factores de crecimiento, proteínas o pequeños ARN no codificantes. Un ejemplo concreto es el muestreo de líquidos biológicos en la investigación de biomarcadores para la epilepsia. En estos estudios, es deseable comparar los niveles de moléculas en el líquido cefalorraquídeo (LCR) y en el plasma, mediante la extracción de LCR y plasma en paralelo y considerando la distancia temporal de la muestra desde y hacia las convulsiones. La combinación de muestras de LCR y plasma, junto con la monitorización por video-EEG en animales epilépticos, es un enfoque prometedor para la validación de biomarcadores diagnósticos y pronósticos putativos. Aquí, se describe un procedimiento combinado de extracción de LCR de la cisterna magna y la toma de muestras de sangre de la vena lateral de la cola en ratas epilépticas que se monitorean continuamente por video-EEG. Este procedimiento ofrece ventajas significativas sobre otras técnicas comúnmente utilizadas. Permite una toma de muestras rápida con un mínimo de dolor o invasividad, y un tiempo de anestesia reducido. Además, se puede utilizar para obtener muestras de LCR y plasma en ratas ancladas y registradas en EEG por telemetría, y se puede utilizar repetidamente durante varios días de experimento. Al minimizar el estrés debido al muestreo mediante el acortamiento de la anestesia con isoflurano, se espera que las medidas reflejen con mayor precisión los niveles reales de las moléculas investigadas en los biofluidos. Dependiendo de la disponibilidad de un ensayo analítico adecuado, esta técnica se puede utilizar para medir los niveles de múltiples moléculas diferentes mientras se realiza el registro de EEG al mismo tiempo.
Introducción
La toma de muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR) y sangre son importantes para identificar y validar biomarcadores de epilepsia, tanto en la investigación preclínica como en la clínica 1,2. Hoy en día, el diagnóstico de la epilepsia y la mayor parte de la investigación sobre biomarcadores de epilepsia se centra en el EEG y la neuroimagen 3,4,5. Estos enfoques, sin embargo, presentan varias limitaciones. Además de las mediciones rutinarias del cuero cabelludo, en muchos casos, el EEG requiere técnicas invasivas com....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los procedimientos experimentales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Ferrara y por el Ministerio de Salud italiano (autorización: D.M. 603/2022-PR) de acuerdo con las directrices descritas en la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas de 24 de noviembre de 1986 (86/609/CEE) sobre la protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos. Este protocolo se ajusta específicamente para análisis adicionales de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) de pequeños ácidos ribonucleicos no codificantes (sncRNA) en el LCR de rata y plasma obtenidos bajo co....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El resultado de diferentes procedimientos de LCR y extracción de sangre realizados en 9 ratas control y 18 ratas epilépticas crónicas, todas ellas implantadas con electrodos al mes post-EE, se informa en términos de tasa de éxito. Después de la implantación, todas las ratas fueron monitoreadas por video-EEG durante 1 mes, durante el cual se extrajo el LCR más sangre 5 veces cada 3 días durante las dos últimas semanas del experimento (es decir, en los días 52, 55, 58, 61 y 64 después de la EE; dpSE). Se utilizaron datos d.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El presente trabajo ilustra una técnica fácil de dominar de la recolección de LCR y sangre en ratas, que puede ser útil no solo para estudios en modelos de epilepsia, sino también de otras afecciones o enfermedades neurológicas como el Alzheimer, el Parkinson o la esclerosis múltiple. En la investigación de la epilepsia, ambos procedimientos de muestreo junto con el video-EEG son ideales cuando se busca una correlación entre los niveles de diferentes moléculas solubles y la actividad convulsiva. Por esta razón, se empleó.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio contó con el apoyo de una subvención del Programa de Trabajo Horizonte 2020 de la Unión Europea (convocatoria H2020-FETOPEN-2018-2020) en virtud del acuerdo de subvención 964712 (PRIME; a M. Simonato).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Set de extracción de sangre BD Vacutainer Safety-Lok | BD Italy SpA, Milán, Italia | 367246 | Material |
| Tubos de extracción de sangre (Microtainer K2E) | BD Italy SpA, Milán, Italia | 365975 | Material |
| Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm | Nipro, Osaka, Japón | PSY-23-ET-ICU | |
| Material Centrífuga refrigerada ALC PK 130R | DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, Inglaterra | 112000033 | Material |
| Sutura de algodón 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, Nueva Jersey, EE. UU. | 7343H | Material |
| Diazepam 5 mg / 2 ml, Solupam | Dechra Productos Veterinarios, Torino, Italia | 105183014 (AIC) | Solución |
| Sistema de grabación de medios de video digital de 8 canales de telemetría EEG configurado | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, EE. UU | PNM-VIDEO-008 | Equipo |
| Sistema de videovigilancia digital de configuración | de EEG atadoEZVIZ Network, Hangzhou, Cina | EZVIZ (V5.3.2) | Equipos |
| Desinfectante a base de peróxidos estabilizados y actividad de amonio cuaternario | Laboratoire Garcin-Bactinyl, Francia | LB | 920111 |
| Solution Cánula guía ficticia 8 mm | Agn Tho's, Lindigö, Suecia | CXD-8 | |
| Material Electrodo de 3 canales de dos trenzas | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, EE. UU. | MS333/3-B/SPC | |
| Material Portaelectrodos para cirugía estereotéxica | Agn Tho's, Lindigö, Suecia | 1776-P1 | Equipo |
| Eppendorf BioSpectrometer basic | Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania | 6137 | Equipo |
Tubos de PCR Eppendorf 0,2 mL | Eppendorf Srl, Milán, Italia | 30124332 Material | |
| Eppendorf μ Cubeta G1.0 | Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania | 6138 | Equipo |
| Aguja de alimentación flexible 17G para ratas | Agn Tho's, Lindigö Suecia | 7206 | Material |
| Aparato de tecnología de hierba | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, EE. UU. | M665G08 | Equipo (amplificador AS40, caja principal, cables de interconexión, modelo de telefactor RPSA S40) |
| Isoflurano 100%, IsoFlo | Zoetis, Roma, Italia | 103287025 (AIC) | Solución |
| Ketamina (Imalgene) | Merial, Toulouse, Francia | 221300288 ( AIC) | Solución |
| Cloruro de litio | Sigma-Aldrich, Milán, Italia | L9650 | Material |
| Cánula de microinyección 31G 9 mm | Agn Tho's, Lindigö Suecia | CXMI-9 | Material |
| MP150 adquisición de datos modular y sistema de análisis | Biopac, Goleta, California, EE. UU. | MP150WSW | Equipo |
| Pomada veterinaria oftálmica, Hylo night | Ursapharm, Milán, Italia | 941791927 (AIC) | Material |
| Clorhidrato de pilocarpina | Sigma-Aldrich, Milán, Italia | P6503 | Material |
| Tubo de PTFE con junta | Agn Tho's, Lindigö, Suecia | JT-10 | Material |
| Solución salina | 0,9% NaCl, pH ajustado a 7.0 | Solución | |
| Hidrobromuro de escopolamina trihidrato | Sigma-Aldrich, Milán, Italia | S2250 | |
| Material Nitrato de metilo de escopolamina | Sigma-Aldrich, Milán, Italia | S1876 | Material |
| Plata sulfadiazina 1% crema | Sofar, Trezzano Rosa, Milán, Italia | 025561010 (AIC) | Material |
| Cemento metacrílico dental rápido Simplex | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, Reino Unido | ACR811 | |
| Material Aparato estereotáxico | David Kopf Instruments, Los Ángeles, CA, EE. UU | Modelo 963 | |
| Equipo Solución de sacarosa | al 10% en agua destilada | casera | |
| Jeringa 1 mL | Biosigma, Cona, Venezia, Italia | 20,71,26,03,00,350 | |
| Telémetros | de materiales Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, EE. UU | de materiales | CTA-F40 |
| Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, EE. UU | Equipo NeuroScore v3-0 | Sistema | |
| telemetría | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, EE. UU | Hardware más software Ponemah núcleo 6.51 | Equipo |
| Clorhidrato de xilacina | Sigma-Aldrich, Milán, Italia | X1251 | Material |
Referencias
- Hanin, A., et al. Cerebrospinal fluid and blood biomarkers of status epilepticus. Epilepsia. 61 (1), 6-18 (2020).
- Pitkänen, A., et al. Advances in the development of biomarkers for epilepsy. The Lancet Neurology. 15 (8), 843-856 (2016).
- Dl....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
