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Summary

Este protocolo tuvo como objetivo describir una guía detallada sobre la preparación de secciones de muestras de semillas duras con bajo contenido de agua para el análisis MALDI-IMS, manteniendo la distribución y abundancia originales de los analitos y proporcionando una señal de alta calidad y resolución espacial.

Abstract

La espectrometría de masas de imágenes de desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI-IMS) se aplica para identificar compuestos en sus entornos nativos. En la actualidad, MALDI-IMS se utiliza con frecuencia en análisis clínicos. Aún así, existe una excelente perspectiva para aplicar mejor esta técnica para comprender la información fisiológica de los compuestos químicos en los tejidos vegetales. Sin embargo, la preparación puede ser un desafío para muestras específicas de materiales botánicos, ya que MALDI-IMS requiere cortes delgados (12-20 μm) para la adquisición adecuada de datos y el análisis exitoso. En este sentido, previamente, desarrollamos un protocolo de preparación de muestras para obtener secciones delgadas de semillas duras de Euterpe oleracea (palma de açaí), posibilitando su mapeo molecular mediante MALDI-IMS.

Aquí, mostramos que el protocolo desarrollado es adecuado para preparar otras semillas del mismo género. Brevemente, el protocolo se basó en sumergir las semillas en agua desionizada durante 24 h, incrustar las muestras con gelatina y seccionarlas en un criostato aclimatado. A continuación, para la deposición de la matriz, se acopló una plataforma de movimiento xy a una pulverización de aguja de ionización por electrospray (ESI) utilizando una solución de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) y metanol 1:1 (v/v) con ácido trifluoroacético al 0,1% a 30 mg/mL. Los datos de las semillas de E. precatoria y E. edulis se procesaron utilizando software para mapear sus patrones de metabolitos.

Los oligómeros de hexosa se mapearon dentro de las rebanadas de muestra para demostrar la idoneidad del protocolo para esas muestras, ya que se sabe que esas semillas contienen grandes cantidades de manano, un polímero de la manosa de hexosa. Como resultado, se identificaron picos de oligómeros de hexosa, representados por aductos [M + K]⁺ de (Δ = 162 Da). Por lo tanto, el protocolo de preparación de muestras, previamente desarrollado a medida para semillas de E. oleracea , también permitió el análisis MALDI-IMS de otras dos semillas de palma dura. En definitiva, el método podría constituir una herramienta valiosa para la investigación en morfoanatomía y fisiología de materiales botánicos, especialmente a partir de muestras resistentes a cortes.

Introduction

La espectrometría de masas por imágenes de ionización/desorción láser asistida por matriz (MALDI-IMS) es un método potente que permite la asignación bidimensional de biomoléculas, proporciona una investigación no dirigida de compuestos ionizables y determina su distribución espacial, especialmente en muestras biológicas ^1,2. Durante dos décadas, esta técnica ha permitido la detección e identificación simultánea de lípidos, péptidos, carbohidratos, proteínas, otros metabolitos y moléculas sintéticas como fármacos terapéuticos ^3,4. MALDI-IMS facilita el análisis químico en la superficie de una muestra de tejido sin extracción, purificación, separación, etiquetado o tinción de muestras biológicas. Sin embargo, para el éxito del análisis, un paso fundamental en esta técnica es la preparación de la muestra, especialmente en los tejidos vegetales, que se especializan y modifican a órganos complejos generalizados debido a la aclimatación ambiental⁵.

Debido a las propiedades fisicoquímicas inherentes al tejido vegetal, existe la necesidad de un protocolo adaptado para satisfacer los requisitos del análisis MALDI-IMS y preservar la forma original del tejido durante la preparación del corte ^6,7. En el caso de muestras no convencionales, como semillas, los protocolos establecidos⁸ no son aplicables porque estos tejidos tienen paredes celulares rígidas y bajo contenido de agua, lo que puede causar fácilmente la fragmentación de la sección y conducir a la deslocalización de compuestos⁹.

Nuestro grupo de investigación ha publicado datos experimentales sobre mapeo molecular y un protocolo adaptado para el análisis MALDI-IMS de la semilla de açaí (Euterpe oleracea Mart.) 10,11,12, que es un subproducto generado en altas cantidades durante la producción de la pulpa de açaí¹³. La idea era desarrollar un protocolo para el mapeo in situ de diferentes metabolitos en semillas de açaí, ayudando a sugerir posibles usos para este residuo agrícola que actualmente no están siendo explorados comercialmente. Sin embargo, debido a la resistencia de la semilla de açaí, fue necesario realizar un protocolo a medida para obtener un corte adecuado de la muestra a partir del análisis MALDI-IMS.

En este contexto, la pulpa de açaí, de importancia económica, ha motivado la creciente comercialización de otros frutos de palmeras del género Euterpe con características sensoriales similares. Los dos frutos emergentes de las palmeras que se han producido a escala industrial como alternativa al açaí^14,15 son E. precatoria (conocida como açaí-do-amazonas), que crece en la selva amazónica, y E. edulis (conocida como juçara), típica de la Mata Atlántica. Sin embargo, el consumo de açaí-do-amazonas y juçara conduce a la misma acumulación de semillas resistentes y no comestibles que no se aprovechan y no se han estudiado hasta ahora en cuanto a su composición química detallada.

De este modo, demostramos aquí que el protocolo previamente diseñado puede ser utilizado, con pocas adaptaciones, para analizar semillas de E. precatoria y E. edulis para su mapeo molecular por MALDI-IMS, demostrando ser una poderosa herramienta que puede ser utilizada para el análisis de la composición de estos recursos y puede ayudar a determinar sus potenciales usos biotecnológicos. Además, la descripción detallada que se proporciona aquí puede ayudar a otras personas con dificultades similares en la preparación de materiales resistentes para el análisis MALDI-IMS.

Protocol

Las semillas de Euterpe precatoria fueron amablemente donadas por el Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (Manaus, Brasil), y las semillas de Euterpe edulis fueron amablemente donadas por el Silo – Arte e Latitude Rural (Resende, Brasil) después del proceso de despulpado industrial. Las semillas se mantuvieron en cajas de plástico selladas a temperatura ambiente.

1. Espectroscopía de masas de imágenes de ionización/desorción láser asistida por matriz (MALDI-IMS)

1. Protocolo de seccionamiento de semillas
   1. Deje reposar tres semillas de cada especie en agua desionizada durante 24 h.
   2. Al día siguiente, encienda el criostato (ver Tabla de Materiales) y déjelo alcanzar los -20 °C.
   3. Saca las semillas húmedas del agua. Corta las semillas por la mitad con una cuchilla de micrótomo (ver Tabla de Materiales).
   4. Prepare una solución de gelatina fresca y tibia (10%) (consulte la Tabla de materiales).
   5. Coloca la mitad de la semilla en un molde y rellénalo con gelatina recién hecha. Congelar a -80 °C durante 2 h antes de llevarlo al criostato.
   6. Fije la semilla incrustada al soporte del criostato utilizando un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT, consulte la Tabla de materiales) y déjela durante 10 minutos dentro del criostato para el endurecimiento OCT.
   7. Agregue cinta adhesiva de cobre de doble cara (consulte la Tabla de materiales) a un portaobjetos de vidrio recubierto de óxido de indio y estaño (portaobjetos ITO; consulte la Tabla de materiales).
   8. Producir secciones de 20 μm de espesor de cada especie y colocarlas en la cinta adhesiva de cobre de doble cara adherida al portaobjetos de vidrio ITO.
      NOTA: En este punto, las lonchas recogidas en los portaobjetos se pueden almacenar en un congelador a -80 °C; Alternativamente, proceda a la deposición de la matriz. Los portaobjetos deben colocarse en una caja portaobjetos, enjuagarse con N₂ gaseoso y sellarse con una película para evitar la oxidación de la muestra (véase la Tabla de materiales).
2. Deposición de matrices
   1. Coloque el portaobjetos que contiene las rodajas en un desecador al vacío hasta que alcance la temperatura ambiente.
   2. Haga marcas didácticas con un bolígrafo corrector en cada esquina de la diapositiva. Escanee la diapositiva con un escáner de mesa. Ajustado a la resolución de 4.800 ppi.
   3. Utilice una balanza analítica para pesar 30 mg de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB; ver Tabla de materiales) y prepare 1 ml de metanol:ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA) 1:1 %. Tabla de Materiales) solución para disolver el DHB.
   4. Llene una jeringa de vidrio de 1 ml (consulte la tabla de materiales) con solución de DHB y colóquela en una bomba de jeringa (consulte la tabla de materiales) ajustada a un caudal de 0,8 ml/h.
   5. Con un tubo de PEEK, conecte la jeringa a una aguja de ionización química a presión atmosférica (APCI) (consulte la Tabla de materiales).
   6. Conecte N₂ a la aguja APCI y ajústela a un caudal de 12,5 psi .
   7. Coloque la aguja APCI en la plataforma de movimiento xy (consulte la tabla de materiales). Asegúrese de que la punta de la aguja APCI esté a 4 cm por encima del portaobjetos.
   8. Utilizando el software de dibujo (véase la Tabla de Materiales y la Figura 1 Complementaria), configure la plataforma de movimiento xy para que siga la plantilla. La plantilla consta de líneas paralelas horizontales espaciadas por 1 mm.
   9. Para lograr la deposición de la matriz, espere a que la plataforma de movimiento xy repita la plantilla 20 veces.
      PRECAUCIÓN: La deposición de la matriz debe llevarse a cabo en una campana de extracción química.
3. Adquisición de imágenes
   1. Coloque el portaobjetos en el espectrómetro de masas (consulte la Tabla de materiales).
   2. Utilice marcas de rotulador corrector para establecer puntos de enseñanza en el software al que se hace referencia (consulte la Tabla de materiales).
   3. Ajuste la potencia del láser (60%), el enfoque del láser (medio), el número de disparos (100) y la polaridad en el software (consulte la Tabla de materiales). Establezca un factor de reducción de datos del 99% y guarde el archivo FID para la calibración posterior de los datos. Guarde el método.
   4. Delimite el área que se va a analizar con la herramienta agregar región de medición de polígonos del software del espectrómetro de masas. Edite los parámetros de la región de medición indicando el método guardado en el paso anterior y el ancho del ráster a 100 μm (Figura complementaria S4A).
   5. Inicie la adquisición de imágenes.
4. Análisis de datos
   1. Utilice el grupo de matrices y los contaminantes conocidos para crear una lista de masas en el software de referencia (consulte la Tabla de materiales) en la pestaña de calibrantes (Figura complementaria S4B).
      1. Abra los datos que se van a calibrar en el software de referencia (consulte Tabla de materiales). En la pestaña de calibración , abra la lista de masas creada y abra un cuadro de diálogo haciendo clic con el botón derecho y elija la opción establecer masas de bloqueo (Figura complementaria S4C).
      2. Seleccione el modo de ventana gaussiana con ensanchamiento gaussiano de 0,5 y ensanchamiento de línea de 3,5. Deje la calibración en línea sin marcar. Seleccione el modo (simple), el umbral (1.000) y la tolerancia de masa (5 ppm). Calibrar los datos con el proceso y guardar la herramienta de datos 2D (Figura complementaria S4C).
   2. Después de la calibración, exporte los datos al laboratorio SCiLS u otro software compatible y establezca el umbral de valor m/z deseado (rango elegido: 150 a 2.500).
      NOTA: Dependiendo del tamaño del archivo o de las características del ordenador, esto puede llevar algún tiempo.
   3. Elija un método de normalización entre el recuento total de iones (TIC) o la raíz cuadrática media (RMS).
      NOTA: Para este análisis se optó por el TIC.
   4. Si se conocen los analitos que se van a cartografiar, represente gráficamente cada valor m/z para cada analito y guarde las imágenes generadas y la gráfica de la media espectral.
      NOTA: En este trabajo, los valores m/z de los oligómeros de hexosa se eligieron considerando el aducto de potasio.

2. Espectroscopía de dispersión de energía (EDS)

1. Protocolo de seccionamiento de semillas
   1. Adquiera una rodaja delgada de semillas en una sierra seccionadora (consulte la tabla de materiales).
   2. Corte las semillas con los siguientes parámetros: velocidad de corte de 500 RPM, carga de carga de 100 N y hoja de oblea de diamante de 15 HC (consulte la tabla de materiales).
      NOTA: Manejar la extracción manual de fibras de las semillas debido a la necesaria adherencia a la sujeción en las prensas de precisión unidas al goniómetro. Limpie la cuchilla antes de usarla, cortando una sección de la semilla para evitar agregar minerales indeseables durante el análisis.
   3. Limpie las muestras con aire comprimido para eliminar todos los residuos de partículas del corte (consulte la Tabla de materiales).
   4. Fije una sección de semillas en cinta conductora de carbono de doble cara (ver Tabla de materiales) en el soporte.
2. Condiciones de análisis
   1. Fije el soporte con una sección de semillas dentro de la cámara de vacío de un microscopio electrónico de barrido (SEM) acoplado con EDS (consulte la Tabla de materiales).
   2. Adquirir micrografías electrónicas en un modelo de microscopio con una aceleración de 20 kV y un tamaño de punto de 4.0, utilizando señales de electrones secundarios (ver Tabla de Materiales), electrones retrodispersados (detector de estado sólido fijado en la pieza polar) y mezclas de estos dos tipos de señales (MIX), construyendo imágenes coloreadas artificialmente.
   3. Para la adquisición de espectros EDS, utilice un espectrómetro (ver Tabla de Materiales) acoplado con el SEM antes mencionado. La configuración de la condición de la adquisición de imágenes de EDS es la misma que la del SEM.
   4. Establezca los grados de inclinación, la elevación y el acimut en 0,0, 35,0 y 0,0, respectivamente.
3. Adquisición de datos
   1. Establezca tres áreas diferentes con un aumento de 91x de la sección semilla para adquirir datos.
   2. Identifique los picos en el espectro al finalizar la adquisición o durante la adquisición. Utilice el botón de paso Confirmar elementos para identificar los picos manualmente.
   3. Establezca el tiempo de adquisición en 60 s para cada área seleccionada. Establezca el tiempo de proceso en cinco; Los parámetros están disponibles para un tiempo de proceso de uno a seis.
      NOTA: Los signos de los elementos son constantes y se suman, mientras que los ruidos son aleatorios y deletéreos. Cuanto mayor sea el tiempo de procesamiento, menor será el ruido.
   4. La configuración predeterminada para mostrar resultados cuantitativos significativos está por encima de dos sigmas (desviación estándar). Ponga dos sigmas a cero para reducir los resultados no deseados.
   5. Normalizar cada intensidad de los elementos; este es un parámetro estandarizado en el software (ver Tabla de Materiales).
   6. Para analizar los datos, expórtelos en un archivo DOC.
4. Análisis de datos
   1. Garantice la medición precisa de las intensidades máximas para el análisis elemental cuantitativo.
   2. Los picos superpuestos requieren deconvolución para una mejor separación de picos; Reste un fondo ruidoso cuando sea necesario.
   3. Cuando no haya superposición, aumente la ganancia para amplificar las señales y mejorar la calidad del espectro.

Representative Results

Discussion

Las plantas están compuestas de tejidos especializados para funciones bioquímicas específicas. Por lo tanto, el protocolo de preparación de muestras para MALDI-IMS debe diseñarse de acuerdo con varios tejidos vegetales con propiedades fisicoquímicas específicas, ya que las muestras deben mantener su distribución y abundancia de analitos originales para una señal de alta calidad y resolución espacial⁸.

Antes del análisis MALDI-IMS, la consideración principal es recolectar y almacenar muestras correctamente. Sin embargo, en las plantas, la preparación de la muestra suele variar en función del tejido analizado. Por ejemplo, la lignificación de la pared celular y el contenido de agua en los tejidos vegetales pueden plantear desafíos durante el corte para mantener una representación precisa de la morfología en la muestra⁷.

El análisis MALDI-IMS se puede dividir en un flujo de trabajo que consiste en la preparación y el corte de tejidos, el recubrimiento de la matriz y el análisis de datos. Sin embargo, la calidad y la autenticidad de los resultados de las imágenes se ven directamente afectadas por el método de preparación de la muestra, que es un paso crucial. El método de preparación de la muestra utilizado en este estudio se basó en un protocolo previamente publicado para semilla madura de E. oleracea ¹⁰. Para validar el protocolo de seccionamiento de otras muestras, evaluamos los pasos para el seccionamiento de muestras utilizando semillas de E. precatoria y E. edulis para adquirir secciones delgadas (20 μm) y permitir el análisis MALDI-IMS con una resolución adecuada. La mayor parte de la información se describe en detalle en la sección de protocolo; Sin embargo, enfatizamos que la eliminación manual de la capa externa de fibra es un paso importante para ablandar la semilla, lo que permite el seccionamiento de la hoja.

Por lo general, se desaconsejan los flujos de trabajo histológicos estándar para MALDI-IMS, ya que los procedimientos de fijación pueden provocar efectos de supresión de iones. La criosección es el método más utilizado para la preparación de muestras. Sin embargo, puede ocurrir un encogimiento o desmoronamiento de la muestra, lo que proporciona una dislocación del metabolito y dificulta la interpretación biológica ^5,8. Otra posibilidad para los tejidos blandos como hojas y flores es el método de impresión. Sin embargo, para este estudio, debido a la naturaleza del tejido duro y al bajo contenido de agua en las muestras, la técnica utilizada antes del corte fue incrustar la muestra con material específico para proporcionar secciones de tejido precisas y de alta calidad.

Cabe destacar que el grosor del tejido podría conducir a una reducción de la intensidad de la señal. En general, MALDI-IMS requiere un grosor de corte de <20 μm para proporcionar una resolución adecuada. Sin embargo, los tejidos vegetales duros y grandes generalmente se fracturan durante el corte de una muestra delgada. Para resolver este problema, el protocolo utilizó una cinta adhesiva conductora de cobre¹⁶, reduciendo la distorsión de las secciones y facilitando la fijación al portaobjetos. Además, es difícil obtener una sección delgada de la semilla entera sin remojarla en agua desionizada durante la noche. Sin embargo, la inclusión de la muestra durante este período de tiempo podría causar una dislocación de metabolitos; por lo tanto, en un estudio previamente publicado con la semilla de E. oleracea ¹¹, comparamos pequeñas secciones (húmedas y secas) con y sin la etapa de remojo, de las cuales los resultados indicaron que no había dislocación para las procianidinas encontradas en el tegumento de las semillas.

La deposición de la matriz es otro paso crítico para la homogeneidad de la matriz en la superficie de la sección de tejido, lo que garantiza la ionización del analito. Para la deposición de la matriz de MALDI, se evaluaron, en ensayos preliminares, diferentes matrices, como la 9-aminoacridina (9AA), el ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (HCCA), el 1,5-diaminonaptaleno (DAN) y el ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB). Se eligió DHB como matriz porque proporcionaba una mejor resolución de las señales de carbohidratos (datos no mostrados) y también debido a su naturaleza de “análisis universal”¹; Sin embargo, el método original empleaba un enfoque de sublimación^10,17, mientras que esta vez utilizamos la pulverización robótica automática para controlar las condiciones de recubrimiento de la matriz y proporcionar una aplicación más uniforme y cristales de matriz más pequeños para obtener una imagen de mayor resolución y evitar los efectos de supresión de iones.

E. precatoria y E. edulis presentan semillas de forma globosa con endospermo voluminoso homogéneo cubierto por un tegumento externo delgado, que solo difiere de las semillas de E. oleracea por su característico endospermo rumiado 10,18,19. Las naturalezas no convencionales encontradas para estas muestras de plantas proporcionaron dificultades de procesamiento similares para los protocolos de corte y deposición de matrices adaptados. Sin embargo, estos resultados indican que la preparación de la muestra fue adecuada y proporcionó imágenes confiables y efectivas, lo que determinó la localización espacial de los metabolitos en semillas de E. precatoria y E. edulis. Los análisis de MALDI-IMS permitieron la explotación potencial de estas materias primas por primera vez en la literatura a partir de sus datos de mapeo molecular.

Los datos de EDS indicaron una presencia de potasio menor al 1% en los tejidos de semillas analizados de E. edulis y E. precatoria. Sin embargo, la concentración fue lo suficientemente alta como para proporcionar picos de [M+K]⁺ durante el análisis MALDI-IMS. Estudios previamente publicados habían identificado el potasio como el principal mineral encontrado en ambas semillas^20,21, lo que indica una presencia natural de potasio en las semillas del género Euterpe y explica los aductos en los datos de MALDI-IMS de estas especies.

En este estudio, también se evaluó la prueba de concepto de que el protocolo ideado para la semilla de E. oleracea se implementó para las semillas de E. precatoria y E. edulis. El polisacárido de reserva que se encuentra en el endospermo de la semilla de açaí (E. oleracea) es mayoritariamente manano²², cuya organización es altamente cristalina, potenciando la dureza del endospermo para obtener secciones delgadas de semillas maduras^10,19. Estudios previos cuantificaron los carbohidratos en el endospermo de ambas semillas por métodos gravimétricos, encontrando un contenido superior al 90% del peso seco de las semillas^20,21. Además, un estudio histoquímico en E. edulis sugirió la presencia de manano en el endospermo a través de su birrefringencia altamente cristalina y fuerte bajo luz polarizada¹⁸. Sin embargo, no existen datos sobre la composición química de los hidratos de carbono de reserva en el endospermo de ambas semillas. Debido a su proximidad filogenética a la semilla de E. oleracea, también se espera que los oligómeros de hexosa identificados por MALDI-IMS sean manano-oligosacáridos. Aún así, existe la necesidad de futuros estudios que evalúen la composición química de estos polisacáridos de reserva para confirmar las estructuras de manano y manano-oligosacárido en las semillas de E. precatoria y E. edulis.

Este protocolo se puede aplicar como una herramienta útil en estudios de esas semillas, que van más allá de nuestro objetivo descrito aquí. Por ejemplo, esta técnica podría beneficiar el análisis de los procesos bioquímicos durante el desarrollo y la germinación de las semillas. Por último, la descripción detallada que se proporciona aquí puede ser un punto de partida útil para el diseño de protocolos adaptados para el análisis por parte de MALDI-IMS de otros materiales resistentes procedentes de plantas.

Materials

1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81320
2,5-Dihydroxybenzoic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	149357
APCI needle	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	602193
AxiDraw V3 xy motion platform	Evil Mad Scientist, CA, USA	2510
Carbon double-sided conductive tape
Compass Data Analysis software 			creation of mass list
Compressed air
copper double-faced adhesive tape	3M, USA	1182-3/4"X18YD
Cryostat CM 1860 UV	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany
Diamond Wafering Blade 15 HC
Everhart-Thornley detector
FlexImaging	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		image acquisition
FTMS Processing	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		data calibration
Gelatin from bovine skin	Sigma Aldrich Co, MO, USA	G9391
High Profile Microtome Blades Leica 818	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany	0358 38926
indium tin oxide coated glass slide	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8237001
Inkscape	Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA
IsoMet 1000 precision cutter	Buehler, Illinois, USA
Methanol	J.T.Baker	9093-03
Mili-Q water			18.2 MΩ.cm
Oil vacuum pump
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher HealthCare, Texas, USA	4585
Parafilm "M" Sealing Film	Amcor	HS234526B
Quanta 450 FEG	FEI Co, Hillsboro, OR, USA
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software 	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Software INCA Suite 4.14 V	Oxford Instruments, Ableton, UK
Solarix 7T	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Syringe pump	kdScientific, MA, USA	78-9100K
Trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	302031
X-Max spectrometer	Oxford Instruments, Ableton, UK