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Impactador automatizado para el modelo de lesión medular contusiva en ratones

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DOI:

10.3791/65656

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19 de enero de 2024

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1Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital, Jinan University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta un novedoso dispositivo automatizado de contusión por lesión de la médula espinal para ratones, que puede producir con precisión modelos de contusión por lesión de la médula espinal con diversos grados.

Resumen

La lesión de la médula espinal (LME) debida a lesiones traumáticas, como accidentes automovilísticos y caídas, se asocia con una disfunción permanente de la médula espinal. La creación de modelos de contusión de lesión medular por impacto en la médula espinal da lugar a patologías similares a la mayoría de las lesiones medulares en la práctica clínica. Los modelos animales precisos, reproducibles y convenientes de lesión de la médula espinal son esenciales para estudiar la lesión de la médula espinal. Presentamos un novedoso dispositivo automatizado de contusión por lesión de la médula espinal para ratones, el sistema inteligente de lesión de la médula espinal de la Universidad de Guangzhou Jinan, que puede producir modelos de contusión por lesión de la médula espinal con precisión, reproducibilidad y comodidad. El sistema produce con precisión modelos de diversos grados de lesión de la médula espinal a través de sensores de distancia láser combinados con una plataforma móvil automatizada y un software avanzado. Utilizamos este sistema para crear tres niveles de modelos de ratones con lesión de la médula espinal, determinamos sus puntuaciones en la escala de ratón de Basso (BMS) y realizamos ensayos de comportamiento y tinción para demostrar su precisión y reproducibilidad. Mostramos cada paso del desarrollo de los modelos de lesión utilizando este dispositivo, formando un procedimiento estandarizado. Este método produce modelos reproducibles de contrusión por lesión de la médula espinal en ratones y reduce los factores de manipulación humana a través de procedimientos de manipulación convenientes. El modelo animal desarrollado es fiable para estudiar los mecanismos de lesión de la médula espinal y los enfoques de tratamiento asociados.

Introducción

La lesión de la médula espinal generalmente resulta en una disfunción permanente de la médula espinal debajo del segmento lesionado. Es causada principalmente por objetos que golpean la columna vertebral y la hiperextensión de la columna vertebral, como accidentes de tráfico y caídas1. Debido a la limitada disponibilidad de opciones de tratamiento eficaces para la lesión de la médula espinal, la elucidación de la patogénesis de las lesiones de la médula espinal utilizando modelos animales será informativa para el desarrollo de enfoques de tratamiento adecuados. El modelo de contusión de lesión medular causada por impacto en la médula espinal da lugar al desarrollo de modelos animales con patologías similares a la mayoría de los casos clínicos de lesión medular 2,3. Por lo tanto, es importante producir modelos animales precisos, reproducibles y convenientes para la contusión por lesión de la médula espinal.

Desde la invención por Allen del primer modelo animal de lesión medular en 1911, se han producido importantes avances en el desarrollo de instrumentos para establecer modelos animales de lesión medular 4,5. Con base en los mecanismos de lesión, los modelos de lesión de la médula espinal se clasifican como contusión, compresión, distracción, dislocación, transección o químico6. Entre ellos, los modelos de contusión, que utilizan fuerzas externas para desplazar y lesionar la médula espinal, son los más cercanos a la etiología clínica de la mayoría de los pacientes con lesión medular. Por lo tanto, el modelo de contusión ha sido utilizado por muchos investigadores en estudios de lesión medular 3,7. Se utilizan varios instrumentos para desarrollar modelos de contusión por lesión de la médula espinal. El impactador multicéntrico de la Universidad de Nueva York (NYU) sobre lesiones medulares en animales (MASCIS) produce contusiones de lesiones medulares mediante un dispositivo de caída de peso8. Después de varias versiones actualizadas, el impactador MASCIS es ampliamente utilizado para desarrollar modelos animales de contusión por lesión medular9. Sin embargo, cuando la varilla de impacto de MASCIS cae y golpea la médula espinal, pueden producirse múltiples lesiones, lo que afecta al grado de lesión en los modelos de lesión medular. Además, lograr la precisión mecánica para garantizar la exactitud del instrumento y la repetibilidad del modelo de fabricación también es un desafío. Los impactadores de horizonte infinito causan contusiones controlando la fuerza aplicada a la médula espinal en lugar de gotas pesadas10. Utiliza una computadora conectada a un sensor para medir directamente la fuerza de impacto entre el impactador y la médula espinal. Cuando se alcanza el umbral, el impactador se retrae inmediatamente, evitando así el rebote del peso y mejorando la precisión10,11. Sin embargo, el uso de esta modalidad de motricidad fina para infligir daño puede resultar en daño inconsistente y déficits funcionales6. El dispositivo de la Universidad Estatal de Ohio (OSU) comprime la superficie dorsal de la médula espinal a una velocidad transitoria mediante un controlador electromagnético12,13. Este dispositivo es similar a los impactadores de horizonte infinito, ya que utiliza compresiones de corta distancia para causar lesiones de la médula espinal. Sin embargo, tiene varias limitaciones, ya que la determinación inicial del punto cero provocará errores debido a la presencia del líquido cefalorraquídeo 6,14. En resumen, hay muchos instrumentos que se pueden utilizar para desarrollar modelos animales de contusión por lesión medular, pero todos tienen algunas limitaciones que conducen a una precisión y reproducibilidad insuficientes de los modelos animales. Por lo tanto, para crear de forma más precisa, cómoda y reproducible modelos de contusión de ratón de lesión medular, se necesita un impactador de lesión medular automatizado e inteligente.

Presentamos un nuevo impactador de lesiones de la médula espinal, el sistema inteligente de lesiones de la médula espinal de la Universidad de Guangzhou Jinan (sistema G smart SCI; Figura 1), para producir modelos de contusión por lesión medular. El dispositivo utiliza un telémetro láser como dispositivo de posicionamiento, combinado con una plataforma móvil automatizada para automatizar los golpes de acuerdo con los parámetros de impacto establecidos, incluida la velocidad de golpeo, la profundidad del golpe y el tiempo de permanencia. La operación automatizada reduce los factores humanos y mejora la precisión y la reproducibilidad de los modelos animales.

Protocolo

Los estudios con animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Jinan.

1. Anestesia de animales y laminectomía espinal T10

  1. Para este estudio, se utilizaron ratones C57/6J adultos jóvenes hembras de 8 semanas de edad. Anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg) y diazepam (5 mg/kg). Comprobar si la anestesia es exitosa indicada por la pérdida del reflejo del dolor. Aplique ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad bajo anestesia.
  2. Afeita el vello de la espalda de los ratones con una afeitadora para revelar la piel. Desinfectar la piel con tres rondas alternas de yodoforo y alcohol.
  3. Realizar una incisión longitudinal medial de 2,5 cm en la piel dorsal con un bisturí y exponer la columna vertebral a nivel T9-T11 con unas pinzas.
  4. Fijar bilateralmente las facetas T10 con un fijador espinal. Asegúrese de que la columna vertebral esté fijada de manera estable. Asegúrese de que los músculos paravertebrales estén despojados y elimine la apófisis espinosa, así como las láminas, utilizando un taladro de micromolienda para exponer la médula espinal del segmento T10.

2. Contusión de la médula espinal T10 con el sistema G smart SCI

  1. Encienda el interruptor y espere a que el dispositivo vuelva automáticamente a su estado original. Coloque el fijador espinal en el sistema G smart SCI y asegúrelo con tornillos.
  2. Con la pantalla táctil de operación (Figura 2A), establezca los parámetros de daño, incluida la velocidad de impacto (1 m/s), la profundidad de impacto (0,5 mm, 0,8 mm y 1,1 mm para tres conjuntos diferentes de ratones) y el tiempo de permanencia (500 ms)15.
  3. Alinee el telémetro láser en el centro de la médula espinal expuesta moviendo la plataforma. (Figura 2B)
  4. Haga clic en el botón Listo en la pantalla táctil (Figura 2C). El cabezal de impacto se ajustará automáticamente a una altura específica en función de los parámetros de configuración. La mesa portadora mueve automáticamente el sitio de impacto de la médula espinal por debajo de la cabeza de impacto.
  5. Presione manualmente el cabezal de impacto para determinar aún más el sitio del impacto. Haga clic en el botón Inicio , la cabeza de impacto golpeará la médula espinal según los parámetros establecidos.
  6. Retire a los ratones del dispositivo y observe bajo un microscopio estereoscópico (20x) para determinar la lesión de la médula espinal (Figura 3). Para determinar el éxito del desarrollo del modelo, observe la congestión local, el colapso y la ruptura de la membrana espinal.
  7. Suturar el músculo, la fascia y la piel capa por capa utilizando suturas 3-0. Coloque los ratones en una caja tibia y espere su recuperación.

3. Cuidados postoperatorios

  1. Inyectar meloxicam (5 mg/kg) por vía subcutánea diariamente durante 7 días después de la cirugía. Vacíe manualmente la vejiga cada 8 h hasta que se restablezcan las funciones de la vejiga.
  2. A los 14 días después de la operación, retire los hilos de sutura.

4. Pruebas de los efectos de la lesión medular

  1. Calcular las puntuaciones de BMS en ratones desde el primer día postoperatorio16,17.
  2. En el30º día postoperatorio, realizar experimentos de comportamiento animal, incluyendo pasarela, falla del pie y rotarod16,17. Pasarela: Distancia récord de 45 cm; Duración máxima de la ejecución 8 s; Ganancia de cámara 28.02; Umbral de intensidad 0,01. Fallo del pie: Registre 60 pasos para cada ratón. Rotarod: Velocidad 20 rpm. Registre el tiempo de caída del ratón y grábelo como 120 s durante más de 120 s.
  3. En el 31º día postoperatorio, anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg) y diazepam (5 mg/kg) y luego sacrificar a los ratones por perfusión utilizando PFA al 4%. Retire la médula espinal con cuidado e intercepte 5 mm por encima y por debajo del sitio de la lesión para la inclusión en parafina. Realizar una sección de 5 μm del centro de la lesión medular del ratón y realizar la tinción de hematoxilina y eosina17.
  4. Para el análisis estadístico utilice software comercial. Expresar los datos como media ± error estándar de la media (SEM) y compararlos utilizando ANOVA de un factor; p < 0,05 se consideró significativo.

Resultados

La laminectomía se realizó en 24 ratones hembra (8 semanas de edad) como se describió anteriormente. Los ratones del grupo simulado (n = 6) no fueron sometidos a lesión de la médula espinal, mientras que el resto de los ratones, incluidos el grupo de 0,5 mm (n = 6), el grupo de 0,8 mm (n = 6) y el grupo de 1,1 mm (n = 6) fueron sometidos a diferentes profundidades de pinzamiento de la médula espinal. Las puntuaciones de BMS se registraron regularmente hasta 1 mes después de la operación (Figura 4). Hubo diferencias significativas en las puntuaciones postoperatorias de BMS de ratones en diferentes grupos. Después de 1 mes, los ratones en el grupo de 0,5 mm tuvieron de 4 a 6 puntuaciones postoperatorias y se recuperaron a un nivel similar al del grupo simulado. Los ratones de los grupos de 0,8 mm y 1,1 mm tuvieron de 1 a 2 puntuaciones postoperatorias. Después de 1 mes, el grupo de 0,8 mm se recuperó a 4 a 6 puntuaciones, mientras que los ratones del grupo de 1,1 mm apenas se recuperaron.

Después de 1 mes, se realizaron ensayos de comportamiento animal, incluyendo falla en el pie, rotarod y pasarela. En el ensayo de falla del pie (Figura 5A), no hubo diferencias significativas en la falla del pie de las extremidades posteriores entre los grupos de 0,5 mm y simulados. Sin embargo, la falla del pie de la extremidad posterior para el grupo de 0,8 mm fue significativamente diferente de todos los demás grupos. La tasa de falla del pie de los ratones en el grupo de 1,1 mm fue del 100% porque las extremidades traseras no podían sostener al animal en el suelo y fue significativamente diferente de los otros grupos. En la prueba de rotarod (Figura 5B), registramos el tiempo de latencia para caer en diferentes grupos de ratones. Tanto el grupo de 0,8 mm como el de 1,1 mm fueron significativamente diferentes de los otros grupos, pero el grupo simulado tuvo resultados similares al grupo de 0,5 mm. En la prueba de pasarela (Figura 6), registramos y analizamos el índice de regularidad y el área de contacto posterior máxima en diferentes grupos de ratones. Hubo diferencias significativas en el índice de regularidad y en las áreas de contacto máximo posterior entre los ratones de diferentes grupos, lo que implica diferencias significativas en las funciones de marcha entre los ratones con diferentes profundidades de lesión medular. Por lo tanto, se pueden crear modelos de ratones con diferentes profundidades de lesión medular y con diferencias significativas en sus funciones de las extremidades posteriores utilizando el dispositivo desarrollado.

Finalmente, resecamos la médula espinal de ratones (Figura 7A) e hicimos secciones para la tinción de hematoxilina y eosina (HE) (Figura 7C). Hubo varios grados de daño tanto en las imágenes de la médula espinal como en las secciones teñidas con HE. En resumen, desarrollamos con precisión diferentes grados de modelos de ratones con lesión medular utilizando el instrumento propuesto.

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Figura 1: Sistema inteligente de lesión de la médula espinal de la Universidad de Guangzhou Jinan (sistema G smart SCI). Fije el inmovilizador espinal para inmovilizar el mouse en la mesa de transporte. Ajuste los parámetros de impacto a través de la pantalla táctil. Utilice el microcontrolador lateral para ajustar las posiciones laterales del portador y utilice la pantalla táctil para ajustar las posiciones frontales. El telémetro láser confirma la posición de impacto y mide la altura de impacto para que el cabezal de impacto pueda golpear con precisión de acuerdo con la posición de impacto y la profundidad establecidas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Pantalla táctil de funcionamiento. (A) En la página de parámetros, se pueden configurar los parámetros de daño, incluida la velocidad de impacto (0,5 -2,0 m/s), la profundidad de impacto (0 -3 mm) y el tiempo de permanencia (500 -2 ms). (B) En la página móvil, se puede configurar la altura de la cabeza de impacto y la posición del fijador espinal. (C) En la página de preparación, al hacer clic en el botón Listo , se ajustará automáticamente el cabezal de impacto y la mesa portadora a una posición específica en función de los parámetros establecidos. Al hacer clic en el botón Inicio , la cabeza de impacto golpeará la médula espinal según los parámetros establecidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Médula espinal después de una lesión. (A) Grupo simulado. El inmovilizador espinal inmovilizó las vértebras T10 y la médula espinal queda expuesta después de la laminectomía sin daños. (B) Grupo de 0,5 mm. La médula espinal resultó levemente lesionada tras ser golpeada a una profundidad de 0,5 mm y hubo una pequeña congestión. (C) Grupo de 0,8 mm. La médula espinal estaba moderadamente lesionada y tenía una congestión evidente después de ser golpeada a una profundidad de 0,8 mm. (D) grupo de 1,1 mm. La médula espinal resultó gravemente herida tras ser golpeada a una profundidad de 1,1 mm y había mucha congestión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Las puntuaciones del BMS. Las puntuaciones de BMS de los ratones se registraron desde el primer día postoperatorio hasta un mes después de la operación (n = 6 /grupo). *p< 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 en comparación con el ANOVA de un factor. La fecha se expresa como media ± error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Prueba de pisada y prueba de rotarod. (A) Fallos en las extremidades posteriores del pie en ratones con diferentes grados de lesiones medulares (n = 6 /grupo). p <0,001 en comparación con el ANOVA de un factor. (B) Se comparó la latencia a la caída durante la aceleración del rotarod entre ratones con diferentes grados de lesiones de la médula espinal (n = 6 / grupo). * p < 0,05, *** p < 0,001 en comparación con el ANOVA de un factor. La fecha se expresa como media ± error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Test de pasarela. (A, C) Índices de regularidad en ratones con diferentes grados de lesiones medulares (n = 6 /grupo). * p < 0,05, *** p < 0,001 en comparación con el ANOVA de un factor. (B, D) Las áreas de contacto máx. posteriores se analizaron automáticamente utilizando el software (n = 6 /grupo). ** p < 0,01, *** p < 0,001 en comparación con el ANOVA de un factor. La fecha se expresa como media ± error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Tinción de la médula espinal y H&E. (A) Médula espinal de ratones con diferentes grados de lesión 1 mes después de la cirugía. B) Cifras ampliadas. (C) Tinción de H&E de sitios de lesión de la médula espinal en ratones con diferentes grados de lesión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La lesión de la médula espinal puede provocar déficits sensoriales y motores, lo que puede provocar graves deficiencias físicas y mentales. En China, la incidencia de lesiones de la médula espinal en diferentes provincias varía de 14,6 a 60,6 por millón18. El aumento de la prevalencia de la LME ejercerá más presión sobre el sistema sanitario. En la actualidad, existen pocas opciones de tratamiento eficaces para la lesión medular, las lesiones debido a que sus mecanismos patológicos y procesos de reparación aún no se comprenden completamente19. Existe la necesidad de crear modelos animales de lesiones de la médula espinal precisos y reproducibles para investigar los mecanismos patológicos y los procesos de reparación de las lesiones de la médula espinal. Con este fin, desarrollamos un instrumento preciso, repetible y simple para la lesión de la médula espinal.

Muchos dispositivos, incluyendo el impactador NYU-MASCIS y el impactador de horizonte infinito y el impactador OSU se utilizan para crear modelos de contusión de lesiones de la médula espinal 8,9,12,13,20. Estos dispositivos son complejos de operar y pueden producir grandes errores debido a las diferentes competencias del personal. Además, existen varios defectos en los diseños de estos dispositivos que los hacen menos precisos y reproducibles6. La localización específica de la lesión medular determina su gravedad, por lo que durante el establecimiento de modelos de lesión medular, el método de posicionamiento determina la precisión del modelado21. El sistema G smart SCI utiliza un telémetro láser para localizar el sitio de la lesión de la médula espinal y ajusta la altura de la cabeza de impacto en función de los datos del telémetro para establecer la profundidad del golpe. Otro dispositivo de percusión que utiliza posicionamiento láser es el impactador del aparato del sistema de lesiones de Louisville (LISA) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Indiana15. Aunque LISA utiliza el posicionamiento láser, requiere la determinación manual y el ajuste de la altura de la cabeza de impacto para lograr una profundidad de impacto controlada, lo que aumenta la intervención humana. Por su parte, LISA utiliza cerraduras neumáticas y control de portátiles, lo que requiere más espacio experimental y aumenta los costes operativos10. El sistema G smart SCI reduce los errores humanos al semiautomatizar el proceso de operación y es fácil de mover debido a su diseño liviano.

Basándose en parámetros establecidos, el dispositivo puede impactar con precisión en la médula espinal de ratones, creando así modelos con diferentes grados de lesiones de la médula espinal. En este estudio, los ratones con diferentes grados de lesiones de la médula espinal mostraron diferencias significativas en las funciones de las extremidades posteriores. Es importante destacar que los ensayos son reproducibles y pueden generar modelos SCI de manera consistente.

En el protocolo, los pasos más críticos incluyen la realización precisa de la laminectomía, la estabilización de las espinas de los ratones y el uso del láser para un posicionamiento preciso que garantice la precisión y la repetibilidad del experimento. Durante el proceso de diseño, hicimos algunas mejoras en el dispositivo. Descubrimos que después del golpe, el escenario no podía regresar fácilmente al punto de alcance, por lo tanto, agregamos un botón para regresar al punto de rango. Además, los parámetros deseados no se podían ajustar rápidamente, por lo que agregamos un teclado numérico para la entrada. También se mejoró el accionamiento electromagnético de carga lenta de la primera versión. Este dispositivo se limita actualmente al establecimiento de modelos de ratones con contusión por lesión medular torácica. Se deben realizar estudios que apoyen el uso de este instrumento en el establecimiento de modelos de lesión medular en ratas o modelos de lesión medular cervical.

Además, el Dr. Bilgen, de la Facultad de Medicina de la Universidad de Kansas, describió un dispositivo impactador controlado por ordenador, que puede inducir lesiones del sistema nervioso central (SNC), incluyendo lesiones cerebrales traumáticas (LCT) y lesiones de la médula espinal (LME)22. Al igual que nuestro dispositivo, este dispositivo también utiliza una variedad de equipos y sistemas comercializados, por lo que se comercializó y utilizó con éxito23. El equipo que describimos tiene las características de automatización, precisión y conveniencia, y se espera que se comercialice en el futuro y beneficie a más investigadores de lesiones medulares.

En resumen, diseñamos un impactador automatizado de la médula espinal de ratón para crear modelos de contusión medular. El dispositivo mejora la precisión con un telémetro láser y reduce los errores humanos a través de un proceso operativo automatizado. Además, el sistema G smart SCI es más fácil de operar y transportar que otros dispositivos, lo que brinda comodidad a la investigación de lesiones de la médula espinal. Es importante destacar que el dispositivo puede crear de forma precisa y reproducible diferentes clases de modelos de ratones SCI en función de las necesidades del experimento.

Divulgaciones

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, Nos. 82102314 (a ZSJ) y 32170977 (a HSL) y la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Guangdong, Nos. 2022A1515010438 (a ZSJ) y 2022A1515012306 (a HSL). Este estudio fue apoyado por el Programa de Tecnología de Frontera Clínica del Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Jinan, China, Nos. JNU1AF- CFTP- 2022- a01206 (a HSL). Este estudio contó con el apoyo del Proyecto del Plan de Ciencia y Tecnología de Guangzhou, Nos. 202201020018 (a HSL), 2023A04J1284 (a ZSJ) y 2023A03J1024 (a HSL).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.01M PBS (polvo, pH7.2-7.4)Solarbio Life SciencesP1010
2,2,2-TribromoetanolMacklin75-80-9
4% paraformaldehído fijador de tejidosBiosharp life scienceBL539A
BiomicroscopioLeicaLCC50 HD
CatWalk Noldus Information TechnologyCatWalk XT 9.1
Cubierta de vidrioCITOTEST Scientific10212432C
Máquina de incrustaciónChangzhou Zhongwei Instrumento electrónicoBMJ-A
Etanol absolutoDAMAO64-17-5
FootFaultScanClever Sys Inc.-
vidrioCITOTEST Scientific80302-2104
Kit de tinción de hematoxilina y eosinaBeyotime BiotechnologyC0105S
taladro de micromolienda FEIYUBIO19-7010
Fijador espinal de ratónRWD Life Science68094
Microtomo de parafinaThermoshandon finesse 325
RotaRod para ratonesUgo Basile47600
Microscopio estereoscópicoKUY NICESZM-7045
Terc-Alcohol amílicoMacklin75-85-4
XilenoFarmacéutico Nacional de China#10023418
Portaobjetos de

Referencias

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