El modelo de ratón Indicador de Acción de la Hormona Tiroidea se desarrolló para permitir la cuantificación específica del tejido de la acción local de la hormona tiroidea utilizando su maquinaria reguladora endógena. Recientemente, se ha demostrado que el modelo es adecuado para caracterizar sustancias químicas disruptoras endocrinas que interactúan con la economía de la hormona tiroidea, tanto mediante metodologías ex vivo como in vivo .
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Artículo de método
Caracterización in vivo de los efectos químicos disruptores endocrinos a través del indicador de acción de la hormona tiroidea en ratones
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En este artículo
Resumen
Resumen
Las hormonas tiroideas (TH) desempeñan un papel fundamental en el metabolismo celular y la función de los tejidos. La economía de TH es susceptible a las sustancias químicas disruptoras endocrinas (EDC, por sus siglas en inglés) que pueden alterar la producción o la acción de las hormonas. Muchos contaminantes ambientales son alteradores endocrinos, lo que representa una amenaza emergente tanto para la salud humana como para la producción agrícola. Esto ha dado lugar a un aumento de la demanda de sistemas de prueba adecuados para examinar los efectos de los posibles EDC. Sin embargo, las metodologías actuales se enfrentan a desafíos. La mayoría de los sistemas de prueba utilizan marcadores endógenos regulados por múltiples procesos reguladores, a menudo complejos, lo que dificulta la distinción de los efectos directos e indirectos. Además, los sistemas de ensayo in vitro carecen de la complejidad fisiológica del metabolismo y la farmacocinética de los EDC en los mamíferos. Además, la exposición a los EDC ambientales suele implicar una mezcla de múltiples compuestos, incluidos los metabolitos generados in vivo , por lo que no se puede ignorar la posibilidad de interacciones. Esta complejidad dificulta la caracterización de los EDC. El ratón Indicador de Acción de la Hormona Tiroidea (THAI) es un modelo transgénico que lleva un sistema reportero de luciferasa sensible a TH, lo que permite evaluar la acción de TH específica de tejido. Se pueden evaluar los efectos específicos de los tejidos de las sustancias químicas sobre la acción local de la TH cuantificando la expresión del indicador de luciferasa en muestras de tejido. Además, con imágenes in vivo , el modelo de ratón THAI permite realizar estudios longitudinales sobre los efectos de posibles EDC en animales vivos. Este enfoque proporciona una poderosa herramienta para probar la exposición a largo plazo, las estructuras de tratamiento complejas o la abstinencia, ya que permite evaluar los cambios en la acción local de la TH a lo largo del tiempo en el mismo animal. Este informe describe el proceso de mediciones de imágenes in vivo en ratones THAI. El protocolo discutido aquí se centra en el desarrollo y la obtención de imágenes de ratones hiper e hipotiroideos, que pueden servir como controles. Los investigadores pueden adaptar o ampliar los tratamientos presentados para satisfacer sus necesidades específicas, ofreciendo un enfoque fundamental para futuras investigaciones.
Introducción
La señalización de la hormona tiroidea (TH) es un regulador fundamental del metabolismo celular, esencial para el desarrollo normal y el funcionamiento óptimo de los tejidos en la edad adulta1. Dentro de los tejidos, la acción de la TH está finamente controlada por una compleja maquinaria molecular, lo que permite el mantenimiento específico de los niveles locales de TH en cada tejido. Esta autonomía de los diferentes tejidos respecto a los niveles circulantes de TH es de gran importancia 2,3,4.
Numerosas sustancias químicas tienen el potencial de alterar las funciones endocrinas y se encuentran en el medio ambiente como contaminantes. Existe una preocupación creciente de que estas moléculas puedan ingresar a la cadena alimentaria a través de las aguas residuales y la producción agrícola, lo que afecta la salud del ganado y de los seres humanos 5,6,7.
Uno de los desafíos importantes para abordar este problema es la gran cantidad de compuestos involucrados, incluidas las moléculas autorizadas y ya prohibidas, pero aún presentes de manera persistente. En los últimos años, se han realizado esfuerzos sustanciales para desarrollar sistemas de prueba para el cribado y la identificación del potencial disruptivo de diversas sustancias químicas 8,9,10,11. Si bien estos métodos sobresalen en el cribado de alto rendimiento de miles de compuestos y en la identificación de amenazas potenciales, un análisis detallado de los efectos in vivo específicos de estas moléculas es esencial para establecer los peligros de la exposición humana. Por lo tanto, es necesario un enfoque multifacético al estudiar y caracterizar las sustancias químicas que alteran el sistema endocrino (EDC).
En el contexto de la regulación de la TH, la comprensión de las consecuencias específicas de los tejidos de la exposición a los EDC requiere cuantificar la acción local de la TH. Aunque se han desarrollado varios modelos in vivo para este propósito, la mayoría se basan en marcadores endógenos como medida de salida. A pesar de ser fisiológicos, estos marcadores están sujetos a numerosos mecanismos reguladores, tanto directos como indirectos, lo que dificulta su interpretación. Por lo tanto, la caracterización de los efectos de la EDC sobre la regulación de la TH a nivel tisular sigue siendo un reto importante12,13.
Para abordar los desafíos de medir la señalización de TH específica del tejido, recientemente se desarrolló el modelo de ratón Indicador de Acción de la Hormona Tiroidea (THAI). Este modelo permite cuantificar específicamente los cambios en la acción local de la TH en condiciones endógenas. Se introdujo un transgén de luciferasa en el genoma del ratón, que es altamente sensible a la regulación por la acción14 de TH. Este modelo ha demostrado eficacia en la respuesta a diversas preguntas de investigación que requieren cuantificar los cambios en la señalización local de THtisular 14,15,16,17,18.
El reconocimiento de un uso potencial del modelo THAI es la caracterización de los efectos específicos de los tejidos EDC sobre la señalización de TH. El modelo se ha empleado recientemente con éxito para investigar los efectos tisulares específicos del tetrabromobisfenol A y el diclazurilo en la señalización de TH15. Aquí, se presentan los protocolos de referencia para utilizar técnicas de imagen in vivo en el modelo THAI como sistema de prueba para caracterizar los EDC que interrumpen la función de TH. Este método aprovecha la naturaleza bioluminiscente de la reacción luciferina-luciferasa. Esencialmente, la enzima luciferasa expresada transgénicamente cataliza la oxidación de la luciferina administrada, generando luz luminiscente proporcional a la cantidad de luciferasa en el tejido (Figura 1). En consecuencia, la respuesta biológica medida es la actividad luciferasa, que ha sido validada como una medida adecuada de la acción local de TH14. Si bien el modelo THAI es aplicable para cuantificar la acción de la TH en prácticamente todos los tejidos, las imágenes in vivo se centran principalmente en la acción de la TH en el intestino delgado (imágenes ventrales) y el tejido adiposo marrón interescapular (BAT, imágenes dorsales)14.
Una ventaja significativa de la técnica de obtención de imágenes in vivo es que elimina la necesidad de sacrificar animales para realizar mediciones. Esto permite a los investigadores diseñar experimentos longitudinales y de seguimiento como estudios autocontrolados, reduciendo el sesgo entre sujetos y el número de animales utilizados. Este aspecto es particularmente crucial en la caracterización de EDC, y la fuerza y versatilidad del método para este propósito han sido previamente demostradas14,15.
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Protocolo
El presente protocolo fue revisado y aprobado por el Comité de Bienestar Animal del Instituto de Medicina Experimental (PE/EA/1490-7/2017, PE/EA/106-2/2021). Los datos presentados provienen de14 ratones THAI machos de 3 meses de edad FVB/Ant (n = 3-6/grupo). FVB/Antecedentes de hormigas Los animales tailandeses tienden a tener manchas altamente pigmentadas en la piel que pueden distorsionar las mediciones. Por lo tanto, busque manchas pigmentadas en la piel del área fotografiada después de la eliminación del pelo. Los animales no requieren condiciones especiales de alojamiento a menos que el experimento lo requiera específicamente (por ejemplo, una dieta especial).
1. Tratamiento del hipertiroidismo
NOTA: Aquí se proporciona un protocolo general para inducir hipertiroidismo en ratones. La guía ATA19 ofrece explicaciones detalladas sobre los antecedentes de los métodos con las alternativas mencionadas.
- Disolver T3 (3,5,3'-triyodotironina, ver Tabla de Materiales) en 40 mM de NaOH para crear una solución madre con una concentración entre 5-10 mg/mL.
- Diluir la solución madre con solución salina hasta una concentración final de 0,1 μg/μL.
- Inyectar la solución T3 diluida por vía intraperitoneal (i.p.) en animales despiertos a un volumen de 10 μL por gramo de peso corporal (pbg). Después de 24 h, los animales se considerarán hipertiroideos.
NOTA: El tratamiento con T3 puede ser reemplazado por cualquier otro tipo de tratamiento. El tratamiento no afecta al protocolo de obtención de imágenes in vivo .
2. Tratamiento del hipotiroidismo
NOTA: Aquí, solo se proporciona un protocolo general para inducir hipotiroidismo en ratones. La guía ATA19 describe explicaciones detalladas sobre los antecedentes de los métodos con las alternativas mencionadas.
- Cambie la dieta a una dieta sin yodo y agregue KClO4 y metimazol al agua potable (0,01 % de metimazol, 0,05 % de KClO4) (ver Tabla de materiales).
- Reemplace la solución para beber regularmente (cada 2-3 días) con una solución para beber fresca porque el metimazol es sensible a la luz y se degrada rápidamente.
- Mantenga el régimen de tratamiento durante al menos 2 semanas, no más de 4 semanas. Los animales perderán peso y mostrarán molestias. Si los animales apenas se mueven, han perdido gran parte de su pelo o apenas están conscientes, utilice un criterio de valoración humanitario y acabe con ellos por cualquier método (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente).
- Continúe el tratamiento contra el hipotiroidismo cuando se combine con otros tratamientos para prevenir la posible recuperación del hipotiroidismo.
3. Imágenes in vivo
- Inicie el software compatible con el sistema de imágenes in vivo (consulte la tabla de materiales).
- Inicie sesión y espere a que se cargue el panel "Asistente de imágenes". Es un panel más pequeño en la parte inferior izquierda de la ventana.
- En el "Asistente de imágenes", inicie el enfriamiento de la cámara haciendo clic en Inicializar en el "panel Asistente de imágenes". Esto hace que el instrumento ejecute un protocolo de configuración, espere a que se complete. El "panel del asistente de imágenes" se vuelve azul y se encenderá una luz verde en el panel cuando la temperatura de la cámara sea lo suficientemente baja y el instrumento esté listo.
- Ajuste la temperatura de la almohadilla térmica a 30-37 °C para mantener calientes a los animales medidos.
NOTA: Continúe con el protocolo mientras espera que la temperatura de la cámara sea óptima. - No mantenga ni trate a los animales cerca del instrumento. Evite que circule una cantidad excesiva de pelo en el aire alrededor del instrumento.
- Anestesiar de 1 a 3 animales con ketamina-xilacina i.p. inyectable (ketamina 50 mg/kg de peso corporal, xilacina 10 mg/kg de peso corporal, ver Tabla de Materiales). Alternativamente, si se instala un sistema anestésico de isoflurano, siga los protocolos aprobados institucionalmente para usar anestesia con isoflurano, reemplazando la mezcla de ketamina y xilacina.
NOTA: Los ratones hipotiroideos son más sensibles a la ketamina-xilacina; Use media dosis. - Use gel de protección ocular durante la anestesia.
- Compruebe el reflejo del pedal pellizcando las almohadillas de los pies. Ningún reflejo pedal confirma el estado de la anestesia quirúrgica.
- Después de que la anestesia haga efecto, retire el pelo de las partes del cuerpo fotografiadas utilizando el método de eliminación de pelo más adecuado (depiladora, afeitado, crema, etc.). Asegúrese de que no quede pelo en las partes del cuerpo fotografiadas para evitar la dispersión de la luz luminiscente.
- Disolver Na-luciferina (ver Tabla de Materiales) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x a una concentración de 15 mg/mL. Luciferin es sensible a la luz; Evite la exposición directa a la luz. Guarde la solución en tubos de color ámbar o envuélvala en papel de aluminio.
- Tratar a los animales afeitados con solución de luciferina 10 μL/bwg i.p.
- Coloque a los animales en el instrumento con el punto central de la cámara marcado como un '+' en la almohadilla. Asegúrese de que la ubicación sea adecuada comprobando las líneas de la cuadrícula y confirmando con una sola captura de "Foto" si no está seguro.
- Espere 15 minutos después de la administración del sustrato antes de realizar la primera medición. Durante este tiempo, establezca el tiempo de imagen en el panel "Asistente de imagen" en 3 minutos para luminiscencia y marque las casillas de Foto y Luminiscencia. La 'Foto' debe coincidir con la luminiscencia para identificar la fuente de la señal medida.
NOTA: Se requieren 15 minutos para una absorción óptima del sustrato y la distribución del tejido. La señal luminiscente se estabiliza 15-20 minutos después de la administración de luciferina. La señal comienza a disminuir lentamente después de la meseta. - Realice la primera medición haciendo clic en Medir en el panel "Asistente de imágenes".
- Si se realizan imágenes tanto ventrales como dorsales, reorganice a los animales para obtener imágenes de la segunda parte del cuerpo inmediatamente después de concluir la primera.
- Después de tomar las imágenes, regrese a los animales a sus jaulas y continúe el experimento con el siguiente grupo de animales.
- Deje que los animales se recuperen, lo que suele tardar entre 1 y 2 horas como máximo. Coloque un tubo lleno de agua tibia cerca de los animales para facilitar la recuperación y controle los signos vitales como la respiración y la perfusión.
- Decide el destino de los animales medidos. En los datos presentados en este artículo, los animales medidos fueron sacrificados siguiendo protocolos aprobados institucionalmente para mediciones ex vivo . Sin embargo, esto no es necesario. Considere si la eutanasia o los experimentos de seguimiento son éticos.
4. Análisis de datos
- Abra el archivo "ClickInfo" en el software. Se abrirá un panel llamado "Paleta de herramientas" para el análisis y la edición de imágenes en el lado derecho de la ventana.
- Convierte la escala en resplandor en la esquina superior izquierda de la imagen.
- Haga clic en "Ajustar imagen".
- Decida el agrupamiento y la escala de color óptimos de las imágenes. Haga que todas las imágenes utilicen la misma configuración.
- Haga clic en "Herramientas ROI" en la "Paleta de herramientas".
- Seleccione las áreas de interés haciendo clic en "Colocar ROI" en las "Herramientas de ROI". El uso de ROI del mismo tamaño o ROI de diferentes tamaños también puede ser significativo dependiendo del diseño experimental.
- Haz clic en "Medir el ROI". Se abrirá una nueva ventana con los datos de los ROI colocados. Exporte los datos con el comando ctr + c-ctrl + v de Windows a un software de organización o estadística de su elección.
- Los datos se pueden exportar como flujo total o radiancia promedio. Elija qué variable es la más relevante en el entorno experimental actual.
- Continuar con el análisis de los datos de acuerdo con el diseño experimental. Se recomienda el cálculo individual de los valores (de fondo tratado) como "efecto medido en un animal".
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Resultados
Generalmente, la radiancia medida oscila entre magnitudes de 105 y 1010 p/s/cm2/sr. Sin embargo, los valores exactos pueden variar entre animales dentro de la misma imagen y en diferentes imágenes. Por lo tanto, comparar datos sin procesar puede ser engañoso. Es crucial establecer señales de control y de fondo en todos los experimentos, por lo que los diseños autocontrolados son muy recomendables.
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Discusión
Las amenazas que plantean los alteradores endocrinos (EDC) para la salud humana son bien reconocidas; sin embargo, la investigación sobre los alteradores endocrinos se enfrenta a enormes desafíos. Estos desafíos son en parte consecuencia de la complejidad del sistema endocrino. Se ha identificado que muchos EDC alteran simultáneamente múltiples sistemas endocrinos22. Además, en el contexto de la economía de la hormona tiroidea (TH), existe una capa adicional de complejidad debido a las diferencias...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Proyecto No. El RRF-2.3.1-21-2022-00011, titulado Laboratorio Nacional de Neurociencia Traslacional, se ha implementado con el apoyo del Fondo de Recuperación y Resiliencia de la Unión Europea en el marco del Programa Széchenyi Plan Plus.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 3,5,3'-triyodotironina (T3) | Merck | T2877 | |
| Animales, ratones | THAI ratón | ||
| Gel de protección ocular | Oculotect | 1000 UI/g | |
| Tubo Falcon Thermo | Fisher Scientific | 50 mL | |
| volumen Dieta chow sin yodo Dietas | investigación Imágenes | personalizadas | |
| IVIS Lumina II in vivo sistema | Perkin Elmer-Ketamine | ||
| Vetcentre | E1857 | ||
| Living Image software 4.5 | Perkin Elmer-suministrado | con el instrumento | |
| Cilindro | 250 mL | ||
| metimazol | Merck | M8506 | |
| Tubos de microfuga | Eppendorf | Para diluir materiales de tratamiento | |
| NaClO4 | Merck | 71852 | |
| Na-luciferina, sustrato | Goldbio | 103404-75-7 | |
| NaOH | Merck | 101052833 | |
| Tampón de fosfato solución salina | Chem Cruz | sc-362302 | |
| Pipeta | Gilson | Para diluir materiales de tratamiento | |
| Puntas de pipeta | Axygen | Para diluir los materiales de tratamiento | |
| Crema de afeitar/depiladora/afeitadora | Preferencia personal | ||
| Jeringa | B Braun | 1 mL | |
| volumen Aguja de jeringa | B Braun | 0,3 x 12 mm | |
| Xilacina | Vetcentre | E1852 |
Referencias
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