Los virus pseudotipados (PV) son viriones con replicación defectuosa que se utilizan para estudiar las interacciones huésped-virus en condiciones más seguras que la manipulación de virus auténticos. Aquí se presenta un protocolo detallado que muestra cómo se pueden usar los PV del SARS-CoV-2 para probar la capacidad neutralizante del suero de los pacientes después de la vacunación contra el COVID-19.
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Artículo de método
Virus pseudotipados como herramienta molecular para monitorizar las respuestas inmunitarias humorales contra el SARS-CoV-2 mediante ensayo de neutralización
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Resumen
Resumen
Los virus pseudotipados (PV) son herramientas moleculares que se pueden utilizar para estudiar las interacciones huésped-virus y para probar la capacidad neutralizante de muestras de suero, además de su uso más conocido en terapia génica para la administración de un gen de interés. Los PV son defectuosos en la replicación porque el genoma viral se divide en diferentes plásmidos que no se incorporan a los PV. Este sistema seguro y versátil permite el uso de fotovoltaicos en laboratorios de nivel 2 de bioseguridad. Aquí, presentamos una metodología general para producir PVs lentivirales basada en tres plásmidos como se menciona aquí: (1) el plásmido de la columna vertebral que lleva el gen reportero necesario para monitorear la infección; (2) el plásmido de empaquetamiento que transporta los genes de todas las proteínas estructurales necesarias para generar las PV; (3) el plásmido de expresión de glicoproteínas de la superficie de la envoltura que determina el tropismo del virus y media la entrada del virus en la célula huésped. En este trabajo, la espícula del SARS-CoV-2 es la glicoproteína de la envoltura utilizada para la producción de lentivirus pseudotipados no replicativos del SARS-CoV-2.
Brevemente, las células de empaquetamiento (HEK293T) se transfectaron conjuntamente con los tres plásmidos diferentes utilizando métodos estándar. Después de 48 h, el sobrenadante que contenía los PV se recolectó, filtró y almacenó a -80 °C. La infectividad de los PV del SARS-CoV-2 se probó mediante el estudio de la expresión del gen reportero (luciferasa) en una línea celular diana 48 h después de la infección. Cuanto mayor sea el valor de las unidades de luminiscencia relativa (RLU), mayor será la tasa de infección/transducción. Además, los PV infecciosos se añadieron a las muestras de suero diluidas en serie para estudiar el proceso de neutralización de la entrada de los pseudovirus en las células diana, medido como la reducción de la intensidad de RLU: valores más bajos correspondientes a una alta actividad neutralizante.
Introducción
Los virus pseudotipados (PV) son herramientas moleculares utilizadas en microbiología para estudiar las interacciones huésped-virus y patógeno-patógeno 1,2,3,4. Los PV constan de una parte interna, el núcleo viral que protege el genoma viral, y una parte externa, las glicoproteínas de la envoltura en la superficie del virus que define el tropismo5. Un pseudovirus es incompetente para la replicación en la célula diana porque no contiene toda la información genética necesaria para generar nuevas partículas virales. Esta....
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Protocolo
El presente protocolo ha sido aprobado y sigue las directrices del Comité de Ética de la Universidad de Verona (protocolo de aprobación número 1538). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los sujetos humanos que participaron en el estudio. Se recolectaron muestras de sangre entera de trabajadores de la salud voluntarios que estaban en proceso de recibir vacunas contra el SARS-CoV-2. Estas muestras fueron colectadas en tubos de plástico que contenían anticoagulantes para el posterior aislamiento del suero15.
Todos los procesos siguientes deben realizarse en una campana biológica de Clase 2, trabajando e....
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Resultados
Este protocolo describe la producción de VP del SARS-CoV-2 y una aplicación posterior de estos PV para analizar la actividad neutralizante del suero/plasma de sujetos que reciben la vacuna anti-COVID-1917. Además, este protocolo se puede aplicar para producir pseudotipos de cada variante preocupante (VOC) del SARS-CoV-2 para probar la evolución de la respuesta neutralizante. A pesar de que este protocolo facilita el estudio de la respuesta inmune humoral después de la vacunación contra la COVID-19.......
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Discusión
A pesar de que el uso de un virus de tipo salvaje simula la infección real, los PV lentivirales son una opción más segura para estudiar los mecanismos asociados con la entrada e infección viral sin los estrictos requisitos de seguridad necesarios para trabajar con virus patógenos 4,20,21. Los PV están compuestos por un núcleo viral de replicación defectuosa rodeado por la glicoproteína de la envoltura superficial de un virus pat.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Reconocemos la contribución de los trabajadores de la salud voluntarios. Este proyecto contó con el apoyo del Departamento de Excelencia 2023/2027, MUR, Italia. AR y DZ recibieron el apoyo de PRIN2022 (financiación de la UE; NextGenerationEU)
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,45 μ m filtro | SARSTEDT | 83 1826 | |
| Placa de 6 pocillos | SARSTEDT | 83 3920 | |
| Placa de 96 pocillos | SARSTEDT | 8,33,924 | |
| Unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 Merck 10403892 | |||
| Black Opaque Microplaca de 96 pocillos | Perkin Elmer | 60005270 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 - 500ML | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
| Suero fetal bovino | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
| Graphpad Prisma versión 7 graphpad | dotmatics | NA | En el manuscrito, sustituimos el nombre comercial por el de 'programa de análisis de datos'HEK293T |
| células ATCC | CRL-3216 | ||
| células HEK293T/ACE2 | ATCC | CRL-3216 | HEK293T se ha transducido para sobreexpresar ACE2 con un vector lentiviral. |
| L-glutamina | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
| Luminómetro - Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | En el manuscrito, reemplazamos el nombre comercial con 'luminómetro' |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific 11058021 | En el manuscrito, sustituimos el nombre comercial por 'medio sérico reducido' | |
| p8.91 plásmido de embalaje | Di Genova et al., 2021 | Un amable regalo del Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| plásmido reportero de pCSFLW | Di Genova et al., 2021 | Un amable regalo del Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| Penicilina/estreptomicina | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
| Polietilenimina ramificada (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
| RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | Este plásmido se utilizó para generar el plásmido que expresa HEK293Tcells/ACE2 |
| SARS-CoV-2 Addgene | pGBW-m4137382 | ||
| sistema de ensayo de genes reporteros | Perkin Elmer | 6066759 | En el manuscrito, reemplazamos el nombre comercial por 'reactivo de lectura de luciferasa'Tripsina |
| EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |
Referencias
- Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963(2012).
- Pouget, M., et al.
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Reimpresiones y permisos
