Aquí proporcionamos un protocolo completo para estandarizar e implementar el método de detección del virus SARS-CoV-2 en muestras humanas mediante amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP). Este método, realizado en 60 minutos, podría adaptarse a cualquier laboratorio o punto de atención a un bajo costo y utilizando equipos económicos.
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Artículo de método
Detección del virus SARS-CoV-2 mediante amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa
En este artículo
Resumen
Resumen
El virus del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2) ha tenido un impacto drástico en la salud humana. Sigue siendo una amenaza para la sociedad moderna porque muchas personas mueren como resultado de la infección. La enfermedad se diagnostica mediante pruebas serológicas y moleculares, como la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR). Este último tiene varias desventajas porque requiere infraestructura especializada, equipos costosos y personal capacitado. En este artículo, presentamos un protocolo que describe los pasos necesarios para detectar el virus SARS-CoV-2 mediante la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) en muestras humanas. El protocolo incluye instrucciones para el diseño de cebadores in silico, la preparación de reactivos, la amplificación y la visualización. Una vez estandarizado, este método puede implementarse fácilmente y adaptarse a cualquier laboratorio o punto de atención en 60 minutos a un bajo costo y utilizando equipos económicos. Es adaptable para detectar diferentes patógenos. Por lo tanto, potencialmente puede ser utilizado en el campo y en los centros de salud para realizar una vigilancia epidemiológica oportuna.
Introducción
El coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2) causa la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). La Organización Mundial de la Salud declaró una emergencia de salud pública de importancia internacional el 30 de enero de 2020 y una pandemia el 11 de marzo de 2020. La pandemia provocó más de 760 millones de casos y 6,87 millones de muertes hasta la fecha de redacción de este artículo1.
El impacto de este virus ha puesto de manifiesto la necesidad de contar con herramientas de vigilancia mejores, más precisas, más rápidas y más ampliamente disponibles para mejorar la detec....
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Protocolo
Las muestras utilizadas fueron proporcionadas por el laboratorio clínico del Hospital Universitario Fundación Valle del Lili y correspondieron al ARN purificado de pacientes que dieron positivo a COVID-19 mediante la técnica RT-qPCR. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado para la investigación, y este estudio fue aprobado por el comité de bioética para estudios en humanos del hospital universitario Fundación Valle del Lili.
1. Diseño y preparación de la imprimación RT-LAMP
NOTA: Los cebadores LAMP se pueden utilizar con una variedad de plataformas, incluidas LAMP de New England BioL....
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Resultados
La implementación del protocolo comienza con el diseño del conjunto de cebadores para cada gen diana siguiendo el protocolo descrito anteriormente. En junio de 2020 se obtuvieron 5.000 genomas de SARS-CoV-2 de la base de datos NextStrain, con una representatividad del 10% de los genomas colombianos. Estas secuencias se alinearon para obtener la secuencia de consenso que se utilizó en el proceso de diseño del cebador. En la Tabla 1 se muestra el conjunto de cebadores elegido para los cebadores RdRp/Hel y .......
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Discusión
Aunque el RT-LAMP se considera una metodología complementaria para realizar diagnósticos moleculares, también tiene algunas limitaciones y pasos críticos que deben tenerse en cuenta cuando se estandariza e implementa el protocolo.
La estandarización de LAMP para la detección de SARS-CoV-2 evaluó los siguientes parámetros y componentes en la mezcla maestra: (a) concentración y temperatura de alineación de los cebadores; b) concentración de las enzimas; c) concentración de magnesio; d) tiempo de.......
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Divulgaciones
Natalia Campillo-Pedroza es CEO de la empresa BioDx: Diagnóstico y Soluciones Biotecnológicas S.A.S. El resto de los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el Sistema General de Regalías de Colombia, beca número BPIN 2020000100092, y Universidad Icesi - Convocatoria Interna, beca número CA0413119. El MFVT también fue financiado por los Fondos de Cátedra Asistente de la Universidad de los Andes. Las entidades financiadoras no participaron en el diseño, la ejecución de las actividades, la recopilación de datos, el análisis de datos y la preparación del manuscrito. Agradecemos al Hospital Universitario Fundación Valle del Lili por el ARN viral de las muestras de Sars-CoV-2 y al Dr. Álvaro Barrera-Ocampo por los comentarios al manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1 kb Escalera de ADN | SOLIS BIODYNE | 07-12-00050 | Tienda en -20 ° C |
| 50x Tampón de electroforesis TAE | ThermoScientific | B49 | Almacenar a temperatura ambiente |
| Accuris High Fidelity Polymerase ACCURIS | LIFE SCIENCE REAGENTS | PR1000-HF-200 | Se puede utilizar en caso de que no se pueda comprar la ADN polimerasa de alta fidelidad Q5. Para la enzima, haga alícuotas de un volumen adecuado y almacene a -20 & grados; C hasta su uso. |
| Agarosa | PanReacAppliChem | A8963,0100 | N/A |
| Bst 3.0 ADN polimerasa 8000 UI/mL | New England BioLabs | M0374S/M0374L | Para la enzima, haga alícuotas de un volumen adecuado y almacene a -20 ° C hasta su uso. |
| Juego de soluciones de desoxinucleótidos (dNTP) | Nueva Inglaterra BioLabs | N0446S | Tienda a -20 ° C |
| Pirocarbonato de dietilo | Sigma-Aldrich | 159220-25G | Manéjelo con precaución debajo de un gabinete de extracción |
| Escalera de ADN GeneRuler 100 bp Plus, ThermoScientific | SM0322 | Tienda a -20 & grados; C | |
| Hidroxinaftol sal disódica | azul Santa Cruz Biotechnology | sc-215156B | N/A |
| Q5 ADN polimerasa de alta fidelidad 2000 UI/mL | New England BioLabs | M0491S/M0491L | Para la enzima, haga alícuotas de un volumen adecuado y almacene a -20 & grados; C hasta su uso. |
| WarmStart RTx Transcriptasa inversa 15000 UI/mL | New England BioLabs | M0380S/M0380L | Para la enzima, haga alícuotas de un volumen adecuado y almacene a -20 ° C hasta su uso. |
Referencias
- World Health Organization. Who coronavirus (COVID-19) dashboard (no date). , https://covid19.who.int/ (2023).
- Ibrahim, N. K. Epidemiologic surveillance for controlling Covid-19 pandemic: types, challenges and implications. Journal of Infection and Public Health. 13
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Reimpresiones y permisos
