Artículo de método

Análisis de la función mitocondrial en un mutante PINK1B9-nulo de Drosophila melanogaster mediante respirometría de alta resolución

DOI:

10.3791/65664

⸱

10 de noviembre de 2023

 ,  , 
1Laboratory of Experimental Biochemistry and Toxicology, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center of Natural and Exact Sciences, Federal University of Santa Maria, 2Graduate Program in Biological Sciences: Toxicological Biochemistry, Federal University of Santa Maria

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este trabajo presentamos un protocolo de respirometría de alta resolución para analizar la bioenergética en moscas de la fruta mutantes PINK1B9-nulas. El método utiliza el protocolo Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Parkinson (EP), y las alteraciones celulares como el cáncer son algunos de los trastornos que alteran el metabolismo energético con deterioro de las funciones mitocondriales. Las mitocondrias son orgánulos que controlan tanto el metabolismo energético como los procesos celulares implicados en la supervivencia y muerte celular. Por esta razón, los enfoques para evaluar la función mitocondrial pueden ofrecer información importante sobre las condiciones celulares en los procesos patológicos y fisiológicos. En este sentido, los protocolos de respirometría de alta resolución (HRR) permiten evaluar toda la función de la cadena respiratoria mitocondrial o la actividad de complejos mitocondriales específicos. Además, el estudio de la fisiología mitocondrial y la bioenergética requiere modelos genética y experimentalmente manejables como Drosophila melanogaster.

Este modelo presenta varias ventajas, como su similitud con la fisiología humana, su rápido ciclo de vida, su fácil mantenimiento, su rentabilidad, su alto rendimiento y su minimización del número de preocupaciones éticas. Estos atributos lo establecen colectivamente como una herramienta invaluable para diseccionar procesos celulares complejos. El presente trabajo explica cómo analizar la función mitocondrial utilizando el mutante PINK1B9-null de Drosophila melanogaster. El gen pink1 es responsable de codificar la quinasa putativa 1 inducida por PTEN, a través de un proceso reconocido como mitofagia, que es crucial para la eliminación de mitocondrias disfuncionales de la red mitocondrial. Las mutaciones en este gen se han asociado con una forma familiar autosómica recesiva de inicio temprano de la EP. Este modelo se puede utilizar para estudiar la disfunción mitocondrial implicada en la fisiopatología de la EP.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las mitocondrias son orgánulos celulares que controlan funciones importantes, incluida la regulación apoptótica, la homeostasis del calcio y la participación en las vías biosintéticas. Al poseer material genético autónomo, son capaces de contribuir a los procesos de mantenimiento y reparación celular. Su estructura alberga la cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa, ambas cruciales para la energía celular 1,2,3. En particular, el control de la energía se logra a través de la producción de trifosfato de adenosina (ATP) a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS)2. La alteración del metabolismo energético con deterioro de las funciones mitocondriales ocurre tanto en la supervivencia como en la muerte celular 4,5, frecuentemente asociada a una amplia gama de patologías humanas, como el cáncer, y enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson (EP)3,6.

La EP es un trastorno crónico, progresivo y neurológico. La causa principal de esta enfermedad es la muerte de las células cerebrales, especialmente en la sustancia negra, que son responsables de la producción del neurotransmisor dopamina, que controla el movimiento 6,7,8. La primera observación que relacionó el parkinsonismo con la disfunción mitocondrial se realizó en 1988, en modelos experimentales utilizando toxinas que inhiben la cadena respiratoria Complejo I9.

Actualmente, existen varios métodos para evaluar la disfunción mitocondrial 10,11,12,1 3; sin embargo, en comparación con los abordajes convencionales, la respirometría de alta resolución (HRR) presenta una sensibilidad y ventajas superiores13,14. Por ejemplo, los protocolos de HRR permiten evaluar toda la función de la cadena respiratoria mitocondrial o la actividad de complejos mitocondriales específicos14,15. Las disfunciones mitocondriales pueden evaluarse en células intactas, mitocondrias aisladas o incluso ex vivo 10,11,13,14.

Las disfunciones mitocondriales están estrechamente asociadas con muchos procesos patológicos y fisiológicos. Por lo tanto, es importante estudiar la fisiología mitocondrial y la bioenergética utilizando sistemas modelo genética y experimentalmente tratables. En este sentido, la investigación sobre Drosophila melanogaster, la mosca de la fruta, tiene varias ventajas. Este modelo comparte características y procesos celulares fundamentales con los seres humanos, incluido el uso del ADN como material genético, orgánulos comunes y vías moleculares conservadas involucradas en el desarrollo, la inmunidad y la señalización celular. Además, las moscas de la fruta tienen un ciclo de vida rápido, fácil mantenimiento, bajo costo, alto rendimiento y menos preocupaciones éticas, lo que constituye una herramienta invaluable para diseccionar procesos celulares complejos 16,17,18,19,20.

Además, un homólogo del gen de la quinasa putativa 1 (pink1) inducido por PTEN se expresa en D. melanogaster. Desempeña un papel crucial en la eliminación de mitocondrias dañadas a través del proceso de mitofagia8. En humanos, las mutaciones en este gen predisponen a los individuos a una forma familiar autosómica recesiva de EP asociada a disfunción mitocondrial 8,21,22,23. En consecuencia, la mosca de la fruta es un poderoso modelo animal para estudios sobre la fisiopatología de la EP y el cribado de candidatos a fármacos centrados en la disfunción mitocondrial y la bioenergética. Por lo tanto, en el presente trabajo se explica cómo analizar la función mitocondrial en un modelo de EP de D. melanogaster utilizando la técnica HRR en el OROBOROS con el protocolo Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

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Protocolo

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Utilizamos las cepas w1118 (blanca) y w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (denominada Pink1B9) (FlyBase ID: FBgn0029891) del centro de stock Bloomington Drosophila (número de identificación: 34749). En este estudio, se comparan mutantes machos de D. melanogaster PINK1B9-null con machos de D. melanogaster de la cepa w1118, que se utiliza como grupo de control (antecedentes genéticos). Otros parámetros deben ser analizados concomitantemente con los experimentos de respirometría para asegurar que las moscas tengan el genotipo correcto (Pink1B9/Y), tales como deformidades del tórax y problemas de locomoción, que están bien descritos para las moscas mutantes pink1B9 24,25,26.

1. Animales y alojamiento

  1. Mantener las moscas en frascos de vidrio que contengan 10 mL de dieta estándar (levadura 1,73%, harina de soja 0,9%, harina de maíz 7,3%, agar 0,5%, jarabe de maíz 7,6% y ácido propiónico 0,48%) a temperatura y humedad constantes (25 °C y 60%, respectivamente), con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h:12 h.
  2. Para cada experimento, utilice dos moscas de 1 a 3 días después de la eclosión.
    NOTA: Las moscas hembras vírgenes mutantes PINK1B9-nulas se cruzaron con w1118 machos para obtener los machos F1 con genotipo Pink1B9/Y.

2. Preparación de la muestra

  1. Prepare el búfer MiR05 como se describe en la Tabla 1.
  2. Anestesiar las moscas en hielo y transferirlas a tubos de microcentrífuga (dos moscas por tubo).
  3. En cada tubo, añadir 200 μL de tampón MiR05 refrigerado y homogeneizar las moscas. Homogeneizar manualmente, aplicando una presión suave (aproximadamente 4-6 golpes de mortero) para evitar la desintegración de las mitocondrias.

3. Calibración de respirometría de alta resolución de sensores polarográficos de oxígeno

NOTA: Las cámaras OROBOROS tienen un volumen total de aproximadamente 2 mL. Se requiere calibración para garantizar que el flujo de oxígeno esté cerca de 0 pmol para iniciar el ensayo.

  1. Al iniciar la calibración, agregue 2 ml de MiR05 a la cámara. Cubra la cámara con el tapón sin dejar burbujas de aire; Luego, tire con cuidado del tapón para formar una sola burbuja de aire.
  2. Abra el software OROBOROS Dat.Lab. Introduzca una temperatura de 25 °C en el campo Temperatura del bloque y haga clic en Conectar al Oxygraph-2k (Figura 1A).
  3. Haga clic y seleccione la carpeta donde se guardará la calibración y haga clic en Guardar.
  4. Cuando se abra una nueva ventana, asigne un nombre al experimento y a las muestras (si está calibrando, simplemente ingrese el nombre calibración) y haga clic en Guardar.
  5. Vaya al menú Diseño y elija la primera opción: 01 Calibración Exp. Gr.3 - Temp como se muestra en la Figura 1B.
  6. Espere a que el programa se redirija al diseño de calibración, espere hasta que la línea roja muestre una línea recta estándar con puntos alrededor de 0 pmol. A continuación, seleccione dos puntos: uno para la cámara A y otro para la cámara B (Figura 1C) cuando la línea roja esté exactamente en cero.
    NOTA: Los puntos seleccionados deben tener un flujo de oxígeno (línea roja) alrededor de 0.
    1. Para marcar los puntos de ambas cámaras, seleccione la concentración de O2 a la derecha de la pantalla, seleccione el punto marcado y copie los valores de temperatura y presión barométrica relativos al punto. Pegue estos valores en los cuadros a continuación y haga clic en Calibrar y copiar al portapapeles en la esquina inferior derecha de la pantalla, como se muestra en la Figura 2.
    2. Lleve a cabo este proceso para ambas cámaras (A y B), luego vaya al menú Archivo y seleccione Guardar y desconectar.
      NOTA: Después del proceso de calibración, el programa redirigirá al usuario a la pantalla de inicio para que el software esté listo para iniciar la prueba HRR. Para esta prueba, utilizaremos el protocolo SUIT.

4. Protocolo SUIT

  1. Una vez completada la calibración, retire los tapones y abra las cámaras.
  2. Lave los tapones (sosteniendo la punta que no toca la muestra) y las cámaras con etanol al 100%, etanol al 70% y agua destilada, en ese orden.
    NOTA: Repita el proceso para cada cambio de muestra.
  3. Homogeneizar las moscas en 200 μL de tampón, colocar todo el contenido de la muestra en la cámara con una micropipeta y reubicar el tapón en la cámara, teniendo cuidado de no crear burbujas de aire.
    NOTA: Si se forman burbujas de aire, retire el tapón suavemente y agregue 100 μL de tampón MIR05.
  4. Haga clic en el menú Diseño y seleccione la opción 05 Flujo por volumen corregido como se muestra en la Figura 1B.
  5. Espere a ser redirigido a una nueva ventana. Haga clic en Guardar para seleccionar la carpeta donde se va a guardar el experimento.
  6. Espere a que se abra otra ventana nueva. Asigne al experimento en el espacio el nombre Código experimental. A continuación, asigne a cada muestra el nombre A y B de sus respectivas cámaras en el campo Muestra y establezca el campo Unidad en unidad.
    NOTA: También se pueden elegir otras unidades, por ejemplo, Millones de células o mg.
  7. Teniendo en cuenta que este protocolo utiliza dos moscas (2 unidades) y el volumen de cámara es de 2 mL, en el campo de Concentración , defina 1 por mL (Figura 1D).
    NOTA: Aquí, la cantidad de muestra se normalizó por el número de moscas; sin embargo, esta normalización puede realizarse por el contenido proteico de la muestra, la cuantificación del ADN mitocondrial o la actividad de la citrato sintasa.
  8. Cuando la señal de flujo de oxígeno (línea roja) esté estable en el valor positivo, inicie el protocolo HRR con la valoración de sustratos, inhibidores y desacopladores (Figura 3). Todos los reactivos y equipos posteriores se muestran en la Tabla 1.
    1. Añadir digitonina (5 μg/mL) para permeabilizar la membrana mitocondrial.
    2. Agregue sustratos de piruvato (5 mM), malato (2 mM) y prolina (10 mM) y espere hasta que el flujo de oxígeno aumente y se estabilice. Para marcar el evento de cada adición de reactivo, pulse la tecla F4 del teclado e introduzca el nombre de cada reactivo.
    3. Añadir ADP (5mM) para acoplar la cadena respiratoria mitocondrial y esperar el aumento y estabilización del flujo de oxígeno.
    4. Añadir succinato (10 mM) y esperar a que aumente y se estabilice el flujo de oxígeno.
    5. Agregue oligomicina (2.5 μM) para inhibir la ATP sintasa y busque una disminución en el flujo de oxígeno.
    6. Espere hasta que la línea roja se estabilice y desacople la transferencia de electrones mitocondriales utilizando cianuro de fenilhidrazona (FCCP) de carbonil-4-(trifluorometoxi) con títulos de 0,25 μM hasta que se alcance el consumo máximo de oxígeno, demostrado por el aumento de la línea roja. Después de estabilizar el flujo de oxígeno, comience a agregar los inhibidores de cada complejo, uno a la vez.
    7. Añadir rotenona (0,5 μM), un inhibidor del complejo I. Espere a que disminuya y se estabilice el flujo de oxígeno para agregar el siguiente inhibidor.
    8. Agregue malonato (5 mM), un inhibidor del complejo II. Espere a que disminuya y se estabilice el flujo de oxígeno para agregar el siguiente inhibidor.
    9. Por último, añadir Antimicina (2,5 μM), un inhibidor del complejo III. Espere la disminución seguida del aumento y estabilización del flujo de oxígeno.
      NOTA: El flujo de oxígeno debe estabilizarse en un valor positivo pero por debajo del valor de la última inhibición de los complejos proteicos mitocondriales.
  9. Al final del análisis, elimine todo el contenido de las cámaras con una micropipeta. Almacenar a -20 °C para futuros análisis, cuando sea necesario.

5. Análisis de datos

  1. Utilice un paquete de software estadístico adecuado para el análisis de datos.
  2. Realizar pruebas t para evaluar las diferencias entre los dos grupos. Para situaciones que involucran múltiples tratamientos, utilice el Análisis de Varianza (ANOVA) como prueba estadística 27.
  3. Extraiga los valores de flujo de O2 del gráfico generado por el software. OXPHOS CI se refiere al valor del flujo deO2 después de agregar ADP. OXPHOS CII se obtiene restando OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI. OXPHOS CI&CII es el valor del fundente deO2 extraído después de la adición de succinato. ETS CI&CII es el valor de flujo de O2 después de agregar FCCP. ETS CI = FCCP - Rotenona y ETS CII = Rotenona - Malonato.
  4. Calcular la síntesis de ATP como la diferencia entre el OXPHOS (P) y la FUGA (L) (P - L)28.
  5. Determinar el cociente de control respiratorio (RCR) calculando el cociente OXPHOS/LEAK, donde RCR = P/L.11

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Resultados

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Aquí, observamos que el flujo de O2 en los estados OXPHOS CI (P = 0.0341) y OXPHOS CI&II (P = 0.0392) se reduce en las moscas nulas PINK1B9 en comparación con las moscas de control (Figura 4). Este resultado también se observó en hallazgos previos de nuestro grupo29,30.

El CI y el CII son componentes clave del sistema de transporte de electrones (ETS), en...

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Discusión

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La HRR es una técnica poderosa para estudiar la respiración mitocondrial y el metabolismo energético en D. melanogaster y otros organismos. Proporciona una evaluación detallada y cuantitativa de la función mitocondrial, lo que permite a los investigadores obtener información sobre la bioenergética de las células. El protocolo presentado aquí describe la evaluación de la función de la cadena respiratoria mitocondrial y la actividad de complejos mitocondriales específicos utilizando el protocolo SUIT en D. mel...

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Divulgaciones

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Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Agradecimientos

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Los autores reconocen a la agencia brasileña Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) y T.D. (#88887.512883/2020-00) son beneficiarios de becas de investigación.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
ADPSigma-AldrichA5285Adenosina 5′-difosfato sódico sal (número CAS 72696-48-1); ≥ 95%; Peso molecular = 501,31 g/mol.
Á garKasvK25-1800Para uso bacteriológico
Antimicina-ASigma-AldrichA8674Antimicina A de Streptomyces sp. (número CAS 1397-94-0); peso molecular  540 g/mol;
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-AldrichA7030Albúmina sérica bovina (número CAS 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
Software DatlabOroboros Instruments, Innsbruck, Austria20700Software para la adquisición y análisis de datos
DigitoninSigma-AldrichD 5628Número CAS 11024-24-1
Agua
destiladaDrosophila melanogaster cepa w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3Obtenido del centro de stock de Drosophila de Bloomington
Drosophila melanogaster cepa  w1118Obtenido  de la Universidad Federal de Santa María
EGTASigma-AldrichE8145Etilenglicol-bis(2-aminoetiloéter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (número CAS 13638-13-3); ≥ 97%; peso molecular = 468,28 g/mol
FCCPSigma-AldrichC2920Cianuro de carbonilo 4- (trifluorometoxi)fenilhidrazona  (Nº CAS 370-86-5); ≥ 98% (TLC), polvo 
GraphPad Prism versión 8.0.1.Software para la adquisición y análisis de datos
HepesSigma-AldrichH4034ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico (número CAS 7365-45-9); ≥ 99,5% (valoración), probado en cultivo celular; peso molecular = 238,30 g/mol
Respirómetro de alta resolución Oxygraph O2KOroboros Instruments, Innsbruck, Austria10022-02Kit de respirómetro O2K de inicio
KH2PO4Sigma-AldrichP5379Fosfato monopotásico (número CAS 7778-77-0); Reagente Plus, peso molecular = 136,09 g/mol
KOHSigma-Aldrich211473Hidróxido de potasio (número CAS 1310-58-3); Reactivo ACS, ≥ 85%, pellets
MalateSigma-AldrichM1296Ácido malónico (número CAS 141-82-2); 99%, peso molecular = 104,06 g/mol). Una solución tiene un pH ajustado a aproximadamente 7,0.
Ácido málicoSigma-AldrichM1000(S)-(−)-Ácido 2-hidroxisuccínico (número CAS 97-67-6); ≥ 95% ; peso molecular = 134,09 g/mol
MESSigma-AldrichM3671ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (número CAS 4432-31-9); ≥ 99% (valoración); peso molecular = 195,24 g/mol
MgCl2Sigma-AldrichM8266Cloruro de magnesio (número CAS 7786-30-3); anhidro, ≥ 98%, peso molecular = 95,21 g/mol
Tubos de microcentrífugaEppendorf
O2K-Titration SetOroboros Instruments, Innsbruck, Austria20820-03Jeringas Hamilton con diferentes volúmenes
OligomicinaSigma-AldrichO 4876Oligomicina de  Streptomyces diastatochromogenes (número CAS  1404-19-9); ≥ Base de oligomicinas totales al 90% (HPLC)
Pistilo a homogeneización
ProlinaSigma-AldrichP0380L-Prolina (número CAS 147-85-3); polvo; 99%; peso molecular = 115,13 g/mol
PiruvatoSigma-AldrichP2256Piruvato de sodio (número CAS 113-24-6), ≥ 99%; peso molecular = 110,04 g/mol
RotenonaSigma-AldrichR8875Rotetone (número CAS 83-79-4); ≥ 95%, peso molecular 394,42 g/mol
SuccinatoSigma-AldrichS 2378Succinato de sodio dibásico hexahidratado (número CAS 6106-21-4); ≥ 99%
SacarosaMerck107.651.000Sacarosa para uso microbiológico (número CAS 57-50-1)
TaurinaSigma-AldrichT0625Número CAS 107-35-7

Referencias

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