Aquí, presentamos un protocolo para un sistema automatizado de cultivo celular. Este sistema de cultivo automatizado reduce la mano de obra y beneficia a los usuarios, incluidos los investigadores que no están familiarizados con el manejo de células madre pluripotentes inducidas (iPS), desde el mantenimiento de las células iPS hasta la diferenciación en varios tipos de células.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Un sistema de cultivo automatizado para mantener y diferenciar células madre pluripotentes inducidas por humanos
En este artículo
Resumen
Resumen
Se espera que las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) con una capacidad infinita de autoproliferación tengan aplicaciones en numerosos campos, incluida la elucidación de patologías de enfermedades raras, el desarrollo de nuevos medicamentos y la medicina regenerativa con el objetivo de restaurar órganos dañados. A pesar de ello, la implementación social de las hiPSC sigue siendo limitada. Esto se debe, en parte, a la dificultad de reproducir la diferenciación en la cultura, incluso con conocimientos avanzados y habilidades técnicas sofisticadas, debido a la alta sensibilidad de las iPSC a los cambios ambientales más pequeños. La aplicación de un sistema de cultivo automatizado puede resolver este problema. Se pueden esperar experimentos con alta reproducibilidad, independientemente de la habilidad de un investigador, de acuerdo con un procedimiento compartido entre varios institutos. Aunque anteriormente se han desarrollado varios sistemas de cultivo automatizados que pueden mantener cultivos iPSC e inducir la diferenciación, estos sistemas son pesados, grandes y costosos porque hacen uso de brazos robóticos humanizados y multiarticulados. Para mejorar los problemas anteriores, desarrollamos un nuevo sistema que utiliza un sistema de rieles deslizantes de eje x-y-z simple, lo que le permite ser más compacto, liviano y económico. Además, el usuario puede modificar fácilmente los parámetros del nuevo sistema para desarrollar nuevas tareas de manipulación. Una vez que se establece una tarea, todo lo que el usuario debe hacer es preparar el iPSC, suministrar los reactivos y consumibles necesarios para la tarea deseada con anticipación, seleccionar el número de tarea y especificar el tiempo. Confirmamos que el sistema podía mantener las iPSC en un estado indiferenciado a través de varios pasajes sin células alimentadoras y diferenciarse en varios tipos de células, incluidos cardiomiocitos, hepatocitos, progenitores neurales y queratinocitos. El sistema permitirá experimentos altamente reproducibles en todas las instituciones sin necesidad de investigadores cualificados y facilitará la implementación social de las hiPSC en una gama más amplia de campos de investigación al disminuir los obstáculos para nuevas entradas.
Introducción
Este artículo tiene como objetivo proporcionar procedimientos de manejo reales y detallados para un sistema de cultivo automatizado de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC), que producimos en colaboración con una empresa, y mostrar resultados representativos.
Desde la publicación del artículo en 2007, iPSC ha atraído la atención de todo el mundo1. Debido a su mayor característica de poder diferenciarse en cualquier tipo de célula somática, se espera que se aplique en diversos campos como la medicina regenerativa, la elucidación de las causas de enfermedades intratables y el desarrollo de nuevos fármacos terapéuticos 2,3. Además, el uso de células somáticas humanas derivadas de iPSC podría reducir los experimentos con animales, que están sujetos a importantes restricciones éticas. Aunque se requieren constantemente numerosas iPSC homogéneas para investigar nuevos métodos con iPSC, es demasiado laborioso gestionarlas. Además, el manejo de iPSC es difícil debido a su alta sensibilidad, incluso a cambios culturales y ambientales sutiles.
Para resolver este problema, se espera que los sistemas de cultivo automatizados realicen tareas en lugar de humanos. Algunos grupos han desarrollado algunos sistemas automatizados de cultivo de células madre pluripotentes humanas para el mantenimiento y la diferenciación celular y han publicado sus logros 4,5,6. Estos sistemas equipan brazos robóticos multiarticulados. Los brazos robóticos no solo tienen el mérito de imitar en gran medida los movimientos de los brazos humanos, sino también el de que requieren costos más altos para los brazos, un empaquetamiento del sistema más grande y pesado, y esfuerzos educativos que consumen mucho tiempo por parte de los ingenieros para obtener los movimientos deseados 7,8. Con el fin de facilitar la introducción del aparato en más instalaciones de investigación en los puntos de consumo económico, espacial y de recursos humanos, hemos desarrollado un novedoso sistema de cultivo automatizado para el mantenimiento y diferenciación de iPSC en varios tipos de células9.
Nuestra justificación para el nuevo sistema fue adoptar un sistema de rieles de eje X-Y-Z en lugar de brazos robóticos multiarticulados9. Para reemplazar las complejas funciones similares a las manos de los brazos robóticos, aplicamos una nueva idea a este sistema, que puede cambiar automáticamente tres tipos de puntas de brazo funcionales específicas. Aquí, también indicamos cómo los usuarios pueden hacer fácilmente programaciones de tareas con pedidos simples en el software debido a la falta de requisitos para las contribuciones de los ingenieros a lo largo del proceso.
Uno de los sistemas de cultivo robótico ha demostrado la fabricación de cuerpos embrioides utilizando placas de 96 pocillos como agregados celulares 3D para la diferenciación4. El sistema que se informa aquí no puede manejar placas de 96 pocillos. Una de ellas alcanzó el grado actual de buenas prácticas de fabricación (cGMP) utilizando una línea celular, aunque no se trataba de una célula madre pluripotente humana5. El sistema de cultivo automatizado que se detalla aquí se ha desarrollado con el objetivo específico de ayudar a los experimentos de laboratorio (Figura 1). Sin embargo, cuenta con suficientes sistemas para mantener limpios niveles equivalentes a los de un armario de seguridad de nivel IV.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
El Comité de Ética de la Universidad Médica de Kansai aprobó la generación y el uso de las iPSC sanas derivadas de voluntarios denominadas KMUR001 (aprobación n.º 2020197). El donante, que fue reclutado abiertamente, dio su consentimiento informado formal y estuvo de acuerdo con el uso científico de las células.
NOTA: La interfaz actual (el software especial llamado "ccssHMI" que se ejecuta en el sistema operativo Windows XP) es la pantalla de operación fundamental. En la interfaz antes mencionada, se organizan una serie de pestañas que permiten a los usuarios iniciar diversas operaciones.
1. Operaciones de carga
- Haga clic en el botón Cargar en la pantalla superior del software. Haga clic en el botón Inicio de preparación de carga .
- Coloque el(los) plato(s) o plato(s) que se introducirá en el aparato en su posición en el aparato.
NOTA: La información necesaria para la identificación del plato debe estar escrita en cada tapa. - Cierre manualmente la ventana corredera delantera y presione el botón mecánico de confirmación de seguridad.
- Seleccione el tipo y la cantidad de plato(s) o plato(s) en el software.
- Haga clic en el botón Preparación de carga completada . Haga clic en el botón Inicio de carga .
- Después de cargar una antena parabólica en el sistema, seleccione la información de la antena, como con celdas iPS o sin celdas iPS, en el software. Registre notas sobre cada plato en el software.
- Haga clic en el botón Registro al final para completar la operación de carga.
2. Operación de descarga
- Haga clic en el botón Descargar en la pantalla superior del software. Seleccione los platos que desea eliminar en el software.
- Después de seleccionar los platos, haga clic en el botón Inicio de preparación de descarga . Haga clic en el botón Inicio de descarga .
- Después de que la(s) placa(s) se haya transferido(s) de la incubadora al banco de trabajo del sistema, presione el botón Extracción de platos .
- Abra manualmente la ventana corredera frontal y saque los platos. Cierre manualmente la ventana corredera delantera y presione el botón mecánico de confirmación de seguridad.
3. Suplemento de consumibles: pipetas, tubos y medio
- Para reponer consumibles como pipetas, tubos y medios, haga clic en el botón Consumibles en la pantalla superior del software y, a continuación, seleccione el artículo que desea reponer.
- Pipetas
- Haga clic en el botón Pipeta . Seleccione el botón Reabastecer .
- Seleccione un bastidor que el usuario desee reabastecer en el software. Haga clic en el botón Iniciar reabastecimiento .
- Después de confirmar que la tapa del área de almacenamiento de pipetas en el banco de trabajo está abierta, abra manualmente la ventana corredera frontal y reponga las pipetas según sea necesario.
- Cierre manualmente la ventana corredera delantera y presione el botón mecánico de confirmación de seguridad. Haga clic en el botón Reabastecer completado .
- Haga clic en el botón Configuración de reabastecimiento e introduzca la información para el reabastecimiento, luego haga clic en el botón Registro .
- Haga clic en el botón Reabastecer completado .
- Tubos
- Haz clic en el botón Tubo . Seleccione el botón Reabastecer .
- Seleccione un bastidor que el usuario desee reabastecer en el software. Haga clic en el botón Iniciar reabastecimiento .
- Después de confirmar que la rejilla se ha movido a la parte superior, haga clic en el botón Reabastecer tubo .
- Abra manualmente la ventana corredera frontal y reponga los tubos según sea necesario.
- Cierre manualmente la ventana corredera delantera y presione el botón mecánico de confirmación de seguridad.
- Haga clic en el botón Reabastecer completado .
- Haga clic en el botón Configuración de reabastecimiento e introduzca la información para el reabastecimiento, luego haga clic en el botón Registro . Haga clic en el botón Cerrar .
- Medio
- Haga clic en el botón Medio . Seleccione el botón Reabastecer en el software.
- Seleccione un bastidor de los tres que los usuarios desean reabastecer. Haga clic en el botón Iniciar reabastecimiento .
- Después de confirmar que se ha abierto la tapa del área de almacenamiento mediana, abra manualmente la ventana corredera frontal y reponga el medio.
- Cierre manualmente la ventana corredera delantera y presione el botón mecánico de confirmación de seguridad.
- Haga clic en el botón Reabastecer completado .
- Haga clic en el botón Reabastecer e introduzca la información del medio, incluido el nombre y la cantidad del medio. Introduzca comentarios adicionales si es necesario.
- Haga clic en el botón Registro .
- Haga clic en el botón Cerrar .
- Pipetas
4. Selección de tareas
- Haga clic en el botón Tarea en la pantalla superior del software.
- Seleccione el botón Configuración de tareas . Seleccione la tarea deseada de la lista de tareas y haga clic en el botón Siguiente paso .
- Especifique la fecha y la hora para realizar la tarea y, a continuación, haga clic en el botón Registro . Seleccione un plato para realizar la tarea y, a continuación, haga clic en el botón Registro .
- Después de volver a confirmar la tarea seleccionada, haga clic en el botón Registro . Confirme que la tarea se ha registrado en la siguiente pantalla.
- Si es necesario, establezca la siguiente tarea de la misma manera.
- Haga clic en el botón Inicio al final. A continuación, la tarea se iniciará automáticamente en la fecha y hora especificadas.
NOTA: Inmediatamente después de terminar cada tarea, las luces UV (ubicadas en ambos lados de la campana) se encienden automáticamente y, después de 5-30 minutos, de acuerdo con la configuración auxiliar, se apagan para mantener la campana en condiciones asépticas. Para detenerlo, los usuarios pueden hacer clic en el botón Inicio . - Si los usuarios desean cancelar una tarea programada por adelantado, haga clic en el botón Detener .
- Después de seleccionar la tarea que se va a anular, haga clic en el botón Editar tarea .
- Haga clic en el botón Cancelar tarea . Confirme que la tarea se ha eliminado en la siguiente pantalla.
5. Revisa las imágenes de las celdas
- Cada tarea incluye observaciones microscópicas (toma de fotos) antes y después del trabajo de la tarea. Observar fotográficamente el progreso del cultivo celular incorporando una tarea de fotografía microscópica antes o después de cada tarea.
- Seleccione programas de tareas preestablecidos, incluida la selección de múltiples ubicaciones específicas del plato o la placa de pocillos con anticipación para la observación de puntos fijos para monitorear la misma ubicación a lo largo del tiempo.
6. Pasaje y diferenciación
- Siga los pasos de las secciones 1 a 5 y configure el sistema automatizado de cultivo celular para realizar el paso y la diferenciación. Los ajustes del instrumento para el paso, la diferenciación de cardiomiocitos, la diferenciación de hepatocitos, la diferenciación de células precursoras neurales y la diferenciación de queratinocitos se muestran en la Tabla 1, Tabla 2, Tabla 3, Tabla 4 y Tabla 5, respectivamente.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Mantenimiento de células madre pluripotentes inducidas por humanos
Se utilizaron tres líneas hPSC (RIKEN-2F, 253G1 y KMUR001). Hemos optimizado el protocolo de mantenimiento a través de experimentos diarios realizados manualmente y optimizado aún más los programas detallados a través de los siete experimentos preliminares realizados por el sistema. Por ejemplo, las tensiones de cizallamiento causadas por las velocidades del líquido del flujo de saliva de diferentes pipetas manejadas por humanos y el s...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Un paso crítico en el protocolo es que si un usuario encuentra alguna falla, haga clic en el botón cancelar, detener o restablecer en cualquier momento y comience de nuevo desde el primer paso. El software puede evitar errores humanos, como la doble reserva, la apertura de puertas mientras las tareas del sistema están activas y la falta de reabastecimiento. Otro punto crítico para una diferenciación exitosa y eficiente a la célula somática deseada es la selección adecuada de líneas de células madre pluripotentes, ya que ...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
El autor no tiene nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio contó con el apoyo de una subvención del Centro de Promoción de Nuevos Negocios, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japón.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,15% fracción de albúmina sérica bovina V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japón | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| platos de plástico de 10 cm | Corning Inc., NY, Estados Unidos | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoetanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin ratón | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenina | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albúmina conejo | Dako | A0001 | |
| Ácido retinoico totalmente trans | Película Fuji Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Sistema de cultivo automatizado | Panasonic | ||
| B-27 suplemento | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific PHC9531 | ||
| Albúmina sérica bovina | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, Estados Unidos #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Queratinocitos-SFM definidos | Thermo Fisher Scientific | 10744019 Medio de queratinocitos humanos | |
| Dexametasona | Merck 266785 | ||
| Dihexa | TRC, Ontario, Canadá | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecilglicerol |
| Hemocitómetro desechable | CountessTM Portaobjetos de cámara de recuento de células, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco' s Águila modificada medio/F12 | Película Fuji Wako Chemical Inc. | ||
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Esencial 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Medio de células madre pluripotentes humanas |
| Suero fetal bovino | Biowest, FL, Estados Unidos | S140T | |
| FGF-básico | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolina | Thermo Fisher Scientific | J63292. | |
| Glutamina | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Suplemento de glutamina |
| IgG de cabra (H + L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A cabra | Santacruz | 6556 | |
| Hidrocortisona | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hidrocortisona 21-hemisuccinato | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Seda | Nippi Inc., Tokio, Japón | 892 021 | Matriz de cultivo celular |
| Insulina-transferrina-selenio | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Queratina 1 ratón | Santacruz | 376224 | |
| Queratina 10 conejo | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Universidad Médica de Kansai | iPSC derivadas del paciente | |
| Suero knockout de reemplazo | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| ácido L-ascórbico 2-fosfato | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz' s L-15 medio | Película Fuji Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | ||
| Ratón IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 suplemento | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin ratón | Santacruz | 23927 | |
| Medio neurobasal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilamento conejo | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Gö ttingen, Alemania | 05-100-1A medio de | cultivo celular |
| Oct 3/4 ratón | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japón | 14249-24 | |
| Conejo IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Conejo IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Albúmina humana recombinante | A0237, Merck, Darmstadt, Alemania | A9731 | |
| Inhibidor de la Rho quinasa, Y-27632 | Sellec Inc., Tokio, Japón | 129830-38-2 | |
| Recursos Biológicos | RIKEN 2F | HPS0014 | hiPSC indiferenciados |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 SB431542 | |
| Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | ||
| L-ascorbato de sodio | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 ratón | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokio, Japón | AK02 | |
| TnT conejo | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 ratón | Millipore | MAB4381 | |
| Triyodotironina | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos | 12604013 | |
| Solución de azul de tripano | Nacalai Tesque, Kyoto, Japón | 20577-34 | |
| Caldo de fosfato de triptosa | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, Reino Unido | 5148 | |
β  Tublin ratón | Promega | G712A |
Referencias
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
- Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
- Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
- Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
- Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647(2015).
- McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn't anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
- Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41(2017).
- Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990(2022).
- Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
- Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79(2015).
- Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
- International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
