Caracterización de la morfología vascular de la degeneración macular neovascular asociada a la edad mediante angiografía con verde de indocianina

La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) es una afección prevalente que conduce a una pérdida grave de la visión^{en personas mayores}. Solo en los Estados Unidos, se prevé que el número de pacientes con DMAE se duplique, llegando a casi 22 millones para 2050, en comparación con los 11 millones actuales. A nivel mundial, se espera que el número estimado de casos de DMAE alcance la asombrosa cifra de 288 millones en 2040².

La neovascularización coroidea (NVC), también conocida como DMAE "húmeda" o neovascular, puede tener efectos devastadores en la visión debido a la formación de vasos sanguíneos anormales debajo de la retina central. Esto provoca hemorragias, exudación de la retina y pérdida significativa de la visión. La introducción de terapias anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), que se dirigen al VEGF extracelular, ha revolucionado el tratamiento de las NVC. Sin embargo, a pesar de estos avances, hasta el 50% de los pacientes presentan respuestas subóptimas a estas terapias, con actividad continua de la enfermedad, como acumulación de líquidos y hemorragias nuevas o no resueltas 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Estudios clínicos han indicado que la resistencia a los anti-VEGF en pacientes con NVC a menudo corresponde a la presencia de NVC arteriolar, caracterizada por arteriolas ramificadas de gran calibre, asas vasculares y conexiones anastomóticas⁹. El tratamiento repetido con anti-VEGF puede contribuir a la anormalidad de los vasos, al desarrollo de NVC arteriolar y, en última instancia, a la resistencia a las terapias anti-VEGF^14,15. En los casos de NVC arteriolar, es probable que la fuga persistente de líquido se deba a un aumento de la exudación causada por uniones estrechas inadecuadamente formadas en las asas anastomóticas arteriovenosas, particularmente en condiciones de alto flujo sanguíneo⁹. Por el contrario, los individuos que responden bien al tratamiento anti-VEGF tienden a presentar NVC capilar.

En nuestros estudios con modelos animales, hemos demostrado que la NVC inducida por láser en ratones mayores desarrolla NVC arteriolar y muestra resistencia al tratamiento anti-VEGF^16,17. Por el contrario, la NVC inducida por láser en ratones más jóvenes conduce al desarrollo de NVC capilar y a una alta capacidad de respuesta al tratamiento anti-VEGF. Por lo tanto, es crucial diferenciar entre los tipos vasculares de NVC tanto para investigaciones mecanicistas como terapéuticas.

En entornos clínicos, las NVC se clasifican comúnmente en función de los patrones de fuga de la angiografía con fluoresceína (por ejemplo, tipo 1, tipo 2), que utilizan un tinte de fluoresceína para rastrear la exudación e identificar áreas de fuga patológica. En la investigación de la DMAE, la CNV se estudia predominantemente utilizando la AF en modelos animales. Sin embargo, la AF no revela la morfología vascular de la NVC. Además, la AF solo captura imágenes en el espectro de luz visible y no puede visualizar la vasculatura coroidea debajo del epitelio pigmentario de la retina (EPR). Por el contrario, el verde de indocianina (ICG), que exhibe una fuerte afinidad por las proteínas plasmáticas, facilita la retención intravascular predominante y permite la visualización de la estructura vascular y el flujo sanguíneo⁹. Al utilizar la propiedad de fluorescencia del infrarrojo cercano de ICG, es factible obtener imágenes del pigmento de la retina y la coroides mediante angiografía ICG (ICGA). En este contexto, se presenta un protocolo que combina AF e ICGA para investigar la fuga y la morfología vascular de la neovascularización coroidea (NVC) inducida por láser en ratones jóvenes y viejos, donde se observan NVC capilares y arteriolares.

Los experimentos con animales realizados en este estudio recibieron la aprobación de los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) del Baylor College of Medicine. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas descritas en la Declaración de la Asociación para la Investigación de la Visión y la Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Para el presente estudio se utilizaron ratones machos y hembras C57BL/6J jóvenes (7-9 semanas) y viejos (12-16 meses). Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Preparación del sistema de imágenes

1. Coloque una almohadilla térmica en la plataforma de imágenes (consulte la Tabla de materiales) para asegurarse de que la temperatura corporal del ratón se mantenga durante la obtención de imágenes. Active la almohadilla térmica y ajuste la temperatura a 35 °C.
2. Retire la cubierta antipolvo y encienda el oftalmoscopio de escaneo láser. Coloque una lente de 55° en la máquina.
3. Configure el software de imágenes (consulte la Tabla de materiales) e ingrese información esencial, incluido el genotipo, el sexo, la edad, etc. Cuando comience la sesión de imágenes, seleccione el IR (canal infrarrojo) para capturar imágenes ICGA.

2. Preparación de los animales antes de la AGIC y la AF

1. Pesar el ratón para determinar la cantidad de anestesia (ketamina/xilacina 70-100/2,5-10 mg/kg, ver Tabla de materiales) necesaria.
   NOTA: La optimización de la dosis es crucial, ya que el perfil metabólico varía entre las diferentes cepas de ratones. Es esencial determinar la dosis adecuada para evitar que el ratón se despierte antes de completar la toma de imágenes o el riesgo de sobredosis y posible mortalidad animal.
2. Utilice una jeringa estéril de 1 ml con una aguja de 30-32 g para administrar la anestesia mediante inyección intraperitoneal. Pellizca suavemente una de las patas del ratón para comprobar si está adecuadamente anestesiado. Si el animal muestra alguna respuesta o movimiento, es recomendable esperar un tiempo adicional antes de continuar con el siguiente paso. Esto permite que el animal se asiente y asegura unas condiciones óptimas para los procedimientos posteriores.
3. Administrar gotas de solución oftálmica de tropicamida al 1% para dilatar ambos ojos del ratón. Espere al menos 30 s antes de usar gotas de clorhidrato de proparacaína al 0,5% (consulte la Tabla de materiales) en ambos ojos para reducir el movimiento ocular y el parpadeo. A continuación, aplique gotas de gel lubricante para los ojos.
   NOTA: A lo largo de toda la duración de la anestesia, es importante abordar el problema de la sequedad extrema en los ojos del ratón, que puede conducir a la opacidad corneal. Esta opacidad dificulta la obtención de imágenes posteriores debido a la visibilidad obstaculizada. Para evitar esto, es crucial aplicar gotas de gel lubricante para los ojos continuamente para mantener los ojos del ratón hidratados.
4. Coloque el mouse sobre una almohadilla de agua caliente.
   NOTA: Los ratones poseen una alta relación superficie/volumen, lo que resulta en una mayor pérdida de calor al medio ambiente. Cuando se combina con la caída de temperatura inducida por la anestesia, esto puede representar un riesgo significativo para el ratón, lo que puede provocar la muerte debido a la hipotermia. Es crucial tomar las precauciones necesarias para prevenir la hipotermia y garantizar el bienestar del ratón durante el procedimiento.
5. Prepare una mezcla de volumen 1:1 de 2 mg/mL de ICG y 20 mg/mL de colorante de fluoresceína (consulte la Tabla de materiales). Administrar 250 μL de la mezcla mediante inyección intraperitoneal utilizando una jeringa de 1 mL y una aguja de 32 G.
   1. Inserte la aguja en el cuadrante inferior izquierdo del abdomen del ratón, cerca de las patas traseras, en un ángulo paralelo a la piel del ratón para evitar perforar ningún órgano.
   2. Retire con cuidado el émbolo y verifique que no haya entrado sangre en la tapa de la jeringa. Procede a inyectar el tinte de forma lenta y constante, manteniendo un ritmo constante.
      NOTA: El colorante ICG debe filtrarse con un filtro de jeringa de 0,22 μm antes de su uso.

3. ICGA y FA

1. Coloque el mouse en la almohadilla térmica de la plataforma de imágenes para comenzar a tomar imágenes.
2. Coloque el cuerpo del mouse en un ángulo de 45 grados con respecto a la cámara y gire su cabeza ligeramente hacia abajo. Esto permite que el nervio óptico esté en el centro del enfoque de la cámara.
3. Con un hisopo de algodón, limpie delicadamente el ojo para eliminar primero la capa de gotas o geles lubricantes para los ojos en el ojo que se está fotografiando. Asegúrese de aplicar las gotas de gel lubricante inmediatamente después de completar el procedimiento de diagnóstico por imágenes.
   NOTA: No se recomienda dejar el ojo sin lubricación durante más de 1 minuto bajo anestesia.
4. Mueva la cámara hacia el ojo del ratón. Seleccione el canal FA en el módulo de adquisición. La luminiscencia emitida por el canal FA se puede utilizar para colocarla en el centro de la córnea del ratón para una colocación más rápida.
5. Coloque la cabeza del ratón de forma que el nervio óptico quede centrado en la pantalla, evitando la necesidad de inclinar el oftalmoscopio de barrido láser en ángulo. Realice pequeños ajustes en la posición de la cabeza del mouse para lograr la alineación deseada.
6. En el módulo de adquisición, seleccione el canal ICGA. Asegúrese de que la intensidad del láser esté ajustada al 100% y seleccione la opción de 55° para que coincida con la lente adecuada. Esto garantiza una configuración óptima para el oftalmoscopio de barrido láser.
   NOTA: Para evitar la sobresaturación, puede ser necesario utilizar una intensidad de láser más baja, normalmente alrededor del 25 % al 50 %, al obtener imágenes de la etapa inicial. Ajustar la intensidad del láser en este rango puede ayudar a capturar imágenes claras y precisas sin causar sobresaturación.
7. Cuando el ojo ocupe toda la pantalla del software de imágenes, realice ajustes en la sensibilidad y la configuración de enfoque para obtener la imagen más clara de la membrana CNV.
   1. Gire el botón negro redondo del módulo de adquisición para ajustar la sensibilidad de la imagen.
   2. Gire la perilla del oftalmoscopio para ajustar el enfoque. El enfoque óptimo para visualizar la vasculatura de la retina mediante AF suele estar dentro del rango de 35-45 D (dioptrías). Por otro lado, el enfoque ideal para visualizar la coroides usando ICGA es generalmente entre 10-15 D.
      NOTA: Debido a los diferentes tamaños de la membrana de la NVC, puede ser necesario ajustar el enfoque en 10-30 D para obtener una imagen óptima de la morfología vascular.
8. Una vez que se hayan ajustado el enfoque y la sensibilidad para lograr la mejor imagen posible, presione el botón negro redondo en el módulo de adquisición para normalizar la imagen. Una vez completada la normalización (todos los fotogramas capturados), haga clic en el botón Adquirir en el panel de la pantalla táctil para guardar la imagen. Puede ser necesario mover la cámara para obtener imágenes de CNV desde diferentes ángulos. El ratón también se puede orientar en diferentes posiciones para proporcionar la mejor imagen de la lesión de NVC.
   NOTA: Es posible que tenga que reajustar el enfoque o la posición del oftalmoscopio de barrido láser cuando se observa la vasculatura más lejos del nervio óptico.
9. Vuelva al canal FA utilizando el módulo de adquisición. Complete los mismos pasos enumerados en los pasos 3.6-3.7 para ajustar la sensibilidad y el enfoque de cada imagen para capturar la fuga de la lesión de NVC.
   NOTA: Asegúrese de seleccionar la sensibilidad correcta para evitar la sobresaturación de la fuga de CNV y aumentar artificialmente el área de fuga.
10. Imagínese la "fase temprana" de ICGA y FA 3-4 min después de la inyección.
    NOTA: La "fase temprana" es el momento en que la vasculatura coroidea se puede ver clara y distintamente. Durante la fase media, que suele ocurrir entre 4 y 8 minutos, los vasos retinianos y coroideos están mucho más difuminados y difusos. A medida que se inicia la fase tardía (>8-10 min), tanto los vasos coroideos como los retinianos se vuelven indiscernibles. Sin embargo, las lesiones hiperfluorescentes de NVC exhiben un contraste máximo contra el fondo disminuido. Estos tiempos mencionados son variables y dependen de la concentración y la cantidad de tinte ICG inyectado. Una mayor cantidad de colorante ICG tiende a aumentar la línea de tiempo de cada fase y proporciona vasos más distintos. Se debe definir una fase en función de las características clave enumeradas anteriormente en lugar de un tiempo absoluto.
11. Una vez que se hayan adquirido todas las imágenes, aplique un gel lubricante o ungüento en el ojo del ratón y controle cuidadosamente el ratón en la almohadilla térmica para su recuperación. Por lo general, el mouse tarda 1,5 horas en recuperarse por completo.
12. Vuelva a colocar a los ratones en sus jaulas y en el área de espera designada una vez que se hayan recuperado completamente de la anestesia y estén despiertos.
13. Antes de apagar el sistema de imágenes y el láser, exporte las imágenes como archivos TIFF o JPEG para su posterior análisis.

4. RPE/coroides, montaje plano y tinción

1. Fije los ojos en paraformaldehído al 4% durante la noche. Lávese los ojos con PBS tres veces. Retire el cristalino y la córnea.
2. Incubar los ojos en solución bloqueante (10% albúmina sérica bovina, 0,6% Triton X-100 en PBS) durante 1 h a temperatura ambiente. Repita el lavado con PBS tres veces.
3. Incubar los ojos con isolectina GS-IB4 Alexa-harina 568 conjugada y anticuerpo de actina anti-músculo liso α (ver Tabla de materiales) durante la noche en la solución de bloqueo.
4. Lavar tres veces con PBS. Incubar las muestras con un anticuerpo secundario anti-conejo de cabra Alexa Fluor 488 (ver Tabla de Materiales) durante 2 h a temperatura ambiente.
5. Realiza 4 cortes radiales desde el borde hasta el ecuador. Retire con cuidado la retina¹⁷.
   NOTA: Se debe tener cuidado para asegurarse de que la membrana neovascular no se desprenda accidentalmente.
6. Monte la coroides de montaje plano en un portaobjetos de vidrio. Visualizar la NVC mediante microscopía confocal.

Siguiendo el protocolo, se realizaron ICGA y FA en CNV inducida por láser en ratones C57BL/6J jóvenes (7-9 semanas) y viejos (12-16 meses). La AF proporciona información sobre la localización y fuga de las lesiones de NVC (Figura 1, paneles izquierdos), mientras que la AGIC revela la morfología vascular de las lesiones de NVC (Figura 1, paneles de la derecha). En ratones jóvenes, la NVC capilar domina las lesiones de NVC. Por el contrario, los ratones viejos exhiben NVC arteriolar caracterizada por vasos de gran calibre, asas vasculares y conexiones anastomóticas. Tanto los ratones jóvenes como los viejos muestran una clara visibilidad de la vasculatura de la retina en la AF (Figura 1, paneles izquierdos). En las imágenes de ICGA de ratones jóvenes, la vasculatura de la retina no es visible y los vasos coroideos aparecen descoloridos, lo que indica la fase media de ICGA con el foco en la vasculatura coroidea. En las imágenes del ICGA de ratones viejos, se puede observar una vasculatura retiniana parcial mientras que los vasos coroideos aparecen difuminados, lo que sugiere la fase media con el foco entre la retina y la coroides debido al mayor tamaño de la NVC arteriolar en ratones viejos. La NVC arteriolar en ratones viejos exhibe un tamaño de CNV más grande (Figura 2) y una fuga significativamente mayor en comparación con la NVC capilar en ratones jóvenes. La inmunotinción con un anticuerpo anti-actina del músculo liso marca ampliamente la vasculatura de la NVC en ratones viejos, confirmando la morfología arteriolar (Figura 3). Por el contrario, se observa una tinción mínima con actina de músculo liso α en la vasculatura del sitio de la lesión de ratones jóvenes, lo que es consistente con la morfología capilar.

Figura 1: Comparación de imágenes de FA e ICGA que muestran CNV inducida por láser en ratones jóvenes y viejos. Las imágenes de AF muestran la fuga de las lesiones de NVC, mientras que la ICGA proporciona visualización de la morfología vascular. Barras de escala: 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Cuantificación del tamaño de la lesión de la NVC en ratones jóvenes y viejos a partir de imágenes de ICGA. Se midieron las áreas de CNV, con un total de 26 y 14 puntos láser analizados en ratones jóvenes y viejos, respectivamente. Las barras de error representan la media ± la DE. El análisis estadístico se realizó mediante una prueba t no apareada. P < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes representativas de lesiones de CNV en ratones jóvenes y viejos, co-marcados con Alexa 568 isolectina y anti-α-anti-músculo liso actina en RPE/coroides. El color rojo representa la isolectina Alexa 568, mientras que el color verde representa la actina del músculo α liso (AME). Barras de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.