Method Article

Experimentos de optogenética de alto rendimiento en levaduras utilizando la plataforma automatizada Lustro

DOI:

10.3791/65686

⸱

August 4th, 2023

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 2University of Wisconsin Carbone Cancer Center, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe los pasos para utilizar la plataforma automatizada Lustro para realizar una caracterización de alto rendimiento de los sistemas optogenéticos en levaduras.

Abstract

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La optogenética ofrece un control preciso sobre el comportamiento celular mediante la utilización de proteínas sensibles a la luz codificadas genéticamente. Sin embargo, la optimización de estos sistemas para lograr la funcionalidad deseada a menudo requiere múltiples ciclos de diseño, construcción y prueba, que pueden llevar mucho tiempo y mano de obra. Para hacer frente a este reto, hemos desarrollado Lustro, una plataforma que combina la estimulación lumínica con la automatización del laboratorio, lo que permite un cribado y caracterización eficientes de alto rendimiento de los sistemas optogenéticos.

Lustro utiliza una estación de trabajo de automatización equipada con un dispositivo de iluminación, un dispositivo de agitación y un lector de placas. Mediante el empleo de un brazo robótico, Lustro automatiza el movimiento de una placa de micropocillos entre estos dispositivos, lo que permite la estimulación de cepas optogenéticas y la medición de su respuesta. Este protocolo proporciona una guía paso a paso sobre el uso de Lustro para caracterizar los sistemas optogenéticos para el control de la expresión génica en la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae. El protocolo cubre la configuración de los componentes de Lustro, incluida la integración del dispositivo de iluminación con la estación de trabajo de automatización. También proporciona instrucciones detalladas para programar el dispositivo de iluminación, el lector de placas y el robot, lo que garantiza un funcionamiento fluido y la adquisición de datos durante todo el proceso experimental.

Introduction

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La optogenética es una técnica poderosa que utiliza proteínas sensibles a la luz para controlar el comportamiento de las células con alta precisión 1,2,3. Sin embargo, la creación de prototipos de construcciones optogenéticas y la identificación de las condiciones óptimas de iluminación pueden llevar mucho tiempo, lo que dificulta la optimización de los sistemas optogenéticos 4,5. Los métodos de alto rendimiento para detectar y caracterizar rápidamente la actividad de los sistemas optogenéticos pueden acelerar el cicl....

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Protocol

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Las cepas de levadura utilizadas en este estudio están documentadas en la Tabla de Materiales. Estas cepas presentan un crecimiento robusto dentro del rango de temperatura de 22 °C a 30 °C y pueden cultivarse en varios medios de levadura estándar.

1. Configuración de la estación de trabajo de automatización

  1. Equipe la estación de trabajo automatizada con un brazo de agarre robótico (RGA, consulte la tabla de materiales) capaz de mover placas de micropocillos (Figura 1).
  2. Instale un agitador calentador de microplacas (consulte ....

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Results

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La Figura 4A muestra los valores de fluorescencia a lo largo del tiempo para una cepa optogenética que expresa un reportero fluorescente controlado por un factor de transcripción dividida inducible por luz. Las diferentes condiciones de luz utilizadas en el experimento se reflejan en las variaciones en el ciclo de trabajo, que representa el porcentaje de tiempo que la luz está encendida. Se observa que el nivel general de fluorescencia es proporcional al ciclo de trabajo de la estimulación d.......

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Discussion

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El protocolo Lustro presentado aquí automatiza los procesos de cultivo, iluminación y medición, lo que permite el cribado y la caracterización de sistemas optogenéticos de alto rendimiento6. Esto se logra mediante la integración de un dispositivo de iluminación, un lector de microplacas y un dispositivo de agitación en una estación de trabajo de automatización. Este protocolo demuestra específicamente la utilidad de Lustro para el cribado de diferentes constructos optogenéticos integrados en la le.......

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por la R35GM128873 de subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud y la 2045493 de subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias (otorgadas al M.N.M.). Megan Nicole McClean, Ph.D. tiene un Premio a la Carrera en la Interfaz Científica del Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. recibió el apoyo de una beca de capacitación del NHGRI para el Programa de Capacitación en Ciencias Genómicas 5T32HG002760. Reconocemos las fructíferas discusiones con los miembros del laboratorio McClean y, en particular, agradecemos a Kieran Sweeney por proporcionar comentarios sobre el manuscrito.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Placa inferior de vidrio de 96 pocillos con cubierta de vidrio # 1.5CellvisP96-1.5H-N
BioShake 3000-T olmo (agitador de calentadores)Estación deQINSTRUMENTS
Tecan
LITOS (dispositivo de iluminación alternativo)Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (dispositivo de iluminación)Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Brazo de agarre robóticoTecan
Spark (lector de placas)Tecan
Sintético Medios completosSigmaAldrichY1250
Tecan Connect (aplicación de alerta al usuario)Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ 0::5' homología Ura3, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, homología Ura 3'  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ 0::5' homología Ura3, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, homología Ura 3'  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ 0::5' homología de Ura3, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, homología de Ura 3'  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD AgarSigmaAldrichY1500
trabajo de automatización fluida

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839(2022).
  2. Lan, T. -H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Tre....

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