Aislamiento y cultivo de células ciliadas cocleares primarias de ratones neonatos

Resumen

En este artículo, presentamos un protocolo detallado para aislar y cultivar células ciliadas cocleares primarias de ratones. Inicialmente, el órgano de Corti se diseccionó de cócleas murinas neonatales (de 3 a 5 días de edad) bajo un microscopio. Posteriormente, las células se digierieron enzimáticamente en una suspensión unicelular y se identificaron mediante inmunofluorescencia después de varios días en cultivo.

Resumen

Las células ciliadas cocleares son los receptores sensoriales del sistema auditivo. Estas células se encuentran en el órgano de Corti, el órgano sensorial responsable de la audición, dentro del laberinto óseo del oído interno. Las células ciliadas cocleares consisten en dos tipos anatómica y funcionalmente distintos: células ciliadas externas e internas. El daño a cualquiera de ellos resulta en pérdida de audición. En particular, como las células ciliadas internas no pueden regenerarse y el daño a ellas es permanente. Por lo tanto, el cultivo in vitro de células ciliadas primarias es indispensable para investigar los efectos protectores o regenerativos de las células ciliadas cocleares. Este estudio tuvo como objetivo descubrir un método para aislar y cultivar células ciliadas de ratón.

Tras la extracción manual de la pared lateral coclear, el epitelio auditivo se diseccionó meticulosamente del modiolo coclear al microscopio, se incubó en una mezcla compuesta por tripsina-EDTA al 0,25 % durante 10 min a 37 °C y se suspendió suavemente en medio de cultivo con una punta de pipeta de 200 μL. La suspensión celular se pasó a través de un filtro celular, el filtrado se centrifugó y las células se cultivaron en placas de 24 pocillos. Las células ciliadas se identificaron en función de su capacidad para expresar un complejo de mecanotransducción, la miosina-VIIa, que está implicada en las tensiones motoras, y mediante el marcaje selectivo de la F-actina mediante faloidina. Las células alcanzaron >90% de confluencia después de 4 d en cultivo. Este método puede mejorar nuestra comprensión de las características biológicas de las células ciliadas cultivadas in vitro y demostrar la eficiencia de los cultivos de células ciliadas cocleares, estableciendo una base metodológica sólida para futuras investigaciones auditivas.

Introducción

Las células ciliadas cocleares desempeñan un papel importante en la detección del sonido y la transmisión de señales al nervio auditivo. Las células ciliadas son células mecanicistas que funcionan como receptores sensoriales primarios y convierten las vibraciones sonoras en señales eléctricas en los vertebrados. El epitelio sensorial del oído interno de los mamíferos comprende una sola fila de células ciliadas internas y tres filas de células ciliadas externas. En diferentes áreas básicas de membrana, las células ciliadas perciben sonidos a diferentes frecuencias (entre 20 y 2.000 Hz)¹. La función de las células ciliadas externas es un proceso ....

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados (No. 2021-847) por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Xi'an Jiaotong.

1. Esterilización y preparación del material

1. Esterilice las herramientas de disección mediante desinfección con vapor a alta temperatura y alta presión y séquelas en una incubadora a 50 °C durante la noche.
2. Preparar 100 ml del medio de cultivo que contenga un 10 % de suero fetal bovino (FBS) y 10 mg/ml de penicilina/estreptomicina (añadir 10 ml de FBS y 10 μl de solución madre de penicilina a 90 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco (EMEM)) con antelación y c....

Resultados

Siguiendo este protocolo, sembramos las células aisladas. Las semillas de células ciliadas cocleares primarias se consideraron exitosas si las células no flotaban en el medio de cultivo y se diseminaban dentro de las 24 h. Determinamos el número de células ciliadas después de que se adhirieron y se extendieron en agregados planos en el fondo del plato. Después de 1 día, las células ciliadas vivas se adhirieron firmemente al fondo de la placa de cultivo y las células no adherentes se eliminaron enjuagando con PBS. Típicam.......

Discusión

En comparación con la línea celular HEI-OC1, los cultivos primarios de células ciliadas replicaron con mayor precisión el estado fisiológico de las células in vivo. Por lo tanto, el método de cultivo primario auditivo establecido mediante el aislamiento de células vivas de los órganos cocleares y su cultivo inmediato parece ser una herramienta valiosa para la investigación exhaustiva de los sistemas auditivos. Ciertas técnicas son cruciales para una cultura exitosa. En primer lugar, minimizar la duración de la separación.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de cultivo celular BioLite de 100 mm	Thermo Fisher Scientific	130182	uso para cultivo
placa de cultivo celular Nunc de 35 mm	Thermo Fisher Scientific	150318	uso para el cultivo
de paladar de 6 pocillos	Thermo Fisher Scientific	310109005	uso para cultivo
70 y micro; coladores de células m	BD Company	352350	usando para filtro
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	tinción inmunofluorescente
Anti-conejo IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientifc	A11008	tinción inmunofluorescente
día 3-5 neonatal murino			proporcionado por la Universidad Xi'an Jiaotong
, Dulbecco' s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	uso para el cultivo
Suero fetal bovino	Thermo Fisher Scientific	12483020	uso para el cultivo
Pinzas	Dumont	5 #	uso para la disección
Microscopio de anatomía Leica	Alemania	S9i	uso para la disección
Penicilina / estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140-122	utilizando para cultivo
Contrachapaleno de conejo a miosina VIIa	Abcam empresa	ab92996	inmunofluorescente
Tijera	Belevor	10cm/04.0524.10	utilizando para disección
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	tinción inmunofluorescente
Tripsina	Thermo Fisher Scientific	25200072	uso para cultivo

tinción