Este protocolo presenta un método completo y eficiente para producir organoides renales a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) utilizando condiciones de cultivo en suspensión. El énfasis principal de este estudio radica en la determinación de la densidad celular inicial y la concentración de agonistas WNT, lo que beneficia a los investigadores interesados en la investigación de organoides renales.
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Artículo de método
Generación de organoides renales en suspensión a partir de células madre pluripotentes inducidas
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Los organoides renales se pueden generar a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a través de varios enfoques. Estos organoides son muy prometedores para el modelado de enfermedades, la detección de fármacos y las posibles aplicaciones terapéuticas. Este artículo presenta un procedimiento paso a paso para crear organoides renales a partir de iPSCs, comenzando desde la estría primitiva posterior (PS) hasta el mesodermo intermedio (IM). El enfoque se basa en el medio APEL 2, que es un medio definido y libre de componentes animales. Se complementa con una alta concentración de agonista WNT (CHIR99021) durante 4 días, seguido de factor de crecimiento de fibroblastos 9 (FGF9)/heparina y una baja concentración de CHIR99021 durante 3 días adicionales. Durante este proceso, se hace hincapié en la selección de la densidad celular óptima y la concentración de CHIR99021 al inicio de las iPSC, ya que estos factores son críticos para la generación exitosa de organoides renales. Un aspecto importante de este protocolo es el cultivo en suspensión en una placa de baja adherencia, lo que permite que el IM se desarrolle gradualmente en estructuras nefronas, que abarcan estructuras tubulares glomerulares, tubulares proximales y tubulares distales, todas presentadas en un formato visualmente comprensible. En general, este protocolo detallado ofrece una técnica eficiente y específica para producir organoides renales a partir de diversas iPSC, lo que garantiza resultados exitosos y consistentes.
Introducción
El riñón desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis fisiológica, dependiendo de su unidad funcional. Las nefronas, que excretan productos de desecho, pueden regular la composición de los fluidos corporales. La enfermedad renal crónica (ERC), causada por mutaciones hereditarias u otros factores de alto riesgo, eventualmente progresará a enfermedad renal terminal (IRT)1,2. Aparentemente, la IRT se debe a la limitada capacidad de regeneración de las nefronas. Por lo tanto, se requiere terapia de reemplazo renal. La diferenciación dirigida de las iPSC humanas permite la generación in ....
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Protocolo
Las iPSCs utilizadas para el presente estudio se obtuvieron de una fuente comercial. Las células se mantuvieron con medio mTeSR en placas recubiertas de matriz de membrana basal disponibles comercialmente (ver Tabla de Materiales). La Tabla 1 contiene todas las composiciones de medios utilizadas en el estudio.
1. Siembra de iPSCs para la diferenciación e inducción de la raya primitiva posterior (PS)
- Lave las iPSC en la placa de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana con 2 ml de DPBS. Aspire el DPBS con una pipeta.
- Añadir 1 mL de la solución de desprendimiento de cél....
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Resultados
La producción de IM se logra mediante la activación de la señalización canónica de WNT utilizando el inhibidor de GSK3 CHIR99021, seguido de FGF9/heparina. Desde el día 0 hasta el día 4, las iPSC se expanden rápidamente y adquieren formas romboidales o triangulares. La confluencia alcanza el 90%-100% y se acumula uniformemente hasta el día 7. Tras el cultivo en suspensión, los agregados forman espontáneamente estructuras de nefronas después de disociarse en el día 7. Los organoides renales creados a través del cultivo en.......
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Discusión
Se ha descrito un protocolo detallado para la generación de organoides renales a partir de iPSCs, que implica modificaciones menores en el medio basal, la densidad celular inicial y la concentración de CHIR99021. En varios experimentos, se encontró que los factores críticos para la generación exitosa de organoides renales eran la diferenciación inicial del mesodermo intermedio (MI) y el estado celular en el día 7. Además, diferentes líneas de iPSC exhibieron variaciones en la proliferación celular y el potencial de difer.......
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Divulgaciones
Los autores no informaron de ningún posible conflicto de intereses.
Agradecimientos
Estamos muy agradecidos a todos los miembros de Mao y Hu Lab, pasados y presentes, por las interesantes discusiones y las grandes contribuciones al proyecto. Agradecemos al Centro Nacional de Investigación Clínica para la Salud Infantil por el gran apoyo. Este estudio contó con el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (U20A20351 a Jianhua Mao, 82200784 a Lidan Hu), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Zhejiang de China (No. LQ22C070004 a Lidan Hu) y la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (Subvenciones No. BK20210150 a Gang Wang).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de cultivo celular de 96 pocillos, fondo plano | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| Anticuerpos | |||
| Alcohol bencílico | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzoato de bencilo | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Gabinete de seguridad biológica | Gato Haier | #HR40  A2 | |
| Biotina anti-humana LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Células mononucleares sanguíneas hiPS-B1 (iPSc, hembra) | N/A | N/A | |
| Agitador de nivel de dióxido de carbono | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Productos químicos, péptidos y proteínas recombinantes | |||
| la vía Wnt) | STEMCELL Tecnologías | Cat #72054 | |
| Costar Placa de cultivo celular múltiple de 6 pocillos | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Placa de 6 pocillos de fijación ultrabaja | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI solución de tinción | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Gato #G4610 | |
| Burro Anti-Ovejas IgG H& L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Burro serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (sin calcio, magnesio, rojo de fenol) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Cabra Anti-Conejo IgG (1:400) | Earthox | Gato #E032220 | |
| Dylight 549-Cabra Anti-Ratón IgG (1:400) | Earthox | Gato #E032310 | |
| Dylight 549-Cabra Anti-Conejo IgG (1:400) | Earthox | Gato #E032320 | |
| Dylight 649-Cabra Anti-Conejo IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Modelos experimentales: Líneas celulares | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubadora | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | #A1413202 | |
| Placas de cultivo con fondo de vidrio | NEST | Cat #801002 | |
| Cabra anti-humano CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Solución de heparina (suplemento de cultivo celular) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| FGF-9 Recombinante Humano | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Microscopio invertido | OLYMPUS | #CKX53 | |
| Microscopio confocal de barrido láser | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Metilcelulosa | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Microcentrífuga | HENGNUO | Gato #2-4B | |
| Ratón anti-humano CD31 (1:300) | BD Biosciences | Gato #555444 | |
| Ratón anti-humano ECAD (1:300) | BD Biosciences | Gato #610182 | |
| Ratón anti-humano Integrina beta 1 (1:300) | Abcam | Gato #ab30394 | |
| Ratón anti-humano MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Gato #39795 | |
| Mowiol 4-88 ( Alcohol polivinílico 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Suplemento | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Medio basal | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc Viales CryoTube | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Otros | |||
| Conejo anti-humano GATA3 (1:300) | Tecnología de señalización celular | Gato #5852S | |
| Conejo antihumano LRP2 (1:300) | Zafiro Bioscience | Gato #NBP2-39033 | |
| Conejo antihumano Sinaptopodina (1:300) | Abcam | Gato #ab224491 | |
| Conejo antihumano WT1 (1:300) | Abcam | Gato #ab89901 | |
| Conejo anti-ratón PDGFR (1:300) | Abcam | Gato #ab32570 | |
| Albúmina sérica humana recombinante (rHSA) | YEASEN | Gato #20901ES03 | |
| Oveja anti-humano NPHS1 (1:300) | R& D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medio | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Estreptavidina Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihidroclorhidrato) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
Referencias
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE.
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Reimpresiones y permisos
