Este protocolo presenta un método completo y eficiente para producir organoides renales a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) utilizando condiciones de cultivo en suspensión. El énfasis principal de este estudio radica en la determinación de la densidad celular inicial y la concentración de agonistas WNT, lo que beneficia a los investigadores interesados en la investigación de organoides renales.
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Artículo de método
Generación de organoides renales en suspensión a partir de células madre pluripotentes inducidas
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Resumen
Resumen
Los organoides renales se pueden generar a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a través de varios enfoques. Estos organoides son muy prometedores para el modelado de enfermedades, la detección de fármacos y las posibles aplicaciones terapéuticas. Este artículo presenta un procedimiento paso a paso para crear organoides renales a partir de iPSCs, comenzando desde la estría primitiva posterior (PS) hasta el mesodermo intermedio (IM). El enfoque se basa en el medio APEL 2, que es un medio definido y libre de componentes animales. Se complementa con una alta concentración de agonista WNT (CHIR99021) durante 4 días, seguido de factor de crecimiento de fibroblastos 9 (FGF9)/heparina y una baja concentración de CHIR99021 durante 3 días adicionales. Durante este proceso, se hace hincapié en la selección de la densidad celular óptima y la concentración de CHIR99021 al inicio de las iPSC, ya que estos factores son críticos para la generación exitosa de organoides renales. Un aspecto importante de este protocolo es el cultivo en suspensión en una placa de baja adherencia, lo que permite que el IM se desarrolle gradualmente en estructuras nefronas, que abarcan estructuras tubulares glomerulares, tubulares proximales y tubulares distales, todas presentadas en un formato visualmente comprensible. En general, este protocolo detallado ofrece una técnica eficiente y específica para producir organoides renales a partir de diversas iPSC, lo que garantiza resultados exitosos y consistentes.
Introducción
El riñón desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis fisiológica, dependiendo de su unidad funcional. Las nefronas, que excretan productos de desecho, pueden regular la composición de los fluidos corporales. La enfermedad renal crónica (ERC), causada por mutaciones hereditarias u otros factores de alto riesgo, eventualmente progresará a enfermedad renal terminal (IRT)1,2. Aparentemente, la IRT se debe a la limitada capacidad de regeneración de las nefronas. Por lo tanto, se requiere terapia de reemplazo renal. La diferenciación dirigida de las iPSC humanas permite la generación in vitro de organoides renales 3D específicos para cada paciente, que pueden utilizarse para estudiar el desarrollo renal, modelar enfermedades específicas del paciente y realizar el cribado de fármacos nefrotóxicos 3,4.
Durante el desarrollo embrionario, los riñones se originan en el mesodermo intermedio (MI), que se diferencia de la estría primitiva (PS). La vía de señalización clásica WNT puede inducir una diferenciación adicional de la IM con la participación coordinada de FGF (FGF9, FGF20) y BMP (señalización Bmp7 a través de JNK)5,6,7. Producen dos importantes poblaciones celulares de células progenitoras nefríticas (NPC): la yema ureteral (UB) y el mesénquima metanéfrico (MM), formando los conductos colectores y la nefrona, respectivamente 8,9. Cada nefrona está formada por segmentos glomerulares y tubulares, como los túbulos proximal y distal, y el asa de Henle10,11. De acuerdo con la teoría mencionada anteriormente, los protocolos actualmente publicados imitan las cascadas de señales y la estimulación del factor de crecimiento para inducir organoides renales 5,12.
En los últimos años, se han desarrollado muchos protocolos para diferenciar las iPSC humanas en organoides renales 5,6,7,12. Takasato et al.7 optimizaron la duración del tratamiento con CHIR (agonista WNT) antes de la sustitución por FGF9. De acuerdo con su protocolo, la exposición a CHIR durante 4 días, seguida de FGF9 durante 3 días, es la forma más efectiva de inducir IM de iPSC. Se utilizaron filtros Transwell como formato de cultivo en su procedimiento; Sin embargo, este método es difícil para los principiantes. Por lo tanto, Kumar et al.13 intentaron cambiar el formato de la cultura y optaron por suspenderla. Disociaron las células adherentes en el día 7 para sembrarlas en placas de baja adherencia para ayudarlas a ensamblarse en cuerpos embrioides (EB) que contienen estructuras similares a nefronas. Sin embargo, el efecto por lotes de estos métodos fue evidente, especialmente en diferentes iPSC. Además, diferentes literaturas reportaron que la concentración de CHIR varió de 7 μM a 12 μM 5,13,14.
Especulamos que la concentración de densidad celular y el CHIR podrían afectar a la generación de organoides en diferentes iPSCs, y esto se ha comprobado en numerosas ocasiones en nuestros experimentos. El presente protocolo ha modificado ligeramente el método de estudio de Kumar et al.13 y ha proporcionado a los usuarios un procedimiento paso a paso. El cronograma y el esquema del enfoque se muestran en la Figura 1.
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Protocolo
Las iPSCs utilizadas para el presente estudio se obtuvieron de una fuente comercial. Las células se mantuvieron con medio mTeSR en placas recubiertas de matriz de membrana basal disponibles comercialmente (ver Tabla de Materiales). La Tabla 1 contiene todas las composiciones de medios utilizadas en el estudio.
1. Siembra de iPSCs para la diferenciación e inducción de la raya primitiva posterior (PS)
- Lave las iPSC en la placa de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana con 2 ml de DPBS. Aspire el DPBS con una pipeta.
- Añadir 1 mL de la solución de desprendimiento de células disponible en el mercado (ver Tabla de Materiales) para separar las iPSC e incubar a 37 °C durante 5 min.
- Agregue 1 ml de mTeSR a las iPSC y asegúrese de que las células se hayan levantado de la superficie plástica.
- Centrifugar las celdas a 400 x g durante 3 min a temperatura ambiente (RT). Vuelva a suspender el gránulo de células y cuente el número de células con un hemocitómetro.
- Siembre un rango de densidades celulares en una placa de 24 o 6 pocillos recubierta con matriz de membrana y cultive con mTeSR suplementado con 10 μM de inhibidor de Rho quinasa (Y-27632) (ver Tabla de materiales). Cultivarlos durante la noche en una incubadora deCO2 a 37 °C.
NOTA: Para inducir PS, la concentración óptima de CHIR99021 y las densidades celulares adecuadas varían de diferentes líneas de iPSC. Siembre un rango de densidades (por ejemplo, 0.6, 0.9, 1.2, 1.5, 1.8, 2.4 * 103 células individuales por centímetro cuadrado) y un rango de concentración de CHIR99021 de 7 μM a 12 μM. Inicie la diferenciación de cada densidad y cada CHIR en el mismo día. Encuentre la concentración óptima de CHIR99021 y las densidades celulares adecuadas en una placa de 24 pocillos y luego amplíe el cultivo en placas de 6 pocillos. Aquí proporcionamos un protocolo basado en una placa de 6 pocillos. - Al día siguiente, aspire el mTeSR y lave las células con 2 ml de DPBS.
- Añadir 2 ml de medio de estadio I (medio de diferenciación de células madre que contenga 8-12 μM CHIR99021) (Tabla 1), véase el día 0.
- Cultivarlos en una incubadora a 37 °C durante 4 días, refrescar la etapa I media cada dos días.
2. Inducción del mesodermo intermedio nefrogénico (IM)
- El día 4, retire el medio de la etapa I y lávese con 2 ml de DPBS.
- Añadir 2 mL de medio en estadio II a las células (medio de diferenciación de células madre que contiene 200 ng/mL de FGF9, 1 μg/mL de heparina y 1 μM CHIR99021) (Tabla 1).
- Cultivarlos en una incubadora a 37 °C y refrescar el medio cada 2 días hasta el día 7.
3. Generación de organoides renales en cultivo en suspensión
NOTA: Durante el período de observación del día 0 al día 7, el estado de las células es crítico. Si las células exhiben una expansión exitosa y se amontonan sin restos celulares significativos, demuestra la derivación exitosa del mesodermo intermedio (IM), lo que indica la preparación para pasar a la siguiente etapa. Sin embargo, si las células muestran signos de apoptosis inicial, seguida de necrosis o rotura, puede ser indicativo de concentraciones inadecuadas de CHIR99021 o densidades celulares.
- El día 7, retire el medio en etapa II y lave las células con 2 ml de DPBS.
- Añadir 1 mL de la solución de desprendimiento de células a cada pocillo e incubar a 37 °C durante 5 min hasta que las células sean refractivas bajo contraste de fase.
- Pipetear 1 ml de medio de etapa II a las células, mezclar y asegurarse de que las células se hayan levantado de la superficie.
- Recoja la suspensión celular en un tubo de 15 ml y centrifugue a 400 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 2 ml de medio estadio III (medio de diferenciación de células madre que contenga 200 ng/ml de FGF9, 1 μg/ml de heparina y 1 μM de CHIR99021 en metilcelulosa (MC) al 0,1 % y alcohol polivinílico (PVA) al 0,1 % suplementado con 10 μM de inhibidor de la Rho quinasa (Y-27632) (consulte la tabla de materiales). Mézclalo suavemente.
- Mezcle la suspensión celular y la semilla en una placa de baja adherencia de 6 pocillos en una proporción de 1:3. Coloque la placa en un agitador orbital (resistente al CO 2, que gira a 60 rpm) en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2.
- 24 h después, retirar el inhibidor de la Rho quinasa (Y-27632) y añadir medios de estadio III (suplemento de medio de diferenciación de células madre con 200 ng/ml de FGF9, 1 μg/ml de heparina, 1 μM de CHIR99021, 0,1 % de MC, 0,1 % de PVA). Cultivo durante 2 días. Cambie el medio en el cultivo de suspensión siguiendo los pasos que se indican a continuación:
- Cortar la punta de la pipeta de 1 ml con unas tijeras asépticas.
- Agite suavemente la placa de 6 pocillos para colocar los organoides en el medio de la placa.
- Aspirar los organoides con las pipetas preparadas en un tubo de 15 ml y dejarlos reposar durante 5 min.
- Aspire el sobrenadante y deje los organoides en el fondo del tubo.
- Agregue el medio fresco para volver a suspender los organoides y vuelva a colocar en una placa de baja adherencia de 6 pocillos.
- Continúe agitando la placa de baja adherencia a 60 rpm en la incubadora. Cambie el medio de la etapa III cada dos días hasta el día 12.
- El día 12, cambie el medio a medio de estadio IV (medio de diferenciación de células madre que contenga 0,1 % de MC y 0,1 % de PVA).
- Cambie el medio cada dos días hasta el día 25. Los organoides pueden convertirse gradualmente en estructuras de nefronas maduras desde el día 12 hasta el 25.
4. Tinción por inmunofluorescencia de organoides renales
- Recoja los organoides renales en un tubo de 15 ml y lávese con 2 ml de PBS.
- Después de dejar reposar durante 5-10 minutos, fijar los organoides renales en PFA al 2% recién preparado durante 20 minutos a 4 °C.
- Retire el PFA y lave los organoides con 1 ml de PBS que contenga 0,3% de Triton X-100 (0,3% PBST), agítelo uniformemente en una coctelera (con una velocidad de rotación no superior a 60 rpm) durante 8 minutos, déjelo reposar durante 5 minutos y luego retire el sobrenadante. Repita tres veces.
NOTA: Los organoides se pueden almacenar en 0.3% PBST a 4° C durante 2-4 semanas. - Incubar los organoides fijados con suero de burro al 10% en PBST (tampón de bloqueo) (ver Tabla de Materiales) durante la noche a 4 °C.
- Diluir los anticuerpos primarios (enumerados en la Tabla de Materiales) en un tampón de bloqueo con una proporción de 1:300.
- Incubar los organoides con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C con agitación.
NOTA: Asegúrese de que los glomérulos y los túbulos se puedan teñir simultáneamente en un organoide. - Lavar los organoides con 1 ml de PBST al 0,3%, agitarlo uniformemente en una coctelera (con una velocidad de rotación no superior a 60 rpm) durante 8 min, dejar reposar durante 5 min y luego retirar el sobrenadante. Repita tres veces.
- Incubar los organoides con anticuerpos secundarios (enumerados en la Tabla de Materiales) y DAPI durante la noche a 4 °C con agitación. A continuación, repita el paso 4.7.
NOTA: Tanto el anticuerpo secundario como el DAPI se diluyen en solución de bloqueo, anticuerpo secundario (1:400) y DAPI (1:1000). - Después de la tinción, deshidratar los organoides con metanol (25%, 50%, 75% y 100% durante 5 min cada uno), luego permear con alcohol bencílico y benzoato de bencilo (BABB, proporción 1:2) (ver Tabla de Materiales) durante 5 min.
- Coloque los organoides aclarados en un plato con fondo de vidrio (consulte la Tabla de materiales) y examínelos mediante microscopía confocal.
NOTA: Al tomar imágenes, elija la placa de Petri en la parte inferior de la placa de vidrio y, al permear, coloque el BABB directamente en la placa de Petri para mantener húmedo el fondo de la placa.
5. Ensayo de captación de dextrano in vitro
- El día 25, incubar los organoides con 100 μg/mL de dextrano marcado con fluorescencia (ver Tabla de Materiales) durante 4 h en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2.
- 4 horas más tarde, cambie a un medio fresco y capture imágenes de cultivos celulares vivos con un microscopio de fluorescencia de campo amplio.
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Resultados
La producción de IM se logra mediante la activación de la señalización canónica de WNT utilizando el inhibidor de GSK3 CHIR99021, seguido de FGF9/heparina. Desde el día 0 hasta el día 4, las iPSC se expanden rápidamente y adquieren formas romboidales o triangulares. La confluencia alcanza el 90%-100% y se acumula uniformemente hasta el día 7. Tras el cultivo en suspensión, los agregados forman espontáneamente estructuras de nefronas después de disociarse en el día 7. Los organoides renales creados a través del cultivo en...
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Discusión
Se ha descrito un protocolo detallado para la generación de organoides renales a partir de iPSCs, que implica modificaciones menores en el medio basal, la densidad celular inicial y la concentración de CHIR99021. En varios experimentos, se encontró que los factores críticos para la generación exitosa de organoides renales eran la diferenciación inicial del mesodermo intermedio (MI) y el estado celular en el día 7. Además, diferentes líneas de iPSC exhibieron variaciones en la proliferación celular y el potencial de difer...
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Divulgaciones
Los autores no informaron de ningún posible conflicto de intereses.
Agradecimientos
Estamos muy agradecidos a todos los miembros de Mao y Hu Lab, pasados y presentes, por las interesantes discusiones y las grandes contribuciones al proyecto. Agradecemos al Centro Nacional de Investigación Clínica para la Salud Infantil por el gran apoyo. Este estudio contó con el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (U20A20351 a Jianhua Mao, 82200784 a Lidan Hu), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Zhejiang de China (No. LQ22C070004 a Lidan Hu) y la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (Subvenciones No. BK20210150 a Gang Wang).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de cultivo celular de 96 pocillos, fondo plano | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| Anticuerpos | |||
| Alcohol bencílico | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzoato de bencilo | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Gabinete de seguridad biológica | Gato Haier | #HR40  A2 | |
| Biotina anti-humana LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Células mononucleares sanguíneas hiPS-B1 (iPSc, hembra) | N/A | N/A | |
| Agitador de nivel de dióxido de carbono | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Productos químicos, péptidos y proteínas recombinantes | |||
| la vía Wnt) | STEMCELL Tecnologías | Cat #72054 | |
| Costar Placa de cultivo celular múltiple de 6 pocillos | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Placa de 6 pocillos de fijación ultrabaja | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI solución de tinción | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Gato #G4610 | |
| Burro Anti-Ovejas IgG H& L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Burro serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (sin calcio, magnesio, rojo de fenol) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Cabra Anti-Conejo IgG (1:400) | Earthox | Gato #E032220 | |
| Dylight 549-Cabra Anti-Ratón IgG (1:400) | Earthox | Gato #E032310 | |
| Dylight 549-Cabra Anti-Conejo IgG (1:400) | Earthox | Gato #E032320 | |
| Dylight 649-Cabra Anti-Conejo IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Modelos experimentales: Líneas celulares | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubadora | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | #A1413202 | |
| Placas de cultivo con fondo de vidrio | NEST | Cat #801002 | |
| Cabra anti-humano CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Solución de heparina (suplemento de cultivo celular) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| FGF-9 Recombinante Humano | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Microscopio invertido | OLYMPUS | #CKX53 | |
| Microscopio confocal de barrido láser | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Metilcelulosa | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Microcentrífuga | HENGNUO | Gato #2-4B | |
| Ratón anti-humano CD31 (1:300) | BD Biosciences | Gato #555444 | |
| Ratón anti-humano ECAD (1:300) | BD Biosciences | Gato #610182 | |
| Ratón anti-humano Integrina beta 1 (1:300) | Abcam | Gato #ab30394 | |
| Ratón anti-humano MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Gato #39795 | |
| Mowiol 4-88 ( Alcohol polivinílico 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Suplemento | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Medio basal | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc Viales CryoTube | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Otros | |||
| Conejo anti-humano GATA3 (1:300) | Tecnología de señalización celular | Gato #5852S | |
| Conejo antihumano LRP2 (1:300) | Zafiro Bioscience | Gato #NBP2-39033 | |
| Conejo antihumano Sinaptopodina (1:300) | Abcam | Gato #ab224491 | |
| Conejo antihumano WT1 (1:300) | Abcam | Gato #ab89901 | |
| Conejo anti-ratón PDGFR (1:300) | Abcam | Gato #ab32570 | |
| Albúmina sérica humana recombinante (rHSA) | YEASEN | Gato #20901ES03 | |
| Oveja anti-humano NPHS1 (1:300) | R& D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medio | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Estreptavidina Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihidroclorhidrato) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
