Aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón

Se cree que el tejido adiposo perivascular (PVAT), una estructura perivascular compuesta por una mezcla de adipocitos maduros y una fracción vascular estromal (SVF), interactúa con la pared del vaso adyacente a través de su secretoma paracrino¹. Como regulador crítico de la homeostasis vascular, la disfunción de PVAT está implicada en la patogénesis de las enfermedades cardiovasculares ^2,3,4. La SVF del tejido adipocito está formada por varias poblaciones celulares esperadas, entre las que se incluyen las células endoteliales, las células inmunitarias, las células mesoteliales, las células neuronales y las células madre y progenitoras adiposas (ASPC)^5,6. Es bien sabido que las ASPC que residen en la SVF del tejido adiposo pueden dar lugar a adipocitos maduros⁵. Se infiere que la SVF es una fuente crítica de adipocitos maduros en PVAT. Varios estudios han demostrado que el PVAT-SVF puede diferenciarse en adipocitos maduros en condiciones específicas de inducción ^6,7,8.

Actualmente, existen dos sistemas de aislamiento para aislar la SVF del tejido adiposo, uno es la digestión enzimática y el otro es no enzimático⁹. Los métodos enzimáticos suelen dar lugar a un mayor rendimiento de células progenitoras nucleadas¹⁰. Hasta la fecha, los beneficios de la SVF en la promoción de la regeneración vascular y la neovascularización en la cicatrización de heridas, enfermedades urogenitales y cardiovasculares han sido ampliamente demostrados¹¹, especialmente en dermatología y cirugía plástica^12,13. Sin embargo, las perspectivas de aplicación clínica de la SVF derivada de PVAT no han sido bien exploradas, lo que puede atribuirse a la falta de un método estandarizado para el aislamiento de SVF de PVAT. El objetivo de este protocolo es establecer un enfoque estandarizado para el aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la FVSP a partir de la PVAT de ratón que rodea la aorta torácica, lo que permite una mayor investigación de la función de la PVAT. Este protocolo optimiza el procesamiento de tejidos y las técnicas de diferenciación celular para el cultivo de adipocitos periaórticos obtenidos de ratones jóvenes.

Los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital del Tórax de Shanghái, afiliado a la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái (número de aprobación: KS23010) y cumplían con las normas éticas pertinentes. Para este experimento se prefieren ratones machos y hembras C57BL/6 de 4 a 8 semanas de edad.

1. Preparación de herramientas quirúrgicas, tampones y medios de cultivo

1. Herramientas quirúrgicas de autoclave (p. ej., tijeras quirúrgicas y pinzas estándar) a 121 °C durante 30 min. Desinfectar el instrumental microquirúrgico con alcohol al 75%.
2. Prepare solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) suplementada con penicilina-estreptomicina al 1% v/v y otros 10 ml de PBS suplementados con penicilina-estreptomicina v/v al 10%.
   NOTA: En las siguientes secciones, si no se menciona específicamente, PBS se refiere a PBS estéril regular.
3. Prepare el tampón Krebs Ringer HEPES BSA: 1% de albúmina sérica bovina (BSA), 20 mM HEPES disueltos en la solución Krebs Ringer.
4. Preparar solución de digestión fresca: colagenasa tipo 1 (1 mg/mL) y dispasa II (4 mg/mL) disueltas en tampón Krebs Ringer HEPES BSA. Esterilice la solución con un filtro de 0,2 μm.
5. Prepare un plato de 12 pocillos recubierto de colágeno.
   1. Diluir la solución de colágeno (1 mg/mL) con agua desionizada estéril hasta una concentración de 40 μg/mL. Añadir 1 mL de la solución de colágeno diluido en la superficie de cada pocillo para conseguir una concentración de 6-10 μg/^cm2. Incubar el recubrimiento durante 1 h a temperatura ambiente.
   2. Retire la solución restante y enjuague cada pocillo 2 veces con 1 ml de PBS. Utilice la placa inmediatamente o séquela al aire en una campana de flujo laminar de clase II y almacene la placa recubierta a 2-8 °C. Al almacenar, selle las placas recubiertas con parafilm.
6. Prepare el medio de cultivo: medio Dulbecco-Modified Eagles (DMEM) con alto contenido de glucosa, suero bovino fetal (FBS) al 10%, penicilina-estreptomicina al 1% v/v. Mantener a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
7. Prepare el medio de inducción lipogénico: DMEM con alto contenido de glucosa, 10 % de FBS, 1 % v/v de penicilina-estreptomicina, 1 nM de triyodotironina, 1 μM de rosiglitazona, 1 μM de insulina, 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) y 1 μM de dexametasona. Mantener a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
8. Prepare el medio de mantenimiento: DMEM con alto contenido de glucosa, 10 % de FBS, 1 % v/v de penicilina-estreptomicina, 1 nM de triyodotironina, 1 μM de rosiglitazona y 1 μM de insulina. Mantener a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.

2. Disección y aislamiento del tejido adiposo perivascular (PVAT)

1. Eutanasia del ratón por luxación cervical bajo anestesia con isoflurano al 2% o con sobredosis de dióxido de carbono. Pulverizar con alcohol al 75% para la desinfección de la piel.
2. Coloque el ratón en posición supina (mirando hacia arriba).
3. Levante la piel, haga una pequeña incisión y separe sin rodeos la piel y los músculos abdominales con unas tijeras quirúrgicas a lo largo de la línea media ventral desde la pelvis hasta el cuello. Exponga el corazón y los pulmones cortando el diafragma y las costillas a lo largo de ambos lados de la línea media.
4. Extirpe con cuidado el hígado, el bazo, los intestinos y el riñón. Evite cortar la pared intestinal.
5. Extirpar los pulmones y el esófago.
6. Levante suavemente el corazón con fórceps en una mano y separe la aorta de la columna vertebral con unas tijeras quirúrgicas en la otra mano. Luego, coloque el corazón y la aorta en una placa de Petri de 60 mm con PBS que contenga 1% v/v de penicilina-estreptomicina.
7. Retire las pinzas microquirúrgicas y las tijeras microquirúrgicas del alcohol y enjuague con 25 ml de PBS para eliminar el exceso de alcohol. Bajo un microscopio estereoscópico, extirpe el timo y otros tejidos del corazón y la aorta, luego extirpe el corazón, dejando la aorta con los PVAT.
8. Transfiera la aorta con los PVAT a una placa de Petri limpia de 60 mm con PBS que contenga penicilina-estreptomicina al 1% v/v.
9. Use pinzas microquirúrgicas para extirpar los PVAT, con un par de pinzas fijando la aorta y el otro tirando del tejido adiposo. Extirpar el tejido de la vasculatura tanto como sea posible mientras se minimiza el daño al tejido adiposo perivascular.
10. Recoja el PVAT que rodea la aorta torácica en el tubo de microcentrífuga de 2 ml que contiene DMEM con alto contenido de glucosa suplementado con penicilina-estreptomicina al 1% v/v colocado en hielo.

3. Aislamiento de la fracción vascular estromal (SVF)

1. Enjuague los tejidos recolectados secuencialmente con PBS que contenga 10% v/v de penicilina-estreptomicina y PBS que contenga 1% v/v de penicilina-estreptomicina.
   NOTA: A partir de este paso, todos los experimentos deben llevarse a cabo en condiciones estériles en una campana de flujo laminar de clase II.
2. Transfiera los tejidos a una placa de Petri estéril de 60 mm, agregue 200 μL de solución de digestión y píquelos en^{trozos de 1 mm 3} con unas tijeras estériles.
3. Transfiera la mezcla a un tubo de centrífuga de 15 ml con una punta de pipeta de plástico, el extremo ensanchado por un corte de tijera estéril, y agregue 6 ml de solución de digestión para iniciar la reacción de digestión.
   NOTA: Una reacción de digestión (3 ml de solución de digestión) es suficiente para los depósitos de PVAT de seis ratones.
4. Incubar los tejidos a 37 °C en una incubadora con agitador orbital (frecuencia de 150 rpm para una mezcla eficaz) durante 30-45 min. Ata los tubos en una rejilla para que se agiten horizontalmente. Agitar vigorosamente hacia arriba y hacia abajo con la mano durante 10 s cada 5-10 min.
   NOTA: La digestión se puede interrumpir cuando se observa un líquido digestivo homogéneo y amarillento sin fragmentos de tejido.
5. Cuele los tejidos digeridos a través de un colador celular de 70 μm en un tubo de centrífuga de 50 ml. Enjuague el filtro celular con un volumen igual de medio de cultivo para maximizar el rendimiento celular y detener la digestión.
6. Transfiera el filtrado a un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugue a 1.800 × g durante 10 minutos. Invierta el tubo para desechar el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos en 5 mL de PBS. Centrifugar a 1.800 × g durante 5 min.
7. Deseche el sobrenadante invirtiendo el tubo y vuelva a suspender los gránulos en un volumen adecuado de medio de cultivo.
   NOTA: Los gránulos celulares recolectados de cada seis ratones se resuspenden en 1 ml de medio de cultivo y se siembran en un pocillo de una placa de 12 pocillos.
8. Siembre las células en una placa de 12 pocillos recubierta de colágeno e incube a 37 °C en una atmósfera húmeda con 5% de_CO2 durante la noche.
9. Al día siguiente, aspirar el medio de cultivo, lavar las células con PBS precalentado (37 °C) que contenga penicilina-estreptomicina al 1% v/v para eliminar los restos celulares y los glóbulos rojos, y volver a agregar 1 ml de medio de cultivo fresco en cada pocillo.

4. Inducción adipogénica de preadipocitos derivados de SVF a partir de tejido adiposo periaórtico

1. Cambie el medio de cultivo cada dos días hasta que las células alcancen ~60-70% de confluencia.
   NOTA: Por lo general, las células tardan entre 3 y 4 días en alcanzar el 60-70% de confluencia.
2. Cuando las células alcancen el 60-70% de confluencia, aspire el medio de cultivo y reemplácelo con un medio de inducción adipogénico marrón. Considere el día de inducción de la diferenciación adipogénica como el día 0 de la diferenciación.
3. Después de 72 h (día 3 de diferenciación), refresque el medio con medio de mantenimiento. Cambie el medio de mantenimiento cada 2 días hasta que las células se utilicen para experimentos.
4. Analice las células adipogénicas de manera adecuada, como la tinción Oil Red O¹⁴ y la Western blot¹⁵.

Utilizando este protocolo descrito anteriormente, aislamos cuidadosamente las PVAT que rodean las aortas torácicas de ratón (Figura 1A-D). Después de lavar y picar los PVAT en trozos pequeños con unas tijeras estériles (Figura 1E, F), los fragmentos de tejido se digirieron en una solución de digestión que contenía colagenasa tipo 1 (1 mg/mL) y dispasa II (4 mg/mL) y se incubaron a 37 °C en un agitador durante 30-45 min (Figura 1G). Los tejidos digeridos se filtraron a través de un filtro celular de 70 μm en un tubo de centrífuga de 50 mL (Figura 1H). Los gránulos celulares se recolectaron después de la centrifugación (Figura 1I).

Para confirmar el potencial adipogénico de los preadipocitos derivados de la FSV, indujimos las células con un medio de inducción adipogénico marrón que contenía 1 nM de triyodotironina, 1 μM de rosiglitazona, 1 μM de insulina, 0,5 mM de IBMX y 1 μM de dexametasona. Los adipocitos maduros se observaron después de 7-10 días de inducción adipogénica marrón, caracterizada por la formación de vacuolas ricas en lípidos teñidas de rojo O (Figura 2A). El análisis de Western blot mostró además el aumento de los niveles de expresión de proteínas específicas de los adipocitos, incluida la adiponectina, Fabp4, Pgc1α, Pparγ, Ucp1 y la proteína mitocondrial Cox IV (Figura 2B, C). Estos datos sugieren que los preadipocitos derivados de la FVSP del tejido adiposo periaórtico de ratón exhiben un fuerte potencial adipogénico.

Figura 1: Aislamiento de la fracción vascular estromal del tejido adiposo periaórtico de ratón . (A) El corazón y la aorta se diseccionan cuidadosamente con pinzas quirúrgicas y tijeras. Las puntas de flecha blancas y amarillas indican el corazón y la aorta, respectivamente. (B) Los PVAT que rodean la aorta torácica se extraen cuidadosamente con fórceps. (C) La aorta que queda después de la extirpación de PVAT que rodea la aorta torácica. (D) Los PVAT se recogen en un tubo de microcentrífuga de 2 ml que contiene DMEM de alta glucosa con penicilina-estreptomicina al 1% v/v. (E) Los PVAT se enjuagan secuencialmente con PBS que contiene 10% v/v de penicilina-estreptomicina y PBS que contiene 1% v/v de penicilina-estreptomicina. (F) Picar los PVAT en trozos de 1 mm3 con tijeras estériles. (G) Transferir los PVAT picados a un tubo de centrífuga de 15 mL que contenga 6 mL de solución de digestión, e incubar los tejidos a 37 °C durante 30-45 min con agitación a 150 rpm. (H) Detenga la digestión y filtre la suspensión a través de un filtro de células de 70 μm a un tubo de centrífuga de 50 ml. (I) Centrifugar el filtrado a 1.800 × g durante 10 min; la SVF ha sido aislada. Abreviaturas: PVAT = tejido adiposo perivascular; SVF = fracción vascular estromal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Diferenciación adipogénica de la fracción vascular estromal del tejido adiposo periaórtico de ratón. (A) Imágenes representativas del microscopio óptico y tinción con Oil Red O de adipocitos primarios diferenciados de los preadipocitos periaórticos en el día 8. Barras de escala = 200 μm. (B,C) Análisis de Western blot de los niveles proteicos de adiponectina, Fabp4, Pgc1α, Pparγ, Cox IV y Ucp1 para adipocitos primarios diferenciados de preadipocitos periaórticos en el día 8. Se utilizaron las pruebas t de Student de dos colas no apareadas para calcular las diferencias significativas entre los dos grupos. Los valores son medios ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen conflictos de intereses, financieros o de otro tipo, que declarar.