Aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón

Resumen

En este trabajo se describe el aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón, lo que permite estudiar la función del tejido adiposo perivascular y su relación con las células vasculares.

Resumen

El tejido adiposo perivascular (PVAT) es un depósito de tejido adiposo que rodea los vasos sanguíneos y exhibe los fenotipos de los adipocitos blancos, beige y marrones. Descubrimientos recientes han arrojado luz sobre el papel central de la PVAT en la regulación de la homeostasis vascular y en la participación en la patogénesis de las enfermedades cardiovasculares. Una comprensión integral de las propiedades y la regulación de PVAT es de gran importancia para el desarrollo de futuras terapias. Los cultivos primarios de adipocitos periaórticos son valiosos para estudiar la función de PVAT y la diafonía entre los adipocitos periaórticos y las células vasculares. En este trabajo se presenta un protocolo económico y factible para el aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón, que puede ser útil para modelar la adipogénesis o lipogénesis in vitro. El protocolo describe el procesamiento de tejidos y la diferenciación celular para el cultivo de adipocitos periaórticos de ratones jóvenes. Este protocolo proporcionará la piedra angular tecnológica en el banco para la investigación de la función de PVAT.

Introducción

Se cree que el tejido adiposo perivascular (PVAT), una estructura perivascular compuesta por una mezcla de adipocitos maduros y una fracción vascular estromal (SVF), interactúa con la pared del vaso adyacente a través de su secretoma paracrino¹. Como regulador crítico de la homeostasis vascular, la disfunción de PVAT está implicada en la patogénesis de las enfermedades cardiovasculares ^2,3,4. La SVF del tejido adipocito está formada por varias poblaciones celulares esperadas, entre las que se incluyen las células endoteliales, las células inmunitarias,....

Protocolo

Los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital del Tórax de Shanghái, afiliado a la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái (número de aprobación: KS23010) y cumplían con las normas éticas pertinentes. Para este experimento se prefieren ratones machos y hembras C57BL/6 de 4 a 8 semanas de edad.

1. Preparación de herramientas quirúrgicas, tampones y medios de cultivo

1. Herramientas quirúrgicas de autoclave (p. ej., tijeras quirúrgicas y pinzas estándar) a 121 °C durante 30 min. Desinfectar el instrumental microquirúrgico con alco....

Resultados

Utilizando este protocolo descrito anteriormente, aislamos cuidadosamente las PVAT que rodean las aortas torácicas de ratón (Figura 1A-D). Después de lavar y picar los PVAT en trozos pequeños con unas tijeras estériles (Figura 1E, F), los fragmentos de tejido se digirieron en una solución de digestión que contenía colagenasa tipo 1 (1 mg/mL) y dispasa II (4 mg/mL) y se incubaron a 37 °C en un agitador durante 30.......

Discusión

Proponemos un enfoque práctico y factible para el aislamiento y la inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la FVS a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón. Las ventajas de este protocolo son que es sencillo y económico. Un número adecuado de ratones es fundamental para un aislamiento exitoso, ya que un tejido insuficiente puede dar lugar a una baja densidad de SVF y a un mal estado de crecimiento, lo que en última instancia afecta a la eficiencia lipogénica. Además, la edad del ratón es un factor impor.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.2 μ m filtros de jeringa	PALL	4612
placa de 12 pocillos	Labselect	11210
Tubo de centrífuga de 15 mL	Labserv	310109003
3,3',5-triyodo-L-tironina (T3)	Sigma-Aldrich	T-2877	1 nM
50 mL tubo de centrífuga	Labselect	CT-002-50A
anti-adiponectina	Abcam	ab22554	1:1.000 concentración
de trabajo anti-COX IV	CST	4850	1:1.000 concentración
de trabajo anti-FABP4	CST	2120	1:1.000 concentración
de trabajo anti-PGC1 y alfa;	Abcam	ab191838	1:1.000 concentración de trabajo
anti-PPARγ	Invitrogen	MA5-14889	1:1.000 concentración de trabajo
anti-UCP1	Abcam	ab10983	1:1.000 concentración de trabajo
anti-α-Actinina	CST	6487	1:1.000 concentración de trabajo
BSA	Beyotime	ST023-200g	1%
C57BL/6 ratones de 4-8 semanas de ambos sexos	Shanghai Model Organisms Center, Inc.
Filtro de celdas 70 µ m, nylon	Falcon	352350
Colágeno de piel de becerro	Sigma-Aldrich	C8919
Colagenasa, Tipo 1	Worthington	LS004196	1 mg/mL
Dexametasona	Sigma-Aldrich	D1756	1 μ
M Dispasa II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	4 mg/mL
Suero fetal bovino	Gibco	16000-044	10%
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G	20 mM
Hidroclona DMEM de alta glucosa		SH30022.01
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	Incubadora de 0,5 mM
con agitador orbital	Shanghai longyue Instrument Eruipment Co., Ltd.	LYZ-103B
Insulina (bovino)	Sigma-Aldrich	11070-73-8	1 y mu; M
isoflurano	RWD	R510-22-10
Krebs-Ringer's Solution	Pricella	PB180347	proteger de la luz
pinza microquirúrgica	Beyotime	FS233
tijera microquirúrgica	Beyotime	FS217
Aceite Rojo O	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	A600395-0050
PBS (solución salina tamponada con fosfato)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	B548117-0500
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15140122
Peroxidasa AffiniCabra pura Anti-Ratón IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-146 concentración de	trabajo 1:5.000
Peroxidasa AffiniCabra Pura Anti-Conejo IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-144	1:5.000 concentración de trabajo
Rosiglitazona	Sigma-Aldrich	R2408	1 μ M
Pinza estándar	Beyotime	FS225
Tijera quirúrgica	Beyotime	FS001