Extracción de ADN libre de células de muestras de humor vítreo y acuoso para el diagnóstico y seguimiento del linfoma vitreorretiniano

Resumen

Aquí se establece un procedimiento para extraer ADN libre de células del humor vítreo y acuoso para realizar estudios moleculares para el diagnóstico del linfoma vitreorretiniano. El método ofrece la capacidad de extraer simultáneamente ADN del componente celular de la muestra o reservarlo para pruebas auxiliares.

Resumen

El linfoma vitreorretiniano (VRL, por sus siglas en inglés) representa un linfoma agresivo, que a menudo se clasifica como linfoma primario difuso de células B grandes del sistema nervioso central. Para diagnosticar el VRL, se recogen especímenes como el humor vítreo y, más recientemente, el humor acuoso. Las pruebas diagnósticas para VRL en estos especímenes incluyen citología, citometría de flujo y pruebas moleculares. Sin embargo, tanto la citopatología como la citometría de flujo, junto con las pruebas moleculares con ADN celular, requieren células enteras intactas. El desafío radica en el hecho de que el humor vítreo y acuoso suelen tener una baja celularidad, y muchas células se destruyen durante la recolección, el almacenamiento y el procesamiento. Además, estos especímenes plantean dificultades adicionales para las pruebas moleculares debido a la alta viscosidad del humor vítreo y al bajo volumen del humor vítreo y acuoso. Este estudio propone un método para extraer ADN libre de células de muestras vítreas y acuosas. Este enfoque complementa la extracción de ADN celular o permite que el componente celular de estas muestras se utilice para otros métodos de diagnóstico, como la citología y la citometría de flujo.

Introducción

El linfoma vitreorretiniano (VRL) es un linfoma agresivo asociado al linfoma primario de células B grandes difusa del sistema nervioso central ^1,2,3. La VRL suele ser mortal debido a su implicación en el sistema nervioso central ^1,2. Aunque es poco frecuente^1,4, la VRL a menudo se presenta con síntomas similares a la uveítis posterior y otras enfermedades vitreorretinianas ^4,5. En consecuencia, los pacientes que presentan síntomas de uveítis requieren un diagnóstico para confirmar o descartar la VRL.

Recientemente, se publicaron los criterios de consenso para el diagnóstico de la VRL, que implican una combinación de examen clínico y hallazgos de laboratorio⁶. Los especímenes comúnmente utilizados para diagnosticar VRL incluyen el humor vítreo y, más recientemente, el humor acuoso⁷. El humor vítreo se obtiene a través de un procedimiento quirúrgico llamado vitrectomía pars plana, que permite el acceso al segmento posterior del ojo⁸.

En el protocolo presentado, se recolectaron muestras de humor acuoso y humor vítreo para la extracción celular y de ADNcf. Después de anestesiar a los pacientes y colocar los trócares a aproximadamente 4 mm del limbo corneal, se obtuvo una muestra acuosa de humor de aproximadamente 100-200 μL utilizando una jeringa de tuberculina de 1 mL en el limbo corneal. Para los pacientes pseudofáquicos, el vítreo sin diluir se obtuvo mediante la introducción de aire estéril en la perfusión, lo que permitió la recolección de una mayor cantidad de vítreo sin diluir (hasta 3,5 ml). En pacientes fáquicos, se extrajeron aproximadamente de 500 a 1000 μL de vítreo sin diluir antes de encender una infusión de solución salina balanceada. En algunos casos, se recolectó vítreo diluido secundariamente (500 a 2.000 μL) cambiando la infusión a líquido y colocando el vitrrector dentro del faldón vítreo para obtener esta muestra. La fracción vítrea más diluida se recolectó preservando la bolsa de casete (Figura suplementaria 1) al final de la cirugía. Una vez que esta bolsa llegó al servicio de anatomía patológica, se obtuvo vítreo diluido a partir del drenaje del líquido de esta bolsa en tubos cónicos para su posterior extracción de ADN.

La citopatología del líquido vítreo a menudo se considera el estándar de oro⁹. Sin embargo, varios estudios han demostrado una sensibilidad limitada debido al procesamiento y a la mínima celularidad^10,11,12. La citometría de flujo puede ayudar a identificar las células B clonales, pero también puede estar limitada por la baja celularidad y la fragilidad de las células grandes de linfoma^13,14,15. Tanto la citopatología como la citometría de flujo requieren células enteras intactas. Muchas de estas células se destruyen durante la recolección, el almacenamiento y el procesamiento. Cuando las pruebas moleculares se realizan utilizando ADN extraído de células intactas (ADN celular), sufre de esta misma limitación. Además, la división de la muestra vítrea limitada para todas estas pruebas reduce la cantidad de material disponible para cada prueba.

El ADN libre de células (cfDNA) representa otra fuente de ADN que no requiere células intactas. El cfDNA de muestras vítreas se ha utilizado para la detección de VRL ^16,17, así como de melanoma uveal¹⁸. En este protocolo, se extrae ADN celular y libre de células del líquido vítreo y acuoso para detectar VRL.

Protocolo

El presente protocolo sigue las pautas de cuidado humano y con la aprobación de la junta de revisión institucional (IRB) de la Universidad de Michigan. Para ello, se obtuvo una renuncia al consentimiento informado del IRB. No existen criterios de inclusión o exclusión relevantes para los pacientes involucrados.

1. Separación de componentes celulares y libres de células

NOTA: Se pueden recibir tres tipos de muestras para las pruebas diagnósticas de VRL: vítreo (sin diluir; líquido de la vitrectomía recolectado antes de comenzar la infusión), vítreo diluido dentro de una bolsa de casete (Figura 1) y humor acuoso (líquido de la cámara anterior del ojo).

1. Para el líquido vítreo sin diluir, que es muy viscoso, diluir con 3-5 ml de PBS para facilitar el pipeteo.
2. Para el vítreo diluido dentro de la bolsa de casete (Figura suplementaria 1), drene el líquido en tubos cónicos de 50 ml (uno por cada 45 ml de líquido).
3. El humor acuoso tiene un volumen muy bajo (<200 μL). Para garantizar la máxima recuperación de las células, transfiera la muestra a un tubo de 1,5 ml, enjuague el tubo de microcentrífuga original de 500 μl en el que se recolectó la muestra con un volumen igual de PBS y agréguelo al tubo de 1,5 ml.
4. Centrifugar el líquido vítreo o acuoso a 3.000 x g durante 15 min a temperatura ambiente.
5. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta, teniendo cuidado de no alterar las células granuladas.

2. Extracción de ADN del componente celular

1. Agregue una cantidad adecuada de solución de lisis celular (300 μL para gránulos pequeños, 1 ml o más para gránulos más grandes) (consulte la Tabla de materiales). Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
2. Cuando esté completamente lisado, añadir 1/3 del volumen total de la solución de precipitado de proteína (100 μL para 300 μL de lisado) (ver Tabla de Materiales).
3. Vórtice vigorosamente durante 20-30 s. Centrifugar durante 3 min a 3.000 x g a temperatura ambiente.
4. Pipetear 300 μL de isopropanol en un tubo de microcentrífuga limpio. Pipetear con cuidado el sobrenadante del paso anterior en el tubo de isopropanol.
5. Añadir 1,5 μL de 20 mg/mL de glucógeno (para 300 μL de lisis) (ver Tabla de Materiales).
6. Mezcle bien por inversión, luego coloque la muestra en un congelador a -20 °C durante 1 h o toda la noche para ayudar en la precipitación del ADN.
7. Centrifugar el tubo de 1,5 ml durante 5 min a 3.000 x g a temperatura ambiente. Pipetea el isopropanol.
8. Añadir 0,5 mL de etanol al 70% e invertir el tubo para lavar el pellet.
9. Centrifugar durante 1 min a 3.000 x g a temperatura ambiente y decantar el etanol. Repita el lavado con etanol una vez.
10. Invierta el tubo sobre una gasa limpia para drenar la solución y secar el gránulo o decantar. Centrifugar rápidamente el ADN en una microcentrífuga y pipetear la gota restante de etanol con una punta de pipeta desechable de punta fina (una vez que no quede etanol residual en el tubo, el ADN debe estar seco y listo para hidratar en 5-10 minutos).
11. Agregue 45 μL de solución de hidratación de ADN (consulte la tabla de materiales) al gránulo de ADN seco.
12. Coloque el tubo en un bloque calefactor a 50 °C y déjelo solubilizar durante 1-2 h. Pipetea el ADN hacia arriba y hacia abajo para acelerar el proceso de hidratación.
    NOTA: Agregue más solución de hidratación de ADN si la muestra parece demasiado viscosa.

3. Extracción de ADN libre de células

1. La cantidad de sobrenadante del paso 1.5 es variable. Añadir 70 μL de tampón acondicionador (ver Tabla de Materiales) por cada mililitro del sobrenadante.
2. Mezcle bien las perlas de limpieza mediante vórtice. Agregue 10 μL de perlas de aclarado si procesa <14 ml de sobrenadante libre de células, 20 μL si procesa 14-40 mL.
3. Mezcle bien la mezcla de muestra / perlas mediante vórtice. Centrifugar a 3.000 x g durante 15 min a temperatura ambiente.
4. Sin alterar el gránulo, pipetear el sobrenadante dejando 100 μL si se utilizan 10 μL de perlas de aclaración, y 200 μL si se utilizan 20 μL de perlas de aclaración.
5. Agregue un volumen igual de tampón de digestión de gránulos de orina (consulte la tabla de materiales) al gránulo y vuelva a suspender bien el gránulo mediante vórtice o pipeteo.
6. Agregue proteinasa K (5% (v/v)) al gránulo resuspendido (p. ej., agregue 10 μL de proteinasa K a la mezcla de 200 μL) y mezcle bien mediante un vórtice suave.
7. Incubar la mezcla de pellets a 55 °C durante 30 min.
8. Agregue un volumen de tampón de lisis genómica (consulte la tabla de materiales) a la mezcla de digestión (por ejemplo, 210 μL de tampón de lisis genómica por 210 μL de mezcla de digestión) y mezcle por vórtice.
9. Transfiera la columna de centrifugado disponible en el mercado (consulte la Tabla de materiales) a un nuevo tubo de recolección.
10. Agregue 200 μL de tampón de preparación de ADN de orina a la columna de centrifugación, centrifugue a ≥16,000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente y deseche el flujo.
11. Añadir 700 μL de tampón de lavado de ADN de orina a la columna, centrifugar a ≥16.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente y desechar el flujo.
12. Repita el paso con 200 μL de tampón de lavado de ADN en orina.
13. Transfiera la columna de centrifugación a un tubo de microcentrífuga libre de DNasa/RNasa.
14. Añadir el volumen adecuado de tampón de elución de ADN (basado en las pruebas moleculares que se vayan a realizar) directamente sobre la matriz de la columna y dejarlo reposar durante 3-5 min a temperatura ambiente.
    NOTA: En los casos de ejemplo se utilizaron 30 μL de tampón de elución. Se utiliza más tampón de elución si se requieren pruebas adicionales.
15. Centrifugar a ≥16.000 x g a temperatura ambiente durante 1 min para obtener el ADN libre de células.

Resultados

Estos métodos de extracción se realizaron en un número limitado de casos para garantizar un rendimiento y una capacidad de amplificación adecuados del ADN libre de células en comparación con el ADN celular de las muestras vítreas (cuatro) y acuosas (cuatro). A partir de estas muestras, los rendimientos de ADN del componente libre de células de estos fluidos son similares a los del componente celular (Tabla 1). Las células y el ADNcf de estas muestras también se evaluaron mediante pruebas moleculares, como la mutación asociada a VRL MYD88 L265P. Una PCR en tiempo real específica de alelo para MYD88 L265P (Figura 1) ilustra la detección de esta mutación asociada a VRL tanto en el ADN celular como en el ADNcf. En este ejemplo, la carga de enfermedad parece ser mayor en el componente libre de células, como se ilustra con un umbral de ciclo (Ct) más bajo. Estos datos ilustran que el ADNcf extraído del humor vítreo y acuoso mediante este método da como resultado una fuente de ADN que también se puede aplicar a las pruebas moleculares diagnósticas.

Figura 1: PCR en tiempo real específica del alelo MYD88 L265P. Gráfico de amplificación representativo que muestra la PCR en tiempo real específica del alelo MYD88 L265P para ADN celular y libre de células (cada reacción de PCR realizada por duplicado). El umbral para el umbral de ciclo (Ct) se indica mediante la línea verde. Se etiquetan los puntos en los que la amplificación del ADNcf (trazas azules y marrones) y del ADN celular (trazas rojas y verdes), cada una realizada por duplicado, alcanzan el umbral. La fluorescencia de fondo está presente cerca de 1.00e-003. Una mayor carga de mutación está presente en el componente libre de células, como lo demuestra una Ct más baja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

	Celular	Libre de células
Vítreo 1	130.5	67.5
Vítreo 2	337.5	105
Vítreo 3	150	168
Vítreo 4	1816	654
Acuoso 1	58.5	40.5
Acuoso 2	153	225
Acuoso 3	117	454.5
Acuoso 4	TL	27

Tabla 1: Rendimientos de extracción de ADN celular y libre de células. Rendimiento de ADN (en ng) para cuatro fluidos vítreos sin diluir y cuatro fluidos acuosos de humor (cámara anterior) de cuatro individuos diferentes según la cuantificación fluorométrica del ADN. TL = demasiado bajo para cuantificar.

Figura complementaria 1: Bolsa de casete vítreo. Ejemplo de bolsa de casete vítreo que contiene líquido vítreo diluido. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El linfoma vitreorretiniano (VRL) es un linfoma agresivo de células B grandes ^1,2,3 cuyos síntomas pueden parecerse a los de otras enfermedades vitreorretinianas ^4,5. Las pruebas moleculares del humor vítreo y, más recientemente, acuoso se han convertido en un método crítico para hacer el diagnóstico de VRL o descartarlo. Sin embargo, estos fluidos son de muy bajo volumen y a menudo tienen baja celularidad. Muchas de las células dentro de estos fluidos también pueden dañarse durante la recolección, el almacenamiento y el procesamiento^13,14,15. Como resultado, los rendimientos de ADN de estos especímenes suelen ser bajos. Además, las células de estos fluidos deben compartirse con otros métodos de diagnóstico, como la citopatología y la citometría de flujo. El ADN libre de células (cfDNA) dentro de estos fluidos proporciona otra fuente de ADN que no requiere células intactas.

Este protocolo separa los componentes celulares y libres de células del líquido vítreo o acuoso. El líquido vítreo se diluye con PBS para permitir el pipeteo debido a su viscosidad. El fluido acuoso se maneja para garantizar la máxima recuperación de este fluido de muy bajo volumen.

Una comparación de los rendimientos de ADN de estos dos componentes ilustra que se puede derivar un ácido nucleico adicional sustancial del componente libre de células. Las pruebas moleculares de cfDNA, como la PCR en tiempo real específica del alelo MYD88 L265P, demuestran que la VRL puede detectarse en el componente libre de células del humor vítreo y acuoso, así como en el componente celular. En muchos casos, la cantidad relativa de VRL es mayor en el componente libre de células que en el celular (Figura 1).

La extracción del componente libre de células del líquido vítreo y acuoso permite la evaluación molecular de un componente de estos fluidos que, de otro modo, se descartaría. Debido a que la VRL está representada en componentes celulares y libres de células, el ADN celular y el ADNcf podrían combinarse para maximizar el ADN disponible de estos especímenes limitados. Alternativamente, el componente libre de células de estos fluidos podría usarse para pruebas moleculares, y el componente celular podría usarse para pruebas que requieren células intactas, es decir, citopatología y citometría de flujo. Este enfoque evitaría que se asignen alícuotas separadas de estos fluidos a cada prueba, lo que puede comprometer la sensibilidad de cada prueba para la detección de VRL. Dado el éxito de este método en muestras vítreas y acuosas, este método también puede ser útil en otros fluidos limitados para aumentar la cantidad de ADN disponible para pruebas moleculares.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-Propanol (Isopropanol)	Fischer	A415-500
DNA Clean & Concentrador-10	Zymo Research	D4011
ADN Limpio & Concentrador-5	Zymo Research	D4003
Gentra Solución de lisis celular Puregene	Qiagen	158906
Gentra Puregene Solución de hidratación de ADN	Qiagen	158916
Gentra Puregene Solución de precipitación de proteínas	Qiagen	158912
solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Sigma	P-4417
Quick-DNA Kit de orina	Zymo Research	D3061	Tampón acondicionador; también incluye perlas de limpieza, proteinasa K y columnas de centrifugación
glucógeno ultrapuro, 20 y micro; g/µ L (20 mg/mL)	Thermo Fisher/Invitrogen	10814010