Aquí se establece un procedimiento para extraer ADN libre de células del humor vítreo y acuoso para realizar estudios moleculares para el diagnóstico del linfoma vitreorretiniano. El método ofrece la capacidad de extraer simultáneamente ADN del componente celular de la muestra o reservarlo para pruebas auxiliares.
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Artículo de método
Extracción de ADN libre de células de muestras de humor vítreo y acuoso para el diagnóstico y seguimiento del linfoma vitreorretiniano
En este artículo
Resumen
Resumen
El linfoma vitreorretiniano (VRL, por sus siglas en inglés) representa un linfoma agresivo, que a menudo se clasifica como linfoma primario difuso de células B grandes del sistema nervioso central. Para diagnosticar el VRL, se recogen especímenes como el humor vítreo y, más recientemente, el humor acuoso. Las pruebas diagnósticas para VRL en estos especímenes incluyen citología, citometría de flujo y pruebas moleculares. Sin embargo, tanto la citopatología como la citometría de flujo, junto con las pruebas moleculares con ADN celular, requieren células enteras intactas. El desafío radica en el hecho de que el humor vítreo y acuoso suelen tener una baja celularidad, y muchas células se destruyen durante la recolección, el almacenamiento y el procesamiento. Además, estos especímenes plantean dificultades adicionales para las pruebas moleculares debido a la alta viscosidad del humor vítreo y al bajo volumen del humor vítreo y acuoso. Este estudio propone un método para extraer ADN libre de células de muestras vítreas y acuosas. Este enfoque complementa la extracción de ADN celular o permite que el componente celular de estas muestras se utilice para otros métodos de diagnóstico, como la citología y la citometría de flujo.
Introducción
El linfoma vitreorretiniano (VRL) es un linfoma agresivo asociado al linfoma primario de células B grandes difusa del sistema nervioso central 1,2,3. La VRL suele ser mortal debido a su implicación en el sistema nervioso central 1,2. Aunque es poco frecuente1,4, la VRL a menudo se presenta con síntomas similares a la uveítis posterior y otras enfermedades vitreorretinianas 4,5. En consecuencia, los pac....
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Protocolo
El presente protocolo sigue las pautas de cuidado humano y con la aprobación de la junta de revisión institucional (IRB) de la Universidad de Michigan. Para ello, se obtuvo una renuncia al consentimiento informado del IRB. No existen criterios de inclusión o exclusión relevantes para los pacientes involucrados.
1. Separación de componentes celulares y libres de células
NOTA: Se pueden recibir tres tipos de muestras para las pruebas diagnósticas de VRL: vítreo (sin diluir; líquido de la vitrectomía recolectado antes de comenzar la infusión), vítreo diluido dentro de una bolsa de casete (
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Resultados
Estos métodos de extracción se realizaron en un número limitado de casos para garantizar un rendimiento y una capacidad de amplificación adecuados del ADN libre de células en comparación con el ADN celular de las muestras vítreas (cuatro) y acuosas (cuatro). A partir de estas muestras, los rendimientos de ADN del componente libre de células de estos fluidos son similares a los del componente celular (Tabla 1). Las células y el ADNcf de estas muestras también se evaluaron mediante pruebas moleculares, com.......
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Discusión
El linfoma vitreorretiniano (VRL) es un linfoma agresivo de células B grandes 1,2,3 cuyos síntomas pueden parecerse a los de otras enfermedades vitreorretinianas 4,5. Las pruebas moleculares del humor vítreo y, más recientemente, acuoso se han convertido en un método crítico para hacer el diagnóstico de VRL o descartarlo. Sin embargo, estos fluidos son de muy bajo volume.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Timothy Daniels, MLS(ASCP), MB, QLS, y Helmut Weigelin, MLS(ASCP) fueron fundamentales para establecer este método de extracción dentro de nuestro laboratorio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrador-10 | Zymo Research | D4011 | |
| ADN Limpio & Concentrador-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Solución de lisis celular Puregene | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene Solución de hidratación de ADN | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Solución de precipitación de proteínas | Qiagen | 158912 | |
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Kit de orina | Zymo Research | D3061 | Tampón acondicionador; también incluye perlas de limpieza, proteinasa K y columnas de centrifugación |
| glucógeno ultrapuro, 20 y micro; g/µ L (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
Referencias
- Chan, C. C., et al. Primary vitreoretinal lymphoma: a report from an International Primary Central Nervous System Lymphoma Collaborative Group symposium. Oncologist. 16 (11), 1589-1599 (2011).
- Sagoo, M. S., et al.
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Reimpresiones y permisos
