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Microinyección de retrovirus RCAS(A) recombinante en lentes embrionarias de pollo

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DOI:

10.3791/65727

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1 de septiembre de 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, San Antonio

En este artículo

Resumen

Este documento de protocolo describe la metodología de microinyección de un retrovirus RCAS(A) en el cristalino de pollo embrionario como herramienta para estudiar in situ la función y la expresión de proteínas durante el desarrollo del cristalino.

Resumen

El pollo embrionario (Gallus domesticus) es un modelo animal bien establecido para el estudio del desarrollo y la fisiología del cristalino, dado su alto grado de similitud con el cristalino humano. RCAS(A) es un retrovirus de pollo competente para la replicación que infecta las células en división, que sirve como una poderosa herramienta para estudiar la expresión y función in situ de proteínas mutantes y de tipo salvaje durante el desarrollo del cristalino mediante microinyección en la luz vacía de la vesícula del cristalino en las primeras etapas de desarrollo, restringiendo su acción a las células proliferativas del cristalino circundantes. En comparación con otros enfoques, como los modelos transgénicos y los cultivos ex vivo , el uso de un retrovirus aviar competente para la replicación de RCAS(A) proporciona un sistema altamente efectivo, rápido y personalizable para expresar proteínas exógenas en embriones de pollo. Específicamente, la transferencia génica dirigida puede limitarse a las células proliferativas de la fibra del cristalino sin necesidad de promotores específicos de tejido. En este artículo, haremos un breve resumen de los pasos necesarios para la preparación de RCAS(A) de retrovirus recombinantes, proporcionaremos una descripción detallada y completa del procedimiento de microinyección y proporcionaremos resultados de muestra de la técnica.

Introducción

El objetivo de este protocolo es describir la metodología de microinyección embrionaria de lente de pollo de un RCAS(A) (retrovirus A de sarcoma aviar / leucosis con replicación competente). Se ha demostrado que la administración retroviral efectiva en una lente de pollo embrionaria es una herramienta prometedora para el estudio in vivo del mecanismo molecular y la estructura-función de las proteínas del cristalino en la fisiología, las condiciones patológicas y el desarrollo normales del cristalino. Además, este modelo experimental podría utilizarse para la identificación de dianas terapéuticas y el cribado de fármacos para enfermedades como las cataratas congénitas humanas. En definitiva, este protocolo pretende establecer los pasos necesarios para el desarrollo de una plataforma personalizable para el estudio de las proteínas del cristalino.

Los polluelos embrionarios (Gallus domesticus), debido a su similitud en la estructura y función del cristalino con el cristalino humano, son un modelo animal bien establecido para el estudio del desarrollo y la fisiología del cristalino 1,2,3,4. El uso de un retrovirus aviar competente para la replicación de RCAS(A) se ha considerado un sistema altamente efectivo, rápido y personalizable para expresar proteínas exógenas en embriones de pollo. En particular, tiene una capacidad única para confinar la transferencia de genes diana a las células proliferativas de la fibra del cristalino sin necesidad de promotores específicos del tejido, utilizando el marco de tiempo de desarrollo embrionario único en el que la presencia de la luz vacía del cristalino permite la microinyección in situ de RCAS(A) en el sitio restringido para la expresión de proteínas exógenas dentro de las células proliferativas de la fibra del cristalino5, 6,7,8.

El procedimiento de microinyección de embriones de pollo, descrito en profundidad aquí, se basa originalmente parcialmente en el trabajo de Fekete et. al.6 y desarrollado por Jiang et. al.8 y se ha utilizado como medio para introducir plásmidos virales y no virales en el cristalino de pollitos embrionarios 1,9,10,11,12,13. En general, el trabajo anterior demuestra el potencial de utilizar esta metodología para estudiar el desarrollo, la diferenciación, la comunicación celular y la progresión de la enfermedad en el cristalino, y para el descubrimiento y prueba de dianas terapéuticas para afecciones patológicas del cristalino, como las cataratas.

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Protocolo

Este estudio se llevó a cabo de conformidad con la Ley de Bienestar Animal y el Reglamento de Implementación de Bienestar Animal de acuerdo con los principios de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en San Antonio. Para obtener información general sobre el protocolo, consulte la Figura 1; consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo.

figure-protocol-1
Figura 1: Esquema experimental. 1 . El primer paso del protocolo es la determinación de una proteína diana específica, la identificación de la(s) secuencia(s) genética(s) asociada(s) y la generación de fragmentos de ADN. 2 . Clonación de la(s) secuencia(s) genética(s) en un vector retroviral mediante clonación inicial en un vector adaptador, 3. seguido de un vector viral . 4 . Preparación de partículas virales de alto título utilizando celdas de empaque para cosechar y concentrar. 5 . El paso final, y el enfoque de este protocolo, es la microinyección de las partículas virales RCAS(A) en el lumen del cristalino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Preparación de retrovirus recombinantes de alto título

  1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para producir fragmentos de ADN de proteínas diana
    NOTA: Esta sección tiene como objetivo amplificar la secuencia de ADN correspondiente a la proteína del cristalino diana. Para más detalles, véase 7,8.
    1. Diseñar cebadores para PCR, correspondientes a la proteína de interés, para hacer fragmentos de ADN con su extremo carboxilo en el marco con o sin una secuencia de epítopos FLAG (5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3'), un codón de parada y un sitio de enzima de restricción (es decir, EcoRI) presente dentro de la región polienlazadora de CLa12NCO)) de acuerdo con las especificaciones señaladas en protocolos publicados anteriormente, con secuencias para enzimas de restricción adecuadas1, 7,8,10,11.
    2. Realizar la reacción de PCR10. Combine 100 pmol de sentido y antisentido de los cebadores diseñados con 0,5 μg de ADNc de conexina (como Cx50, Cx43 o combinaciones quiméricas de Cx50*43L), con el tampón de reacción de PCR de su elección. Realice 30 ciclos cada uno de 94 °C durante 1 min, 58 °C durante 1 min y 72 °C durante 1 min, seguidos de una extensión final durante 10 min a 72 °C.
    3. Aísle y purifique los productos de PCR con un kit de purificación en gel.
    4. Digiera los productos de PCR purificados utilizando las enzimas de restricción de su elección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  2. Clonación de insertos de ADN en plásmido adaptador
    NOTA: La inserción de fragmentos de ADN en un vector adaptador elimina la necesidad de células/virus auxiliares para aumentar la estabilidad del vector RCAS(A)14. Para más detalles, véase 7,8.
    1. El ADN subclonado se fragmenta en un plásmido adaptador, Cla12NCO mediante una reacción de ligadura de extremo pegajoso. Mezclar los fragmentos de PCR con enzimas de restricción y Cla12NCO en una proporción de 2-5:1. Realizar la ligadura y la transformación del ADN utilizando células competentes.
    2. Aísle el ADN con un kit de aislamiento de ADN.
    3. Secuenciar el ADN para garantizar la precisión.
  3. Clonación en el vector viral RCAS(A)
    NOTA: Los fragmentos de ADN se insertan en un vehículo (retrovirus RCAS(A)) para la transducción estable de un gen en las células del embrión de pollo en desarrollo14,15. Para obtener más detalles, consulte 7,8,15.
    1. Digiera el fragmento de ADN Cla12NCO del vector que contiene interés con ClaI (1 unidad por 1 μg de ADN) y aísle los fragmentos.
    2. Subclonar los fragmentos de ADN en un plásmido RCAS(A) linealizado por ClaI. Utilice la enzima de restricción SalI para distinguir el sitio ClaI en el plásmido RCAS(A).
    3. Confirmar la correcta orientación de los fragmentos insertados en las construcciones mediante digestión con enzimas de restricción ClaI y SalI.
    4. Aísle el ADN con un kit de aislamiento de ADN.
    5. Determina la concentración de ADN.
  4. Transfección de células de fibroblastos embrionarios de pollo (CEF) y recolección de RCAS(A)
    NOTA: Las células de empaquetamiento de virus, CEF, se utilizan para obtener/cosechar medios de cultivo celular que contienen partículas virales15,16. Para obtener más detalles, consulte 7,8,15.
    1. Transfecte células CEF con construcciones de ADN retroviral recombinante utilizando el agente de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Realizar Western blot de las células transfectadas para examinar su expresión de la proteína de interés.
    3. Cuando las células transfectadas alcancen la confluencia, comience a recolectar el medio sobrenadante, procesándolo/filtrándolo adecuadamente (para eliminar cualquier residuo celular usando un filtro de 0,22 μm) y almacene a -80 °C hasta que esté listo para la concentración.
  5. Concentración y titulación de las cepas virales
    NOTA: Los gránulos y los grandes volúmenes de medios derivados de las células que contienen las partículas virales deben filtrarse. Además, se debe realizar un ensayo de título viral para establecer la fuerza del virus contra las células huésped. Para obtener más detalles, consulte 6,7,8,15.
    1. Descongelar los medios de cultivo que contienen los viriones.
    2. Centrifugar el medio de cultivo a 72.000 × g durante 2 h a 4 °C.
    3. Decantar el sobrenadante y resuspender el gránulo viral con el medio residual (~50 μL) y almacenar a -80 °C hasta su uso, en cepas virales de ~10 μL.
    4. Para la titulación, utilizando células QT-6 o CEF, transfecte las células con una dilución en serie de las existencias virales.
    5. Después de la confluencia, fije las celdas con formaldehído al 4%.
    6. Inmunotinción para proteínas gag virales o proceso histoquímico para fosfatasa alcalina para obtener el título, definido como UFC (unidades formadoras de colonias) por mililitro (UFC/mL).

figure-protocol-2
Figura 2: Instrumentos y configuración para la microinyección de lentes de pollito . (A) Extractor manual de micropipetas de microelectrodos verticales P-30. (1) recuadro que muestra una micropipeta de vidrio que se está tirando. (B) (2) Incubadora de huevos. Incubar el huevo de gallina durante ~65-68 h en una incubadora a 37 °C hasta alcanzar el estadio 18 (con un lumen central sellado y vacío) para la inyección de retrovirus. (C) Configuración de microinyección. (3) equipo de iluminación, (4) pico-inyector, (5) microscopio de disección, (6) micromanipulador Drummond, (7) computadora/cámara para visualización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Microinyección de lente de pollito

  1. Preparación de insumos
    1. Preparación de micropipetas de vidrio para microinyección17
      NOTA: Los capilares de vidrio se utilizan para fabricar micropipetas de vidrio con una punta y un diámetro exterior (OD) de ~11 μm para microinyección. La configuración se muestra en la Figura 2A.
      1. Fije el capilar de vidrio de borosilicato a los clips acolchados de goma en el extractor de micropipetas vertical manual.
      2. Ajuste la temperatura de calor (HEAT 1) a 950 °C y realice la extracción previa para obtener un capilar de vidrio más delgado y blando.
      3. Ajuste la temperatura de calor (HEAT 2) a 790 °C y realice un tirón secundario para producir las micropipetas finales.
      4. Con una amoladora de micropipetas, afile la abertura de la punta a un diámetro exterior de ~11 μm.
      5. Para futuros experimentos, mantenga las micropipetas de vidrio en una almohadilla de sujeción de esponja dentro de un frasco de vidrio.
    2. Incubación de óvulos fecundados hasta la etapa de desarrollo 18
      NOTA: Durante el desarrollo del cristalino, a ~65-68 h de desarrollo embrionario, el cristalino se separa del ectodermo y forma una vesícula sellada con una luz central; La inyección en el lumen vacío del cristalino prepara la expresión restringida a las células proliferativasdel cristalino 7,8,18.
      1. Incubar los huevos de gallina fertilizados durante ~65-68 h en una incubadora mecedora humidificada a 37 °C (Figura 2B).
  2. Apertura del huevo de gallina
    NOTA: Este paso describe la identificación y exposición del embrión para la microinyección. Para más detalles, véase 7,8.
    1. Limpie bien el área de trabajo con etanol al 70%.
    2. Retire los huevos de la incubadora, rocíelos abundantemente con etanol al 70% y déjelos secar al aire.
    3. Coloque el huevo, con el extremo más grande del huevo hacia arriba, en un soporte para huevos.
    4. Con un par de pinzas de dientes afilados, haga un agujero de ~ 2 cm de diámetro en el extremo más grande del huevo golpeando con cuidado la cáscara del huevo y quitando fragmentos de la cáscara del huevo (Figura 3A).
    5. Con un microscopio de disección, localice el embrión.
    6. Una vez localizados el embrión y el cristalino del pollito, utilice el microscopio de disección y unas pinzas y tijeras de disección finas para cortar la membrana amniónica que cubre inmediatamente la parte superior del embrión (Figura 3B).
      NOTA: No corte demasiado (solo lo suficiente para exponer el embrión ~ 0,5 cm x 0,5 cm), o de lo contrario los embriones podrían hundirse en la masa vitelita; También evite tocar los vasos sanguíneos, si es posible.
    7. Cubra la abertura del huevo con una placa de Petri de 60 mm en preparación para los siguientes pasos.
  3. Microinyección de material viral concentrado
    NOTA: Las partículas virales que contienen fragmentos de ADN de proteínas diana para su transducción se insertan en las células dentro de la luz del cristalino. La configuración se muestra en la Figura 2C. Para más detalles, ver 6,7,8.
    1. Descongele las existencias de acciones virales en hielo.
    2. Para visualizar el stock viral durante la inyección, diluya 1 μL de 10x Fast green en un vial de stock viral que contenga 10 μL.
    3. Para asegurarse de que no haya grandes trozos de material no disuelto que puedan obstruir la micropipeta de vidrio, centrifugue las soluciones durante 10 s a 10.000 × g a 4 °C para granular "trozos grandes" y transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos, todo ello manteniendo las soluciones en hielo.
    4. En una placa de cultivo de 35 mm x 10 mm, coloque un parafilm de laboratorio estirado y agregue 1 μL de solución salina estéril (PBS) sobre la película (no esterilizada, con el lado cubierto considerado "limpio").
    5. Conecte una micropipeta de vidrio preparada a un picoinyector automático.
    6. Presione el modo de llenado para llenar la solución salina estéril (PBS) en una micropipeta de vidrio y, a continuación, use el modo de inyección para probar el 1 μL de líquido asignado.
    7. Coloque un segundo parafilm de laboratorio estirado en la superficie de una nueva placa de cultivo celular de 35 mm x 10 mm y agregue 1 μL de material viral teñido de verde rápido sobre la película.
    8. Baje la punta de la micropipeta en el material viral y presione el modelo de llenado para llenar la micropipeta de vidrio con ~1 μL de material viral.
      NOTA: Para evitar que se seque, coloque la punta de la micropipeta llena en solución salina estéril (PBS) cada vez que haya una pausa en el procedimiento.
    9. Baje la micropipeta de vidrio llena, conectada a un inyector automático, en la región objetivo de la luz de la lente del embrión con la ayuda de un microscopio de disección.
    10. Ajuste la fuente de luz para garantizar una visualización clara del contorno de la vesícula del cristalino.
      NOTA: El lumen del cristalino derecho (hacia arriba) se utiliza normalmente para la inyección y el izquierdo (hacia abajo) se mantiene intacto como control contralateral.
    11. Una vez que esté seguro de que la colocación de la micropipeta está dentro de la ubicación correcta dentro de la luz de la lente, inyecte 5-40 nL del material viral (Figura 3C).
      NOTA: La práctica es muy necesaria para una colocación óptima de la inyección.
    12. Espere ~45 s y luego retire suavemente la micropipeta de vidrio.
    13. Compruebe si la microinyección se ha realizado correctamente en el lumen de la lente utilizando el microscopio de disección examinando el tinte verde rápido que debe permanecer en el lumen vacío de la lente sin fugas.
    14. Después del procedimiento de inyección, selle la abertura de la cáscara de huevo con cinta adhesiva.
    15. Devolver el embrión a la incubadora humidificada a 37 °C, sin ningún movimiento de rotación, hasta que se haya alcanzado la edad embrionaria deseada para la disección del cristalino.

figure-protocol-3
Figura 3: Preparación y esquema de la microinyección de pollitos . (A) Apertura de un huevo de gallina. (B) Corte de la membrana amniótica. (C) Esquema de microinyección de lúmenes de lentes de pollo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Resultados

Tras la determinación de una o varias proteínas diana específicas y la identificación de las secuencias genéticas asociadas, el enfoque experimental general consiste en la clonación de las secuencias génicas en un vector RCAS(A) retroviral mediante la clonación inicial en un vector adaptador, seguido de un vector viral. En segundo lugar, las partículas virales de alto título se preparan utilizando células de envasado para cosechar y concentrar los viriones. Estos dos primeros pasos principales han sido ampliamente descri...

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Discusión

Este modelo experimental ofrece la oportunidad de expresar la(s) proteína(s) de interés en el cristalino intacto, lo que lleva al estudio de la relevancia funcional de estas proteínas en la estructura y función del cristalino. El modelo de microinyección de pollitos embrionarios se basa parcialmente en el trabajo de Fekete et. al.6 y fue desarrollado por Jiang et. al.8 y se ha utilizado como medio para insertar plásmidos virales y agentes como agonistas, ARN interferente pe...

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Divulgaciones

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH): RO1 EY012085 (a J.X.J) y F32DK134051 (a F.M.A.), y la subvención de la Fundación Welch: AQ-1507 (a J.X.J.). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. Las figuras fueron creadas parcialmente con Biorender.com.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,22 y micro; m FiltroCorning431118Para eliminar los residuos celulares de los medios
de 35 mm x 10 mm Plato de cultivoFisherScientific50-202-030Para usar durante la microinyección
CentrífugaFisherbrand13-100-676Solución de centrifugado
ConstructsGENEWIZ-Parala generación de constructos
Microscopio de disecciónAmScopeSM-4TZ-144AVisualización de lentes para
cebadores de PCR de ADNTecnologías de ADNintegradas-Generaciónde cebadores:

Cx50 delecionado por bucle intracelular (IL) (residuos 1– 97 y 149– 400) así como el vector Cla12NCO se obtuvieron con el siguiente par de cebadores: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisentido, CACCGCATGCCCAAAGTACAC

ILs de Cx43 (residuos 98– 150) y Cx46 (residuos 98– 166) fueron  obtenido con los siguientes pares de cebadores: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisentido, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sentido, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectivamente

La plantilla de constructo Cla12NCO-Cx43 se obtuvo con el siguiente par de cebadores: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisentido, GAACAC GTGCGCCAGGTAC

ILs de Cx50 (residuos 98– 148) o Cx46 (residuos 98– 166) se clonaron utilizando las construcciones Cla12NCO-Cx50 y Cla12NCO-Cx46 como plantillas con el siguiente par de cebadores: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisentido, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sentido, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisentido, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectivamente
Drummond Nanoject II Inyector Automático de NanolitrosDrummond Scientific3-000-204Pipeta de Microinyección Luces
Cuello de Cisne Dobles Iluminador de MicroscopioAmScopeLED-50WYIluminación para visualización
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)Invitrogenpara
cultivo celular Soporte de huevos--Anillos de espuma de poliestireno hechos en casa con 2 pulgadas de diámetro y media pulgada
de altura Incubadora de huevosGQF Manufacturing Company Inc.1502Para la incubación de huevos fertilizados
Fast GreenFisher scientificF99-10Para la visualización de la inyección de stock viral
Huevos de gallina leghorn blancos fertilizadosTexas A& M UniversityN/AModelo animal de elección para la microinyección (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Suero fetal bovino (FBS)Hyclone LaboratoriesPara cultivo celular
IgG anti-ratón conjugada con fluoresceínaJackson ImmunoResearch115-095-003Para anti-FLAG  Pinza 1:500
FisherScientific22-327379Para mover cosas y aislamiento
Capilares de vidrioSutter InstrumentsB100-75-10Micropipeta de vidrio para microinyección (diámetro exterior 1,0 mm, diámetro interior 0,75 mm, 10 cm de longitud)
LipofectamineInvitrogenL3000001Para la transfección
Extractor de micropipetas vertical manualSutter InstrumentsP-30Para obtener micropipetas de vidrio del tamaño correcto
Tubos demicrocentrífugaFisherScientific02-682-004Solución de disolución
MicroscopioKeyenceBZ-X710Para tinción de imágenes
ParafilmFisherScientific03-448-254 Colocación desolución
Penicilina/EstreptomicinaInvitrogenPara cultivo celular
Pico-InjectorHarvard ApparatusPLI-100Para suministrar pequeños volúmenes de líquido de forma precisa a través de micropipetas mediante la aplicación de una presión regulada durante un período de tiempo establecido digitalmente
conejo anti-pollito AQP0Autogenerado-JiangJX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Clonación molecular y caracterización funcional de la conexina 45.6 de la fibra del cristalino de pollo. Célula Mol Biol. marzo de 1994; 5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.
anticuerpo anti-FLAG de conejoRockland Immunichemicals600-401-383Para la tinción FLAG
IgG anti-conejo conjugada con rodamina;Jackson ImmunoResearch111-295-003Para anti-AQP0  1:500
Almohadilla de sujeción de esponjaSutter InstrumentsBX10Para el almacenamiento de micropipeta de vidrio
por microinyección de

Referencias

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