Artículo de método

Comparación de dos métodos representativos para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas en células estromales mesenquimales

DOI:

10.3791/65729

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20 de octubre de 2023

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1National Clinical Research Center for Child Health, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 3Zhejiang University School of Medicine, 4Liangzhu Laboratory, Zhejiang University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe y compara dos métodos representativos para diferenciar las hiPSC en células estromales mesenquimales (MSC). El método monocapa se caracteriza por un menor costo, una operación más simple y una diferenciación osteogénica más fácil. El método de los cuerpos embrioides (EB) se caracteriza por un menor consumo de tiempo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células estromales mesenquimales (MSC) son células madre pluripotentes adultas que se han utilizado ampliamente en medicina regenerativa. Dado que las MSC derivadas de tejidos somáticos están restringidas por la donación limitada, las variaciones de calidad y la bioseguridad, en los últimos 10 años se ha visto un gran aumento en los esfuerzos para generar MSC a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC). Los esfuerzos pasados y recientes en la diferenciación de las hiPSC en MSC se han centrado en dos metodologías de cultivo: (1) la formación de cuerpos embrioides (EB) y (2) el uso del cultivo monocapa. Este protocolo describe estos dos métodos representativos para derivar MSC a partir de hiPSC. Cada método presenta sus ventajas y desventajas, incluyendo el tiempo, el costo, la capacidad de proliferación celular, la expresión de marcadores MSC y su capacidad de diferenciación in vitro. Este protocolo demuestra que ambos métodos pueden derivar MSC maduras y funcionales a partir de hiPSC. El método monocapa se caracteriza por un menor costo, una operación más simple y una diferenciación osteogénica más fácil, mientras que el método EB se caracteriza por un menor consumo de tiempo.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células estromales mesenquimales (MSC) son células madre pluripotentes adultas derivadas delmesodermo 1. Las MSC están presentes en casi todos los tejidos conectivos2. Desde que las MSC fueron descubiertas por primera vez en la década de 1970 y aisladas con éxito de la médula ósea en 1987 por Friedenstein et al.3,4,5, se ha utilizado una variedad de tejidos somáticos humanos (incluidos fetales y adultos) para aislar MSC como hueso, cartílago, tendón, músculo, tejido adiposo y estroma de soporte hematopoyético 1,2,6,7. Las MSC demuestran una alta capacidad proliferativa y plasticidad para diferenciarse en muchos linajes de células somáticas y podrían migrar a tejidos lesionados e inflamados 2,8,9. Estas propiedades hacen de las MSC un candidato potencial para la medicina regenerativa10. Sin embargo, las MSC derivadas de tejido somático (st-MSC) están restringidas por la donación limitada, la capacidad proliferativa celular limitada, las variaciones de calidad y la preocupación por la bioseguridad para la posible transmisión de patógenos, si los hubiera, de los donantes11,12.

Las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) se derivan de la reprogramación de células adultas con factores de transcripción (Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc), que tienen funciones similares a las de las células madre embrionarias13,14. Pueden autorrenovarse y poseer el potencial de diferenciarse en cualquier tipo de células somáticas, incluidas las MSC. En comparación con las st-MSC, las iPSC-MSC tienen la ventaja de un suministro ilimitado, menor costo, mayor pureza, conveniencia en el control de calidad, fácil producción a escala y modificación genética 15,16,17.

Debido a estas ventajas de las iPSC-MSC, se han reportado una variedad de métodos que impulsan las MSC a partir de iPSC. Estos métodos de diferenciación se han centrado en dos metodologías de cultivo: (1) la formación de cuerpos embrioides (EBs) y (2) el uso de cultivos monocapa 11,18,19,20. En este trabajo se caracterizó un enfoque representativo para cada una de las dos metodologías. Además, se accedió a comparaciones entre dos enfoques representativos basados en el tiempo, el costo, la capacidad proliferativa, la expresión de biomarcadores de MSC y la capacidad de diferenciación in vitro.

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Protocolo

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1. Mantenimiento de hiPSCs

  1. Descongelación de hiPSC
    1. Saque las células del nitrógeno líquido y descongele rápidamente las células en un baño de agua a 37 °C. Transfiera las células de descongelación a un tubo de 15 mL preparado con 3 mL de medio de mantenimiento iPSC (Tabla de Materiales). Mezcle suavemente el medio.
    2. Centrifugar a 300 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente las células en 1 ml de medio de mantenimiento iPSC con 10 μM Y-27632 (pipetear las células hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces).
    3. Transfiera la suspensión celular a una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos recubierta con gel de matriz extracelular reducida en factor de crecimiento (TFG) (1:100) y 2 ml de medio de mantenimiento iPSC con 10 μM Y-27632 agregados de antemano (aproximadamente 4 x 104 células/cm2).
    4. Cultivar las células durante 5-6 días (80%-90% de confluencia) a 37 °C, 5% de CO2 con cambio de medios de mantenimiento iPSC todos los días.
  2. Paso de hiPSC
    1. Retire el medio de mantenimiento iPSC de la placa de 6 pocillos. Lave los hiPSC una vez con DPBS.
    2. Añadir 700-800 μL de solución de EDTA 0,48 mM e incubar durante 1 min a temperatura ambiente (RT), luego retirar la solución de digestión. Continuar incubando a 37 °C de temperatura durante 3-5 min.
    3. Cuando las células se digieren en láminas (no digiera las células en células individuales), agregue 1 ml de medio de mantenimiento iPSC con 10 μM Y-27632 para finalizar la digestión. Pipetea con cuidado las células hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces.
    4. Transfiera la suspensión celular a una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos recubierta con gel de matriz extracelular reducida en factor de crecimiento (TFG) (1:100) y 2 ml de medio de mantenimiento iPSC con 10 μM Y-27632 agregados de antemano.
      NOTA: La relación de paso oscila entre 1:6 y 1:20 (aproximadamente 4 x 104 células/cm2), y el tamaño medio de agregación es de aproximadamente 50-200 μm.
    5. Cultivar las células hasta una confluencia del 80%-90% (5-6 días) a 37 °C, 5% de CO2 con cambio de medios de mantenimiento iPSC todos los días.

2. Diferenciación de las MSC de las hiPSC a través de la formación de EB

NOTA: El método se deriva de la literatura previa 21,22,23,24. En la Figura 1 se ilustra una descripción general del método. Las características del método se resumen en la Tabla 1.

  1. Preparación del medio
    1. Prepare el medio de diferenciación de MSC suplementando α-MEM con 1% (v/v) de GlutaMAX, 10% (v/v) de FBS, 10 ng/mL de FGF2 y 5 ng/mL de TGFβ.
    2. Prepare el medio de mantenimiento MSC complementando α-MEM con 1% (v/v) de GlutMAX, 10% (v/v) de FBS y 1 ng/mL de FGF2.
  2. Preparación de hiPSCs
    1. Cultivo de líneas de hiPSCs (paso al menos 2-3 veces después de la descongelación) en medio de mantenimiento iPSC en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos recubierta con gel de matriz extracelular reducida en factor de crecimiento (TFG) (1:100) a 37 °C, 5% de CO2 hasta 80%-90% de confluencia.
  3. Día 0: Formación EB
    1. Retire el medio de mantenimiento iPSC de la placa de 6 pocillos. Lave los hiPSC una vez con DPBS.
    2. Añadir 700-800 μL de solución de EDTA 0,48 mM e incubar durante 1 min a RT, luego retirar la solución de digestión. Continuar incubando a 37 °C de temperatura durante 3-5 min.
    3. Cuando las células se digieren en láminas (no digiera las células en células individuales), agregue 2 ml de medio de mantenimiento de iPSC (que contiene 10 μM de inhibidor de roca y gel de matriz extracelular 1:100 GFR) para finalizar la digestión.
    4. Transfiera las celdas a una placa de fijación baja de 6 pocillos. Siembre las células en una proporción de 2 pocillos de placa de cultivo de tejidos por 1 pocillo de placa de fijación baja. Incubar las células en un agitador (60 rpm/min) a 37 °C, 5% CO2 durante 24 h para formar EBs esféricas.
  4. Día 1-Día 7: Diferenciación EB
    1. Transfiera los EB al tubo de centrífuga con una pipeta Pasteur (sin destruir los EB) y deje que los EB se sedimenten naturalmente durante 5-10 minutos en RT. A continuación, retira el sobrenadante.
    2. Transfiera los EB a una placa de fijación baja de 6 pocillos con 2 ml de medio de diferenciación MSC. Cultivar los EB en el agitador a 37 °C, 5% CO2 durante 7 días con cambio medio una vez.
  5. Día 8-Día 17: Inoculación de EB
    1. Transfiera los EB al tubo de centrífuga con una pipeta Pasteur (sin destruir los EB) y deje que los EB se sedimenten naturalmente durante 5-10 min. A continuación, retira el sobrenadante.
    2. Transfiera los EB a una placa de 6 pocillos recubierta de gel de matriz extracelular GFR con 2 mL de medio de mantenimiento MSC. Cultivo hasta un 90% de confluencia (~10 días) con cambio regular de medio después de la adhesión celular.
  6. Día 18-Día 27: Maduración y expansión de las MSC
    1. Tratar el cultivo derivado de EB con una solución de disociación a 37 °C durante 5-10 min (el tiempo de digestión varía debido a la presencia de diferentes tipos de células).
    2. Cuando parte de las células se digieren en células individuales, agregue 2 ml del medio de mantenimiento MSC para terminar la digestión y transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga. Lave las células restantes no digeridas una vez con DPBS y digiera nuevamente. Repita varias veces hasta que todas las células se digieran en células individuales. Centrifugar la suspensión celular a 250 x g durante 5 min, luego retire el sobrenadante.
    3. Siembre las células en una placa de cultivo recubierta de gelatina (aproximadamente 2 x 105 células/cm2). Cultivo hasta el 90% de confluencia en el medio de mantenimiento MSC con cambio regular del medio. Designe esta generación de celdas como pasaje 0 (P0) en este punto.
    4. Para que las MSC sean puras y maduras, continúe pasando las células dos veces en una proporción de división de 1:3 en aproximadamente 6 días. La mayoría de las células presentan una morfología similar a la de un fibroblasto (en forma de huso).

3. Diferenciación de las MSC de las hiPSC mediante cultivo monocapa

NOTA: El método se deriva de la literatura previa 25,26,27,28. En la Figura 1 se ilustra una descripción general de este método. Las características del método se resumen en la Tabla 1.

  1. Preparación del medio
    1. Prepare el medio de mantenimiento MSC suplementando α-MEM con 1% (v/v) de GlutMAX, 10% (v/v) de FBS y 1 ng/mL de FGF2.
  2. Preparación de hiPSCs
    1. Cultivo de líneas de hiPSCs (paso al menos 2-3 veces después de la descongelación) en el medio de mantenimiento iPSC en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos recubierta con gel de matriz extracelular reducida en factor de crecimiento (TFG) (1:100) a 37 °C, 5% de CO2 hasta 50%-60% de confluencia.
  3. Día 0-Día 13: Diferenciación por cultivos monocapa directos
    1. Retire el medio de mantenimiento iPSC de la placa de 6 pocillos.
    2. Añadir directamente 2 mL del medio de mantenimiento MSC y cultivar durante 14 días a 37 °C, 5% de CO2, con el medio cambiando todos los días.
  4. Día 14-Día 35: Maduración de las MSCs por paso repetido
    1. Tratar los cultivos monocapa con una solución de disociación a 37 °C durante 5-10 min (el tiempo de digestión varía debido a la presencia de diferentes tipos de células).
    2. Cuando las células se digieren en células individuales, agregue 2 ml de medio de mantenimiento MSC para terminar la digestión y transfiera la suspensión celular al tubo de centrífuga. Lave las células restantes no digeridas una vez con DPBS y digiera nuevamente. Repita varias veces hasta que todas las células se digieran en células individuales. Centrifugar la suspensión celular a 250 x g durante 5 min, luego retire el sobrenadante.
    3. Siembre las células en una placa de cultivo recubierta de gelatina (aproximadamente 2 x 105 células/cm2). Cultivo hasta el 90% de confluencia en el medio de mantenimiento MSC con el medio cambia regularmente. Designe esta generación de celdas como pasaje 0 (P0) en este punto.
    4. Para que las MSC sean puras y maduras, continúe pasando las células 6 veces en una proporción de división de 1:3 en aproximadamente 18 días. La mayoría de las células presentan una morfología similar a la de un fibroblasto (en forma de huso).

4. Análisis de antígenos de superficie de MSC impulsoras de hiPSC mediante citometría de flujo

NOTA: Al igual que los antígenos de superficie de las MSC derivadas de la médula ósea, las MSC que impulsan las hiPSC expresan CD105, CD73 y CD90, pero no expresan CD45, CD3429. Además, las hiPSC se pueden utilizar como células de control negativo. En la Figura 2 se muestra el análisis de antígenos de superficie de las MSC y las hiPSC impulsoras de hiPSC mediante citometría de flujo.

  1. Tratar las MSC que impulsan hiPSC con una solución de disociación a 37 °C durante 2-3 min. Tratar las hiPSC con un reactivo de disociación EDTA de 0,48 mM e incubar durante 1 min a RT, luego retirar el reactivo de disociación. Continuar incubando a 37 °C de temperatura durante 3-5 min.
  2. Cuando las células se digieren en células individuales, agregue medio (medio de mantenimiento MSC a las MSC y medio de mantenimiento iPSC a las iPSC) para finalizar la digestión.
  3. Centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 5 min, luego retire el sobrenadante.
  4. Lavar las celdas una vez con DPBS frío, centrifugar a 350 x g durante 5 min y luego retirar el sobrenadante.
  5. Cuente y vuelva a suspender las células en una solución fría de FBS-DPBS al 10% (v/v) a 10 x 106 células/ml y distribuya 100 μl/tubo de suspensión celular (1 x 106 células/tubo) en tubos de centrífuga de 1,5 ml.
  6. Añadir 5 μL de solución bloqueadora del receptor Fc humano a 100 μL de suspensión celular. Incubar durante 5-10 min en RT para realizar un bloqueo inespecífico.
  7. Centrifugar a 350 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante. Lave las celdas dos veces con una solución fría de FBS-DPBS al 2% (v/v).
  8. Resuspender las células en 100 μL de solución fría de FBS-DPBS (v/v) al 2%.
  9. Agregue 5 μL (1 prueba) de anti-CD34-FITC y 5 μL (1 prueba) de anti-CD45-APC a la celda de 100 μL
    Suspensión. Agregue 5 μL (1 prueba) de anti-CD73-APC, 5 μL (1 prueba) de anti-CD90-FITC y 5 μL (1 prueba) de anti-CD105-PE a otro tubo de suspensión celular de 100 μL. Añadir 5 μL de FITC de control de isotipo de IgG1 humana, PE de control de isotipo de IgG1 humana y APC de control de isotipo de IgG1 humana al tercer tubo de suspensión celular de 100 μL. Incubar durante 15-20 minutos en hielo en la oscuridad. Mientras tanto, prepare cuentas de una sola mancha.
  10. Lave las celdas dos veces con una solución fría de FBS-DPBS al 2% (v/v).
  11. Añadir 300 μL de solución fría de FBS-DPBS (v/v) al 2% para resuspender las células, y filtrar a través de un filtro de malla de malla 200.
  12. Analice las muestras mediante citometría de flujo. Analizar la suspensión celular teñida con anticuerpos de control de isotipo y establecer la puerta. A continuación, analice la suspensión celular teñida con anticuerpos diana.

5. Diferenciación osteogénica de las MSC que impulsan hiPSC

NOTA: Las MSC que impulsan hiPSC poseen un potencial de diferenciación osteogénica (Figura 3A, B). A continuación se presenta el protocolo para la diferenciación osteogénica.

  1. Prepare el medio de inducción osteogénico suplementando α-MEM con 10% de FBS, 100 nM de dexametasona, 10 mM de beta-glicerofosfato y 100 μM de ácido ascórbico.
  2. Siembre 1 x 105 MSC en una placa de 48 pocillos recubierta de gelatina y cultive hasta que tenga una confluencia del 60%-70%.
  3. Retire el medio y agregue 0,3 ml de medio de inducción osteogénico. Cultivar las células en un medio de inducción osteogénico durante 14 días a 37 °C, 5% CO2, con cambio de medio cada 3 días.
  4. Retire el medio y lave con DPBS una vez.
  5. Añadir 0,3 mL de PFA al 4% e incubar a RT durante 30 min.
  6. Elimine el PFA. Enjuague las células con 0,3 ml de DPBS durante 10 min a RT y repita 3 veces.
  7. Retire el DPBS, agregue 0,2 ml de solución de tinción con rojo de alizarina e incube durante 30 minutos a RT.
  8. Retire la solución de tinción, enjuague las células con 0,3 ml de DPBS durante 10 min a RT y repita 3 veces.
  9. Observe la tinción de la deposición de calcio bajo un microscopio óptico.

6. Diferenciación adipogénica de las MSC que impulsan hiPSC

NOTA: Las MSC que impulsan hiPSC poseen un potencial de diferenciación adipogénico (Figura 3C, D). A continuación se indica el protocolo para la diferenciación adipogénica.

  1. Prepare un medio de inducción adipogénico suplementando α-MEM con 10% de FBS, 1 μM de dexametasona, 1 μM de IBMX, 10 μg/mL de insulina y 100 μM de indometacina. Prepare un medio de mantenimiento adipogénico suplementando α-MEM con 10% de FBS y 10 μg/mL de insulina.
  2. Siembre 1 x 105 MSC en una placa de 48 pocillos recubierta de gelatina y cultive hasta que la densidad celular alcance el 90%.
  3. Retire el medio y agregue 0,3 ml de medio de inducción adipogénico. Continuar cultivando las células en el medio de inducción adipogénico durante 4 días a 37 °C, 5% CO2.
  4. Retire el medio y agregue 0,3 ml de medio de mantenimiento adipogénico. Continuar cultivando las células en el medio de mantenimiento adipogénico durante 3 días a 37 °C, 5% de CO2.
  5. Repita los pasos 6.3 y 6.4 2-3 veces hasta la diferenciación y maduración de los adipocitos.
  6. Retire el medio y lave con DPBS una vez.
  7. Añadir 0,3 ml de PFA al 4% e incubar a RT durante 10 min. Retire el PFA y enjuague 2 veces con DPBS.
  8. Aplique la tinción Oli Red O según las instrucciones del fabricante y observe las gotas de lípidos bajo un microscopio óptico.

7. Diferenciación condrogénica de las MSC que impulsan hiPSC

NOTA: Las MSC que impulsan hiPSC poseen un potencial de diferenciación condrogénica (Figura 3E, F). A continuación se presenta el protocolo para la diferenciación condrogénica.

  1. Prepare el medio de inducción de condroblastos suplementando α-MEM con 10% de FBS, 100 nM de dexametasona, 1% de insulina-transferrina-selenio (ITS), 10 μM de ácido ascórbico, 1 mM de piruvato de sodio, 50 μg/mL de prolina, 0,02 nM de factor de crecimiento transformante β3 (TGFβ3) y 0,5 μg/mL de proteína morfogenética ósea 6 (BMP-6).
  2. Recoja 2,5 x 105 MSC impulsadoras de hiPSC y centrifugue las células a 150 x g durante 5 min, luego retire el sobrenadante. Suspender las células en 1 mL de α-MEM y luego centrifugar a 150 x g durante 5 min.
  3. Retirar el sobrenadante y suspender las células en 0,5 mL de medio de inducción condrogénico. Centrifugar las células a 150 x g durante 5 min.
  4. Desenroscar directamente la tapa y cultivar durante 21 días con inducción condrogénica, cambiar el medio cada 3 días a 37 °C, 5% CO2. Mueva suavemente el tubo de centrífuga para suspender los gránulos condrogénicos (sin destruir los gránulos condrogénicos) todos los días durante la diferenciación condrogénica.
  5. Retire el sobrenadante y lave con 0,5 ml de PBS dos veces.
  6. Añadir 0,3 mL de PFA al 4% y fijar durante 24 h.
  7. La parafina incrusta los gránulos condrogénicos y luego los secciona (3 μm). Tiñe las secciones con azul de toluidina (1%) durante 30 min.
  8. Observar la matriz de condrocitos extracelulares bajo un microscopio óptico.

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Resultados

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Siguiendo el protocolo (Figura 1A), las hiPSC se diferenciaron en MSC mediante los métodos de formación de EB y cultivo monocapa. Durante la diferenciación, las células mostraron diferentes morfologías representativas (Figura 1B,C).

Como se muestra en la Figura 1B, las colonias de hiPSCs muestran una morfología compacta típica antes de la diferenciación con un borde claro compuesto por cé...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este protocolo, se examinaron dos métodos representativos para diferenciar las hiPSC en MSC 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Ambos métodos fueron capaces de derivar MSCs a partir de hiPS...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estamos muy agradecidos a todos los miembros del Laboratorio Mao y Hu, pasados y presentes, por las interesantes discusiones y las grandes contribuciones al proyecto. Agradecemos al Centro Nacional de Investigación Clínica para la Salud Infantil por el gran apoyo. Este estudio contó con el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (U20A20351 a Jianhua Mao, 82200784 a Lidan Hu), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Zhejiang de China (No. LQ22C070004 a Lidan Hu).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kit de tinción rojo alizarinaBeyotime  BiotecnologíaC0148S
Anti-humano-CD105 (PE)Biolegend323206
Anti-humano-CD34 (FITC)Biolegend343503
Anti-humano-CD45 (APC)Biolegend304011
Anti-humano-CD73( APC)Biolegend344006
Anti-humano-CD90 (FITC)Biolegend328108
Ácido ascórbicoSolarbioA8100
BMP-6NovoproteinC012
Agitador de nivel de dióxido de carbonoCrystalCO-06UC6
Perlas de compensaciónBioLegend424601
CryoStor CS10Tecnología STEMCELL07959
DexametasonaBeyotime  BiotecnologíaST1254
DMEM/F12  medioServicebioG4610
Suero fetal bovinoHAKATAHS-FBS-500
FGF2Stemcell78003.1
GelatinaSigma-AldrichG2500-100G
GlutaMAXGibco35050061
humano IgG1 control de isotipo APCBioLegend403505
control de isotipo de IgG1 humano FITCBioLegend403507
control de isotipo de IgG1 humano PEBioLegend403503
TGF-& beta humano; 1Célula madre78067
Humana TruStain FcX BioLegend422301
IBMXBeyotime  BiotecnologíaST1398
IndometacinaSolarbioSI9020
InsulinaBeyotime  BiotecnologíaP3376
iPSC medio de mantenimientoTecnología STEMCELL85850
ITS Suplemento de mediosBeyotime  BiotecnologíaC0341-10mL
Matrigel, factor de crecimiento reducidoBD Corning354230
Oli Red O kit de tinciónBeyotime  BiotecnologíaC0158S
ProlineSolarbioP0011
Piruvato de sodioThermoFisher11360-070
TGFβ 3NovoproteinCJ44
Kit de tinción azul de toluidinaSolarbioG2543
TrypLE Express Enzyme(1x) Gibco12604013
Placa de 6 pocillos de fijación ultra bajaCostar3471
VerseneGibco15040-66
Y-27632Stemcell72304
α-MEMHycloneSH30265
β-glicerofosfatoSolarbioG8100

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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