Comparación de dos métodos representativos para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas en células estromales mesenquimales

Summary

Este protocolo describe y compara dos métodos representativos para diferenciar las hiPSC en células estromales mesenquimales (MSC). El método monocapa se caracteriza por un menor costo, una operación más simple y una diferenciación osteogénica más fácil. El método de los cuerpos embrioides (EB) se caracteriza por un menor consumo de tiempo.

Abstract

Las células estromales mesenquimales (MSC) son células madre pluripotentes adultas que se han utilizado ampliamente en medicina regenerativa. Dado que las MSC derivadas de tejidos somáticos están restringidas por la donación limitada, las variaciones de calidad y la bioseguridad, en los últimos 10 años se ha visto un gran aumento en los esfuerzos para generar MSC a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC). Los esfuerzos pasados y recientes en la diferenciación de las hiPSC en MSC se han centrado en dos metodologías de cultivo: (1) la formación de cuerpos embrioides (EB) y (2) el uso del cultivo monocapa. Este protocolo describe estos dos métodos representativos para derivar MSC a partir de hiPSC. Cada método presenta sus ventajas y desventajas, incluyendo el tiempo, el costo, la capacidad de proliferación celular, la expresión de marcadores MSC y su capacidad de diferenciación in vitro. Este protocolo demuestra que ambos métodos pueden derivar MSC maduras y funcionales a partir de hiPSC. El método monocapa se caracteriza por un menor costo, una operación más simple y una diferenciación osteogénica más fácil, mientras que el método EB se caracteriza por un menor consumo de tiempo.

Introduction

Las células estromales mesenquimales (MSC) son células madre pluripotentes adultas derivadas del^{mesodermo 1}. Las MSC están presentes en casi todos los tejidos conectivos². Desde que las MSC fueron descubiertas por primera vez en la década de 1970 y aisladas con éxito de la médula ósea en 1987 por Friedenstein et al.3,4,5, se ha utilizado una variedad de tejidos somáticos humanos (incluidos fetales y adultos) para aislar MSC como hueso, cartílago, tendón, músculo, tejido adiposo y estroma de soporte hematopoyético ^1,2,6,7

Protocol

1. Mantenimiento de hiPSCs

1. Descongelación de hiPSC
   1. Saque las células del nitrógeno líquido y descongele rápidamente las células en un baño de agua a 37 °C. Transfiera las células de descongelación a un tubo de 15 mL preparado con 3 mL de medio de mantenimiento iPSC (Tabla de Materiales). Mezcle suavemente el medio.
   2. Centrifugar a 300 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente las células en 1 ml de medio de mantenimiento iPSC con 10 μM Y-27632 (pipetear las células hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces).
   3. Transfiera la suspensión celular a una placa de cultivo....

Results

Siguiendo el protocolo (Figura 1A), las hiPSC se diferenciaron en MSC mediante los métodos de formación de EB y cultivo monocapa. Durante la diferenciación, las células mostraron diferentes morfologías representativas (Figura 1B,C).

Como se muestra en la Figura 1B, las colonias de hiPSCs muestran una morfología compacta típica antes de la diferenciación con un borde claro compuesto por cé.......

Discussion

En este protocolo, se examinaron dos métodos representativos para diferenciar las hiPSC en MSC 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Ambos métodos fueron capaces de derivar MSCs a partir de hiPS.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de tinción rojo alizarina	Beyotime  Biotecnología	C0148S
Anti-humano-CD105 (PE)	Biolegend	323206
Anti-humano-CD34 (FITC)	Biolegend	343503
Anti-humano-CD45 (APC)	Biolegend	304011
Anti-humano-CD73( APC)	Biolegend	344006
Anti-humano-CD90 (FITC)	Biolegend	328108
Ácido ascórbico	Solarbio	A8100
BMP-6	Novoprotein	C012
Agitador de nivel de dióxido de carbono	Crystal	CO-06UC6
Perlas de compensación	BioLegend	424601
CryoStor CS10	Tecnología STEMCELL	07959
Dexametasona	Beyotime  Biotecnología	ST1254
DMEM/F12  medio	Servicebio	G4610
Suero fetal bovino	HAKATA	HS-FBS-500
FGF2	Stemcell	78003.1
Gelatina	Sigma-Aldrich	G2500-100G
GlutaMAX	Gibco	35050061
humano IgG1 control de isotipo APC	BioLegend	403505
control de isotipo de IgG1 humano FITC	BioLegend	403507
control de isotipo de IgG1 humano PE	BioLegend	403503
TGF-& beta humano; 1	Célula madre	78067
Humana TruStain FcX	BioLegend	422301
IBMX	Beyotime  Biotecnología	ST1398
Indometacina	Solarbio	SI9020
Insulina	Beyotime  Biotecnología	P3376
iPSC medio de mantenimiento	Tecnología STEMCELL	85850
ITS Suplemento de medios	Beyotime  Biotecnología	C0341-10mL
Matrigel, factor de crecimiento reducido	BD Corning	354230
Oli Red O kit de tinción	Beyotime  Biotecnología	C0158S
Proline	Solarbio	P0011
Piruvato de sodio	ThermoFisher	11360-070
TGFβ 3	Novoprotein	CJ44
Kit de tinción azul de toluidina	Solarbio	G2543
TrypLE Express Enzyme(1x)	Gibco	12604013
Placa de 6 pocillos de fijación ultra baja	Costar	3471
Versene	Gibco	15040-66
Y-27632	Stemcell	72304
α-MEM	Hyclone	SH30265
β-glicerofosfato	Solarbio	G8100