Artículo de método

Activación de la señalización optogenética en embriones de pez cebra

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DOI:

10.3791/65733

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27 de octubre de 2023

 ,  ,  ,  , 
1Division of Developmental Biology, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH, 2Instrumentation Development and Engineering Application Solutions, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, NIH

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

La manipulación optogenética de las vías de señalización puede ser una estrategia poderosa para investigar cómo se decodifica la señalización en el desarrollo, la regeneración, la homeostasis y la enfermedad. Este protocolo proporciona pautas prácticas para el uso de activadores de señalización de proteínas morfogénicas óseas (BMP) basados en el dominio de detección de luz-oxígeno-voltaje en el embrión temprano de pez cebra.

Resumen

Las vías de señalización orquestan procesos biológicos fundamentales, como el desarrollo, la regeneración, la homeostasis y la enfermedad. Se requieren métodos para manipular experimentalmente la señalización para comprender cómo se interpreta la señalización en estos contextos de amplio alcance. Las herramientas de optogenética molecular pueden proporcionar manipulaciones reversibles y sintonizables de la actividad de la vía de señalización con un alto grado de control espacio-temporal y se han aplicado in vitro, ex vivo e in vivo. Estas herramientas acoplan dominios proteicos que responden a la luz, como el dominio de detección de voltaje de luz-oxígeno homodimerizante de luz azul (LOV), con efectores de señalización para conferir un control experimental dependiente de la luz sobre la señalización. Este protocolo proporciona pautas prácticas para el uso de la proteína morfogenética ósea (BMP) basada en LOV y los activadores de señalización nodal bOpto-BMP y bOpto-Nodal en el embrión temprano de pez cebra ópticamente accesible. Describe dos experimentos de control: un ensayo rápido de fenotipo para determinar las condiciones experimentales apropiadas y un ensayo de inmunofluorescencia para evaluar directamente la señalización. Juntos, estos experimentos de control pueden ayudar a establecer una línea para el uso de herramientas optogenéticas en embriones tempranos de pez cebra. Estas estrategias proporcionan una plataforma poderosa para investigar el papel de la señalización en el desarrollo, la salud y la fisiología.

Introducción

Las vías de señalización permiten que las células respondan a su entorno y coordinen actividades a escala de todo el tejido y el organismo. Las señales cruciales para el desarrollo embrionario incluyen los miembros de la superfamilia TGF-beta, la proteína morfogenética ósea (BMP) y el Nodal 1,2,3. Durante la embriogénesis, las vías reguladas por estas y otras señales modelan el plan corporal mediante el control de la expresión génica y procesos adicionales para garantizar que los diversos tejidos y órganos se desarrollen e interactúen adecuadamente. Las patologías, incluidos los defectos congénitos y el cáncer, pueden ocurrir cuando la señalización o las respuestas a la señalización se alteran 4,5,6,7. A pesar de la rigurosa investigación sobre la señalización, aún queda mucho por descubrir sobre cómo se decodifican los niveles y la dinámica en una variedad de contextos 8,9,10,11, especialmente durante el desarrollo 12,13,14,15,16,17,18,19.

Para comprender cómo se decodifica la señalización, un experimento ideal sería manipular los niveles de señalización, el tiempo y/o la dinámica, con un alto grado de control espacial y temporal, y evaluar los resultados. Por ejemplo, se proponen gradientes de señalización espacial precisos para modelar los tejidos en desarrollo20,21. La alteración de las distribuciones espaciales del gradiente de señalización ayudaría a probar esta hipótesis22. Además, la importancia de la dinámica de señalización en la generación de diversas respuestas celulares es cada vez más clara: la misma vía de señalización puede instruir a las células para que se diferencien o proliferen dependiendo de la frecuencia de señalización, por ejemplo 9,23. Los paradigmas experimentales en los que la dinámica de señalización puede ser fácilmente manipulada serán valiosos para explorar la relación entre la dinámica y las decisiones sobre el destino celular 8,12,13,14,15.

Históricamente, se han utilizado múltiples métodos para manipular la señalización en contextos de desarrollo, lo que ha llevado a descubrimientos fundamentales 1,2,3. La señalización se puede bloquear mediante mutantes de pérdida de función de la vía, expresión de inhibidores ectópicos o fármacos antagonistas. Los métodos para activar la señalización incluyen fármacos agonistas, ligandos recombinantes, expresión ectópica de ligandos o receptores constitutivamente activos y mutantes de pérdida de función inhibidores de vías. Estos métodos se extienden a lo largo de un continuo de control experimental. Por ejemplo, los mutantes y la expresión ectópica pueden caer en el lado del mazo del continuo: con estos enfoques, los cambios dramáticos y sistémicos en la actividad de la vía pueden causar una muerte prematura e impedir investigaciones en etapas posteriores, o con el tiempo pueden dar lugar a efectos pleiotrópicos que son difíciles de desentrañar. Además, a menudo es difícil manipular de forma independiente una característica de señalización a la vez, como el nivel o la duración. Hacia el otro extremo del continuo, algunos métodos ofrecen un control experimental más preciso, como los dispositivos microfluídicos que exponen las muestras a fármacos o proteínas recombinantes con control temporal y, a veces, espacial 18,24,25, o métodos genéticos, incluidos los promotores inducibles por choque térmico y específicos de tejido que pueden ofrecer beneficios similares16,26,27. Sin embargo, estos métodos pueden ser difíciles de ejecutar, pueden no ser reversibles, pueden tener una cinética relativamente lenta o una resolución deficiente, y pueden no estar disponibles en algunos sistemas modelo.

Los enfoques de optogenética molecular son una poderosa adición a este conjunto de herramientas. Estos enfoques utilizan proteínas que responden a diferentes longitudes de onda de luz para manipular procesos biológicos, incluida la señalización 8,12,13,14,15, y se han desarrollado durante décadas para su uso en una variedad de sistemas, desde cultivos celulares hasta animales enteros 12,13,28. En comparación con los enfoques históricos, la optogenética molecular a menudo puede ofrecer un mayor grado de control espacio-temporal sobre los procesos biológicos: el controlador en los sistemas optogenéticos es la luz, y el control de la longitud de onda, la intensidad, la duración y la frecuencia de exposición de la luz es relativamente sencillo. Con sistemas sofisticados como los microscopios confocales y de dos fotones, es posible el control espacial en el rango subcelular 29,30,31. Se han desarrollado y aplicado herramientas para manipular optogenéticamente la señalización en varios sistemas, incluyendo los descritos en Johnson et al.22, Čapek et al.32, Krishnamurthy et al.33 y Huang et al.34. Por ejemplo, aprovechando el control espacial que ofrece la optogenética, esta estrategia se ha utilizado recientemente para modificar un gradiente de señalización en embriones de Drosophila, demostrando que la embriogénesis de la mosca es sorprendentemente robusta a los cambios en este gradiente22. La reversibilidad y la rápida cinética de encendido/apagado de los activadores de señalización optogenética también los han convertido en herramientas atractivas para investigar la decodificación de la dinámica de señalización 8,12,13,14,15,34,35,36.

El embrión temprano de pez cebra es un sistema in vivo muy adecuado para estudios optogenéticos porque está fertilizado externamente, es transparente, amigable con la microscopía y genéticamente tratable. La exposición a la luz es más fácil de administrar a los embriones que se desarrollan fuera de la madre, la luz puede penetrar y acceder a sus tejidos no opacos, los embriones vivos de pez cebra toleran bien la obtención de imágenes (además de ser transparentes) y los métodos genéticos existentes brindan oportunidades directas para experimentos de derribo y sobreexpresión, además del desarrollo de transgénicos útiles37.

Recientemente, se desarrollaron herramientas optogenéticas para activar la señalización de BMP38 y Nodal39 en embriones de pez cebra con exposición a la luz azul (Figura 1). Nos referimos a estas herramientas como bOpto-BMP y bOpto-Nodal (b para activada por luz azul y Opto para optogenética). bOpto-BMP/Nodal se basan en mecanismos similares de activación de la vía. La unión de los ligandos BMP o Nodal a sus respectivos receptores serina-treonina quinasas impulsa las interacciones del dominio de la quinasa receptora que conducen a la fosforilación de los efectores de señalización (Smad1/5/9 para BMP y Smad2/3 para Nodal). A continuación, los efectores de señalización fosforilados se translocan al núcleo y regulan la expresión génica diana3 (Figura 1A, D). Estas interacciones de receptores quinasas se pueden hacer sensibles a la luz mediante el acoplamiento de receptores quinasas a proteínas dimerizantes sensibles a la luz: Con la exposición a la luz, estas proteínas quiméricas deberían dimerizarse, lo que hace que los dominios de los receptores quinasas interactúen y activen la señalización (Figura 1B, C, E, F). Es importante destacar que, a diferencia de los receptores endógenos, bOpto-BMP/Nodal no contienen dominios extracelulares de unión al ligando, lo que garantiza una actividad independiente del ligando (Figura 1C,F). Esta estrategia de activación optogenética se logró primero con el receptor tirosina quinasas40,41,42 y luego se aplicó al receptor serina-treonina quinasas.

bOpto-BMP/Nodal utilizan el dominio de detección de voltaje de luz-oxígeno homodimerizante (LOV) sensible a la luz azul (~450 nm) de la proteína AUREO1 del alga Vaucheria fridiga (VfLOV)43,44. Estas construcciones consisten en un motivo de miristoilación dirigido a la membrana seguido de dominios BMP o quinasa receptor nodal, fusionados con un dominio LOV (Figura 1B, E). La exposición a la luz azul debería causar homodimerización de LOV, lo que resulta en interacciones del dominio de la quinasa receptora que conducen a la fosforilación de Smad respectiva y a la activación de la vía (Figura 1C, F). En el caso de bOpto-BMP, se encontró que una combinación de construcciones con los dominios de la quinasa del receptor tipo I de Acvr1l (también conocido como Alk8) y BMPR1aa (también conocido como Alk3) y el dominio de la quinasa del receptor de tipo II de BMPR2a activan de manera óptima la señalización38 (Addgene #207614, #207615 y #207616). Para bOpto-Nodal, se utiliza una combinación de constructos con el dominio receptor quinasa tipo I de Acvr1ba y el dominio receptor quinasa tipo II de Acvr2ba39.

bOpto-BMP/Nodal se han introducido en embriones tempranos de pez cebra mediante la inyección de ARNm en la etapa de una célula, y se han utilizado para investigar el papel de la duración de la señalización en la interpretación nodal39, para determinar por qué el pez cebra pierde la capacidad de responder al Nodal45 y para examinar cómo los genes diana de BMP responden a diferentes niveles de señalización de BMP38. Es probable que estas herramientas continúen siendo útiles en una amplia gama de investigaciones futuras. Sin embargo, la fuerza de los activadores de señalización optogenética es también su debilidad: las muestras sensibles a la luz deben tratarse con cuidado para evitar la actividad de señalización ectópica inadvertida. La exposición a la luz ambiental o a la luz solar puede activar bOpto-BMP/Nodal.

Este protocolo proporciona sugerencias prácticas para el uso de activadores nodales y BMP basados en LOV codificados por ARNm en embriones tempranos de pez cebra. Comienza detallando una estrategia para construir una caja de luz para controlar la exposición a la luz y la temperatura uniformes (Figura 2, Archivo Suplementario 1, Archivo Suplementario 2, Archivo Suplementario 3, Archivo Suplementario 4, Archivo Suplementario 5, Archivo Suplementario 6, Archivo Suplementario 7, Archivo Suplementario 8). A continuación, se describen dos experimentos de control clave que determinan si un activador de señalización optogenética se comporta como se espera, es decir, activa la actividad de la vía solo cuando se expone a la luz (Figura 3). El primer ensayo de control consiste en examinar los fenotipos un día después de la fecundación en embriones expuestos a la luz y no expuestos (Figura 3A). Los embriones expuestos a la luz inyectados con ARNm, pero no los embriones no expuestos, deben fenocopiar BMP o sobreexpresión ganglionar (Figura 4A,B; Los fenotipos de BMP, en particular, son claramente distinguibles en este momento46). Este ensayo proporciona una lectura rápida de la actividad. En el segundo ensayo de control, para determinar si los fenotipos son causados específicamente por un exceso de señalización BMP o ganglionar y para observar directamente el cambio en los niveles de señalización, se utiliza la tinción de inmunofluorescencia para detectar efectores de señalización fosforilados (pSmad1/5/9 o pSmad2/3, respectivamente) después de una exposición a la luz de 20 minutos alrededor de la etapa tardía de blástula / gastrulación temprana, cuando la actividad de señalización ha sido bien descrita12, 16,17,47,48,49,50 (Figura 3B y Figura 4C). (Tenga en cuenta que, aunque se ha demostrado la activación localizada espacialmente tanto para bOpto-BMP38 como para bOpto-Nodal39, este protocolo solo describe la exposición uniforme a la luz y las estrategias de activación de la señalización). Es aconsejable ejecutar estos experimentos de control antes de aplicar bOpto-BMP/Nodal a preguntas de investigación específicas para determinar las condiciones experimentales locales ideales.

Protocolo

Los protocolos de investigación del pez cebra fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del NICHD de los Institutos Nacionales de Salud (ASP 21-008). Todos los estudios de pez cebra se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Construir una caja de luz

  1. Para controlar la exposición a la luz y la temperatura, construya una caja de luz que utilice un iluminador de microplaca de diodo emisor de luz (LED) como fuente de luz (Figura 2A, Tabla de Materiales, Archivo Suplementario 1, Archivo Suplementario 2). Este iluminador personalizable proporciona un control dinámico y programable en múltiples longitudes de onda.
    NOTA: Hay muchas estrategias posibles para construir una caja de luz, y un enfoque alternativo puede ser más apropiado (véase, por ejemplo, Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar y Khammash 53, y más en https://www.optobase.org/materials/).
  2. Incluya las siguientes características en la caja de luz: control de temperatura (28 °C es ideal para embriones de pez cebra), exclusión de luz no deseada (p. ej., luz ambiental y luz solar), suministro uniforme de luz azul que cubra el área objetivo (p. ej., placa de 6 pocillos) y control sobre la intensidad de la luz y la dinámica de exposición.
    NOTA: bOpto-BMP/Nodal se activan con la luz azul, pero algunas herramientas optogenéticas responden a otras longitudes de onda. Utilice la longitud de onda adecuada para la herramienta optogenética.
  3. Taladre un agujero en la parte superior de una incubadora (Figura 2B) que sea un poco más ancho que la lente de salida LED.
    1. Asegúrese de que no haya componentes eléctricos en la parte superior de la incubadora que se destruyan al perforar (Tabla de materiales). Esto se puede comprobar poniéndose en contacto con el fabricante de la incubadora y preguntando directamente.
    2. Si hay un orificio existente en el panel superior de la incubadora, use un taladro escalonado para aumentar el tamaño del orificio a 1.25 pulgadas. De lo contrario, use una sierra perforadora de 1.25 pulgadas con eje.
    3. Si hay paneles internos que bloquean la fuente de luz, taladre el tamaño de orificio adecuado para asegurarse de que el cono de luz no esté bloqueado (Figura 2A). Los paneles suelen estar hechos de chapa metálica fina, así que utilice brocas de metal a baja velocidad para evitar daños (se recomienda una broca de cobalto).
  4. Construya un soporte LED para asegurar el iluminador de microplaca LED a la parte superior de la incubadora (Figura 2C, Archivo Suplementario 3, Archivo Suplementario 4, Archivo Suplementario 5, Archivo Suplementario 6, Archivo Suplementario 7, Archivo Suplementario 8).
    1. Monte cuatro separadores de cubo M3 en la pieza de soporte vertical con tornillos M3.
    2. Coloque los dos soportes laterales a la izquierda y a la derecha de los separadores del cubo del soporte vertical. Monte otro separador de cubo en el orificio sobrante en los soportes laterales.
    3. Monte la pieza del soporte vertical en el conjunto del iluminador de microplaca LED (Tabla de materiales) con tornillos M6. Coloque la junta de la lente LED sobre la lente del sistema LED.
    4. Monte las piezas ensambladas en el soporte del panel de la incubadora, luego en los separadores M3 en los soportes vertical y lateral. Coloque la junta de la incubadora sobre el orificio perforado en la parte superior de la incubadora.
    5. Coloque el soporte del panel de la incubadora en la parte superior de la junta de la incubadora, asegurándose de que la junta y las aberturas del panel sean concéntricas con el orificio de la incubadora. Monte el panel en la parte superior de la incubadora con los tornillos n.º 8. Asegúrese de que este sello sea hermético a la luz.
  5. Coloque una placa de 6 pocillos en el estante superior de la incubadora. Determine si el haz de luz cubre uniformemente la placa (Figura 2A). Use una hoja de papel para visualizar la cobertura de luz.
  6. Si toda la placa no está cubierta por el haz, aumente la distancia entre el LED y la placa moviendo el estante hacia abajo. Para el sistema descrito aquí, ~ 14 pulgadas entre el LED y el estante es suficiente.
  7. Utilice un medidor de luz para determinar el nivel de irradiancia y la uniformidad espacial (Tabla de materiales).
  8. Para evitar la exposición inadvertida a la luz solar y a la luz de la habitación, utilice burletes para asegurarse de que la puerta de la incubadora sea hermética a la luz (Figura 2A).
  9. Los embriones de pez cebra se desarrollan robustamente a 28 °C54. Utilice un termómetro de tarjeta de memoria para asegurarse de que la caja de luz mantenga una temperatura de 28 °C.

2. Generación de ARNm para inyección

NOTA: pCS2+ es la columna vertebral del vector para las construcciones bOpto-BMP38 y bOpto-Nodal39. Este vector es resistente a la ampicilina. bOpto-BMP se compone de tres constructos (Figura 1B): BMPR1aa-LOV (Addgene # 207614): Dominio quinasa putativo del receptor BMPR1aa tipo I (también conocido como Alk3) fusionado con LOV; Acvr1l-LOV (Addgene # 207615): Dominio quinasa putativo del receptor Acvr1l tipo I (también conocido como Alk8) fusionado con LOV; y BMPR2a-LOV (Addgene # 207616): Dominio quinasa putativo del receptor BMPR2a tipo II y el siguiente dominio C-terminal fusionado con LOV. bOpto-Nodal se compone de dos constructos (Figura 1E): Acvr1ba-LOV: Dominio quinasa putativo del receptor Acvr1ba tipo I (también conocido como Acvr1b) fusionado con LOV; Acvr2ba-LOV: Dominio quinasa putativo del receptor Acvr2ba tipo II (también conocido como Acvr2b) fusionado con LOV.

  1. Para linealizar plásmidos, digiera entre 2-5 μg de ADN plasmídico utilizando la enzima de restricción NotI a 37 °C durante 1-3 h (Tabla de materiales).
    NOTA: También es posible generar ADN linealizado utilizando el plásmido como plantilla de PCR.
  2. Purifique el ADN utilizando un kit de purificación estándar basado en columnas (Tabla de materiales).
  3. Utilice un kit de transcripción in vitro de SP6, como un kit mMessage mMachine, para transcribir el ARN de la plantilla linealizada (Tabla de materiales). Configure dos reacciones de acuerdo con las recomendaciones del fabricante para garantizar un mayor rendimiento.
  4. Purifique el ARN utilizando un kit de limpieza de ARN estándar basado en columnas (Tabla de materiales). También es posible purificar a través de la precipitación.

3. Inyección de ARNm

  1. Al menos 1 día antes de las inyecciones, prepare platos de inyección y placas de 6 pocillos recubiertas de agarosa.
    1. Preparar 200 mL de agarosa al 1% en medio embrionario de pez cebra y calentar en el microondas hasta que la agarosa se haya disuelto por completo. Cualquier medio estándar para embriones de pez cebra debe ser aceptable; sin embargo, excluya el azul de metileno del medio embrionario, ya que puede afectar a las imágenes posteriores en otras aplicaciones.
    2. Vierta con cuidado la agarosa fundida en placas de Petri de plástico de 100 mm x 15 mm. Llena los platos hasta la mitad.
    3. Enjuague un molde de plato de inyección con medio embrionario y colóquelo suavemente sobre la agarosa fundida, asegurándose de que no queden burbujas atrapadas entre el molde y la agarosa. Use cinta adhesiva para hacer una lengüeta en la parte posterior del molde para facilitar la colocación y recuperación.
    4. El moho debe flotar en la agarosa fundida. Si el molde se hunde, retírelo con cuidado de la agarosa fundida y repita el paso 3.1.3.
    5. Después de que la agarosa se haya solidificado, use la lengüeta para quitar suavemente el moho. Esto se puede acelerar colocando el plato a 4 °C.
    6. Haga placas de 6 pocillos recubiertas de agarosa si trabaja con embriones decorionados para experimentos de inmunofluorescencia.
    7. Utilice una pipeta de plástico desechable de 10 ml para transferir suficiente agarosa fundida para cubrir el fondo de cada pocillo de una placa de 6 pocillos.
    8. Almacenar las placas de inyección y las placas de 6 pocillos a 4 °C. Pueden usarse inmediatamente o almacenarse hasta que la agarosa se seque o se contamine (generalmente 2-3 semanas).
    9. Prepare puntas de pipeta de vidrio flameado si trabaja con embriones decorionados para experimentos de inmunofluorescencia.
    10. Inserte el extremo de una pipeta de vidrio en la llama de un mechero Bunsen y gírelo continuamente hasta que los bordes estén lisos. Los embriones decorionados deben caber cómodamente a través del extremo de la pipeta. No permita que la abertura se encoja por debajo del diámetro de un embrión.
    11. Compre o tire de agujas de microinyección (Tabla de materiales). Es recomendable tener agujas adicionales disponibles el día de las inyecciones en caso de que sea necesario un reemplazo.
  2. El día antes de las inyecciones, configure los criaderos de pez cebra de acuerdo con los procedimientos operativos estándar (SOP) del instituto. Mantenga a los machos y las hembras separados.
    1. Encienda el regulador de temperatura de la caja de luz para mantener 28 °C. Para asegurarse de que la temperatura de la caja de luz se mantenga a 28 °C, controle la temperatura con un termómetro de tarjeta de memoria (Tabla de materiales).
    2. Prepare la(s) mezcla(s) de inyección de ARNm. Inyecte cantidades equimolares de cada constructo. Es necesario determinar empíricamente qué cantidad inyectar.
    3. Los tamaños de transcripción de bOpto-BMP son los siguientes:
      Acvr1l-LOV = 2007 nucleótidos (nt)
      BMPR1aa-LOV = 1983 nt
      BMPR2a-LOV = 3409 nt
    4. Para inyectar cantidades equimolares, inyecte 1,01 veces más de la construcción Acvr1l que de BMPR1aa; inyectar 1,72 veces más de la construcción BMPR2a que BMPR1aa.
    5. Los tamaños de transcripción optonodal son los siguientes:
      Acvr1ba-LOV y Acvr2ba-LOV son ambos de 1962.
    6. Para inyectar cantidades equimolares, inyecte la misma cantidad de cada construcción.
    7. Prepare mezclas de inyección equimolar, combinando todos los ARNm dirigidos a una vía en una mezcla de inyección. Incluya el trazador de inyección de rojo de fenol si lo desea. Para los datos mostrados en la Figura 4, se utilizaron 15 pg de cada constructo bopto-nodal (Acvr1ba-LOV y Acvr2ba-LOV), y para bOpto-BMP se utilizaron 7,8 pg de Acvr1l-LOV y BMPR1aa-LOV, y 13,4 pg de BMPR2a-LOV.
    8. Almacenar las mezclas de inyección a -20 °C. Una vez que se haya determinado la concentración óptima de la mezcla de inyección, hacer alícuotas de 5-10 μL y almacenar a -20 °C o -80 °C.
  3. Día de la inyección
    1. Si realiza un ensayo de fenotipado (Figura 3A), inyecte a través del corion directamente en el centro de la célula en la etapa de una célula de acuerdo con el SOP de su laboratorio. El corion protege a los embriones de los factores estresantes ambientales y mantiene contenidos los embriones lisados. Esto es útil durante la puntuación para una cuantificación precisa de los embriones lisados (Figura 4A, B).
    2. Si se realiza un ensayo de inmunofluorescencia (Figura 3B), los embriones eventualmente deberán ser decorionados para obtener imágenes (Figura 4C). Por lo tanto, inyectar directamente en el centro de la célula de los embriones decorionados en la etapa de una célula (ver Rogers et al.55 para el protocolo de descorionación). Alternativamente, los embriones se pueden descorionar manualmente después de la fijación, pero esto es más engorroso que decorionar con pronasa.
    3. Utilice pipetas de vidrio flameado para manipular embriones decorionados (paso 3.1.10). Tenga cuidado de no exponer los embriones decorionados al aire o al plástico, lo que hará que los embriones se lisen. Manipule los embriones decorionados con cuidado.
    4. Prepare un plato adicional de embriones no inyectados como sustituto para evaluar la progresión de la etapa (ver paso 4.3.5). Asegúrese de que los embriones sustitutos sean del mismo conjunto de embriones experimentales, de modo que todos los embriones hayan sido fertilizados al mismo tiempo de los mismos padres. Esto es útil para el ensayo de inmunofluorescencia en el que el estadio es relevante, pero no es necesario para el ensayo de fenotipado.
    5. Utilice las siguientes condiciones para los ensayos de fenotipado e inmunofluorescencia: 1) no inyectado, no expuesto, 2) no inyectado, expuesto a la luz, 3) inyectado, no expuesto, 4) inyectado, expuesto a la luz. Seleccione al menos 30 embriones por condición. Para una salud embrionaria óptima, no incube más de 30 embriones por pocillo en una placa de 6 pocillos.
    6. Después de la inyección, transferir los embriones a placas de Petri marcadas o placas de 6 pocillos recubiertas de agarosa (para embriones decorionados) e incubar a 28 °C. Los embriones aún no son sensibles a la luz. Tratar los embriones inyectados como si fueran sensibles a la luz después de 1,5 horas después de la fertilización (hpf).

4. Experimento de exposición a la luz

NOTA: La exposición a una luz de ~450 nm con una irradiancia de 45 W/m2 activa de forma robusta bOpto-BMP/Nodal sin fototoxicidad obvia (para obtener información sobre el fotómetro, consulte la Tabla de materiales). El nivel de señalización activada optogenéticamente se puede ajustar cambiando los valores de irradiancia38. Sin embargo, será necesario evaluar la fototoxicidad a irradiancias más altas.

  1. Paso sensible al tiempo. En la etapa de 4 a 16 células, alrededor de 1,5 hpf, se extraen los embriones no fertilizados y no sanos. Redistribuir si es necesario para asegurar el mismo número de embriones en cada pocillo (no más de 30).
    NOTA: Es importante realizar este paso alrededor de la etapa de 4 a 16 células porque los embriones se volverán sensibles a la luz a medida que el ARNm inyectado se traduzca en proteína. No hemos observado evidencia de que los embriones sean significativamente sensibles a la luz antes de 1,5 hpf. Para minimizar la fotoactivación inadvertida si se evalúan embriones después de 1,5 hpf, use luces rojas o cubra las fuentes de luz, incluidas las etapas del microscopio, con papel de filtro de gel rojo que bloquea las longitudes de onda azules que dimerizan el LOV (Tabla de materiales).
    1. Evalúe los embriones de manera consistente para garantizar distribuciones imparciales entre las condiciones y los experimentos.
  2. Para el ensayo de fenotipado, utilice el siguiente protocolo de exposición a la luz de 1 día a partir de 1,5 hpf (Figura 3A).
    1. Envuelva la placa de control no expuesta en papel de aluminio. Esta placa debe incluir tanto embriones inyectados como no inyectados. Asegúrese de que el plato esté completamente cubierto y tenga cuidado de no introducir rasgaduras en el papel de aluminio. Coloque esta placa en el estante inferior de la caja de luz a 28 °C (Figura 2A).
    2. Coloque la placa expuesta en el estante superior de la caja de luz a 28 °C (Figura 2A). Asegúrese de que la tapa esté en el plato para evitar la evaporación del medio embrionario. Encienda la luz azul (una irradiancia de 45 W/m2 activa la señalización de forma robusta).
    3. Cierre la puerta de la caja de luz para evitar la exposición inadvertida a la luz de la habitación. Si lo desea, incluya un termómetro de tarjeta de memoria dentro de la caja de luz antes de cerrar la puerta. No abra la puerta hasta que la puntuación del fenotipo sea de 1 día después de la fertilización (dpf; ver paso 5.1).
  3. Para el ensayo de inmunofluorescencia, exponer los embriones a la luz azul durante 20 minutos comenzando alrededor del 40% epiboly56 (~6 hpf) y fijar inmediatamente después de la exposición a la luz, junto con los controles no expuestos (Figura 3B). Una exposición de 20 minutos a la luz azul al 40% de la epibolía activa la señalización de forma reproducible.
    1. Alrededor de 1,5 hpf, envuelva por separado los platos expuestos y no expuestos en papel de aluminio. Asegúrese de que los platos estén completamente cubiertos y tenga cuidado de no introducir rasgaduras en el papel de aluminio. Deje el plato proxy sin envolver. Coloque los platos envueltos y el plato proxy sin envolver en la caja de luz a 28 °C (Figura 2A). No encienda el LED todavía.
    2. Si se analiza más de una cantidad de ARNm, para la afección no expuesta, clasifique los embriones inyectados con diferentes cantidades en placas individuales de 6 pocillos recubiertas de agarosa, lo que ayudará a minimizar la exposición inadvertida a la luz durante la fijación posterior.
    3. Cierre la puerta de la caja de luz para evitar la exposición inadvertida a la luz de la habitación.
    4. Diluya el caldo de formaldehído al 4 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x y alícuota 1 ml en tubos de microcentrífuga de fondo redondo de 2 ml preetiquetados, un tubo por afección. Conservar a 4 °C.
    5. Alrededor de 5 hpf, retire la placa proxy que contiene los embriones no inyectados y evalúe la etapa de desarrollo utilizando un endoscopio de disección. El estadio de los embriones sustitutos debe reflejar el estadio de los embriones sensibles a la luz en los platos envueltos.
    6. Retire también los platos envueltos, para que todos los platos experimenten la misma temperatura. Repita hasta que los embriones proxy hayan alcanzado el 40% de epibolia (~6 hpf). La progresión de la embriogénesis es sensible a la temperatura54; Por lo tanto, cuanto más tiempo estén las placas fuera del incubador, más tiempo tardarán los embriones en alcanzar el 40% de epibol.
    7. Una vez que los embriones proxy hayan alcanzado el 40% de epibolia, desenvuelva el plato expuesto y colóquelo en el estante superior de la caja de luz (Figura 2A). Deje los platos sin exponer envueltos y colóquelos en el estante inferior. Encienda inmediatamente la luz azul, cierre la puerta y programe un temporizador durante 20 minutos (una irradiancia de 45 W/m2 activa la señalización de forma robusta).
    8. Para prepararse para la fijación, elimine la mayor cantidad posible de luz ambiental (cierre las persianas, apague las luces del techo, apague las pantallas, etc.). Asegúrese de que los tubos que contienen formaldehído estén debidamente etiquetados. Inmediatamente antes de la fijación, retire los tubos que contienen formaldehído a 4 °C y colóquelos junto a la caja de luz.
    9. Paso sensible al tiempo y a la luz. Prepárate para moverte rápidamente al final de los 20 minutos de exposición a la luz. Después de 20 minutos, abra la puerta de la caja de luz y retire el plato no expuesto.
    10. Utilice una punta de pipeta de vidrio flameado para transferir embriones sensibles a la luz de forma rápida pero suave al tubo correspondiente preparado con formaldehído al 4 %.
    11. Minimice el tiempo de transferencia (<45 s) de los embriones sensibles a la luz para evitar la exposición inadvertida a la luz. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la pipeta. La exposición al aire destruirá los embriones decorionados.
    12. Para expulsar los embriones en formaldehído, sumerja la punta de la pipeta de vidrio en el formaldehído y deje que los embriones se hundan en el líquido. Minimice la cantidad de medio embrionario que se transfiere al formaldehído manteniendo los embriones al final de la punta.
    13. Después de transferir los embriones, devuelva la pipeta al mismo pocillo y pipetee hacia arriba y hacia abajo para desalojar los embriones atascados. Esto evita que los embriones de múltiples afecciones terminen accidentalmente en un tubo.
    14. Repita inmediatamente los pasos 4.3.11 a 4.3.13 para los embriones no expuestos y no inyectados, seguidos de los embriones expuestos (inyectados y no inyectados).
    15. Almacenar embriones fijados a 4 °C durante la noche.

5. Evaluación del experimento

  1. Puntuación del fenotipo e imágenes
    1. A 1 dpf, idealmente entre 24-32 hpf, retire los embriones de la caja de luz para evaluar los fenotipos utilizando un endoscopio de disección y crear una rúbrica de puntuación. Este es el criterio de valoración experimental; La fotoactivación involuntaria ya no es una preocupación.
    2. Marque los embriones mientras aún están en el corion para mayor facilidad. Use una pipeta o sonda para mover los embriones con el fin de verlos desde múltiples ángulos.
      1. Los embriones que experimentan un exceso de señalización de BMP se ventralizarán con diversos grados de gravedad, como se describe en detalle en Kishimoto et al. 199746 (Figura 4A, panel izquierdo). Los embriones que experimentan un exceso de señalización ganglionar tendrán una serie de defectos en el desarrollo relacionados con el exceso de mesendodermo (Figura 4A, panel derecho)1,3,47,57,58,59,60. A menudo habrán lisado en 1 dpf.
    3. Puntúe cada embrión en todas las condiciones (Figura 4B). Adquiera una imagen general de todos los embriones en cada pocillo. Si lo desea, descorionar e obtener imágenes de embriones representativos individuales en metilcelulosa (Figura 4A).
  2. Tinción e imágenes de inmunofluorescencia
    1. Después de incubar los embriones en formaldehído al 4% a 4 °C durante la noche, eliminar el formaldehído y lavar 3-5 veces con solución salina tamponada con fosfato 1x con Tween20 (PBST). Retire el PBST y agregue metanol al 100%.
    2. Cierre los tubos e inviértalos suavemente para mezclar PBST residual y metanol. Lavar 2 veces con metanol y almacenar a -20 °C durante al menos 2 h hasta años.
    3. Para el protocolo de inmunofluorescencia pSmad1/5/9 (BMP) ver Rogers et al.38. Para el protocolo de inmunofluorescencia pSmad2/3 (Nodal) ver van Boxtel et al.17 y Rogers et al.47.
    4. Obtener imágenes de embriones inmunoteñidos, utilizando un microscopio capaz de realizar cortes ópticos (p. ej., un microscopio confocal o de lámina de luz). Evite la saturación y mantenga condiciones de imagen idénticas entre todas las muestras teñidas con el mismo anticuerpo.
    5. Tome la imagen dentro de los 5 días posteriores a la finalización de la tinción de inmunofluorescencia, ya que la fluorescencia puede desvanecerse con el tiempo.

Resultados

El objetivo de los dos experimentos de control descritos aquí es determinar si bOpto-BMP/Nodal activan sus respectivas vías en respuesta a la exposición a la luz azul sin afectar a la señalización en ausencia de luz, como se esperaba. Utilice estos controles para establecer el flujo de trabajo experimental adecuado en su laboratorio antes de aplicar bOpto-BMP/Nodal a sus preguntas de investigación de interés.

El ensayo de fenotipado se puede completar en solo 2 días y proporciona una indicación útil de la actividad de señalización y la fototoxicidad (Figura 3A). Los embriones inyectados expuestos a la luz azul deben fenocopiar un exceso de señalización de BMP (ventralización46; Figura 4A, panel izquierdo) o señalización ganglionar (defectos del desarrollo relacionados con el mesendodermo adicional 1,3,47,57,58,59,60 (Figura 4A, panel derecho)). Si se inyectan, los embriones expuestos a la luz son afenotípicos, pruebe la calidad del ARNm y considere inyectar más, y verifique dos veces la estrategia de exposición a la luz para garantizar una exposición constante a la luz brillante (la luz de ~ 450 nm con una irradiancia de 45 W / m2 debería activar fuertemente la señalización). Por el contrario, los embriones inyectados y no expuestos deben tener un aspecto idéntico al de los hermanos no inyectados. Si se inyectan, los embriones no expuestos exhiben fenotipos, se reduce la cantidad de ARNm inyectado y se vuelve a evaluar la configuración experimental para garantizar que los embriones no expuestos estén protegidos de la exposición a la luz. Los datos que se muestran en la Figura 4B muestran los resultados de los experimentos típicos de fenotipado con cantidades adecuadas de ARNm y condiciones de exposición: una fuerte actividad de señalización es evidente en los embriones inyectados y expuestos a la luz, con solo una pequeña fracción de los embriones inyectados y no expuestos que exhiben fenotipos.

El ensayo de fenotipado también brinda la oportunidad de evaluar la fototoxicidad. Si la fototoxicidad es insignificante, los embriones no inyectados y expuestos a la luz deben aparecer de tipo salvaje, similar a los embriones no inyectados y no expuestos. Si los embriones no inyectados y expuestos a la luz tienen defectos, pero no los embriones no inyectados y no expuestos, considere la posibilidad de disminuir la irradiación de la luz. Una irradiancia de 45 W/m2 activa de forma robusta la señalización sin fototoxicidad evidente. Los datos mostrados en la Figura 4B no muestran diferencias preocupantes entre los embriones no inyectados, expuestos a la luz y no inyectados, no expuestos, lo que indica una fototoxicidad insignificante.

Aunque los ensayos de inmunofluorescencia requieren más tiempo y esfuerzo (~1 semana) en comparación con el ensayo de fenotipado (2 días), la tinción de inmunofluorescencia proporciona una lectura directa de la actividad de la vía de señalización y puede revelar cambios sutiles en la señalización que podrían no reflejarse en la morfología macroscópica. La inmunofluorescencia es especialmente importante para evaluar las respuestas a bOpto-Nodal, ya que el exceso de señalización ganglionar a menudo da lugar a que los embriones se lisen en 1 dpf, lo que puede tener muchas causas, en contraste con los fenotipos específicos de ventralización característicos del exceso de señalización de BMP46 (Figura 4A). Los embriones inyectados expuestos a la luz azul deben exhibir un aumento uniforme en la fosforilación de Smad1/5/9 o Smad2/3 en comparación con los embriones no inyectados expuestos a la luz. Si los niveles no aumentan, o solo aumentan débilmente, pruebe la calidad del ARNm y considere inyectar más, y vuelva a verificar la estrategia de exposición a la luz. Una exposición de 20 minutos a la luz azul con una irradiancia de 45 W/m2 alrededor del 40% de epíbola debería activar fuertemente la señalización. Si la tinción de pSmad no es uniforme, intente inyectar ARNm en el centro de la célula (en lugar de en la yema), lo que puede dar lugar a una distribución más uniforme del ARNm.

Los embriones inyectados y no expuestos deben tener niveles de pSmad comparables a los de los embriones no inyectados. Como anécdota, hemos observado una fosforilación de Smad con fugas con bOpto-Nodal que con bOpto-BMP. Si los niveles de pSmad aumentan en embriones inyectados y no expuestos, reduzca la cantidad de ARNm inyectado. Además, vuelva a evaluar la configuración experimental para asegurarse de que 1) los embriones no expuestos no estén expuestos inadvertidamente a la luz, y 2) la exposición a la luz durante la fijación sea mínima. Durante la etapa de fijación, es fundamental dejar transcurrir no más de 45 segundos entre la extracción de la caja de luz y la inmersión en formaldehído. Además, durante este paso, minimice la exposición a la luz de la habitación y a la luz solar cerrando las persianas de las ventanas, apagando las fuentes de luz blanca, usando luces rojas o cubriendo las fuentes de luz blanca con papel de filtro de gel que bloquea la luz azul (Tabla de materiales).

Los datos de la Figura 4C muestran los resultados de los experimentos típicos de tinción de inmunofluorescencia con cantidades adecuadas de ARNm y condiciones de exposición a la luz: los niveles de pSmad son similares en embriones no inyectados y no expuestos, mientras que los embriones inyectados y expuestos a la luz exhiben niveles más altos de fosforilación de Smad.

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Figura 1: Estrategia de activación de la señalización bOpto-BMP y -Nodal. (A) La vía de señalización endógena de BMP se activa mediante la unión al ligando BMP, lo que conduce a la formación de un complejo receptor de tipo I/II, la fosforilación de Smad1/5/9 y la expresión de genes diana de BMP. Los receptores tipo I BMPR1aa y Acvr1l también se conocen como Alk3 y Alk8, respectivamente. BMPR2a es un receptor de tipo II. (B) bOpto-BMPconstruye 38. Los dominios quinasas putativos de BMPR1aa y Acvr1l se fusionan con LOV; la fusión BMPR2a-LOV contiene el dominio quinasa putativo y el dominio C-terminal (CTD) del receptor. Todas las fusiones están dirigidas a la membrana con un motivo de miristoilación (Myr). Los dominios están separados por enlazadores de glicina-serina (GS). Las construcciones se etiquetan en el CTD con una etiqueta de epítopo de alta disponibilidad. Se encontró que esta combinación de tres constructos activa de manera óptima la señalización BMP. (C) Activación de la señalización de BMP mediada por bOpto-BMP. Cuando se exponen a la luz azul, los dominios LOV se dimerizan, lo que se cree que desencadena la formación de complejos y la activación de la señalización. (D) La vía de señalización nodal endógena se activa mediante la unión del ligando nodal, lo que conduce a la formación de un complejo receptor de tipo I / II, la fosforilación de Smad2/3 y la expresión de genes diana nodal. El receptor tipo I Acvr1ba y el receptor tipo II Acvr2ba también se conocen como Acvr1b y Acvr2b, respectivamente. (E) construcciones bopto-nodales39. Los dominios quinasas putativos de Acvr1ba y Acvr2ba se fusionan con LOV. Todas las fusiones están dirigidas a la membrana con un motivo de miristoilación (Myr). Los dominios están separados por enlazadores GS. Las construcciones se etiquetan en el CTD con una etiqueta de epítopo de alta disponibilidad. (F) Activación de señalización nodal mediada por bopto-nodal. Cuando se exponen a la luz azul, los dominios LOV se dimerizan, lo que se cree que desencadena la formación de complejos y la activación de la señalización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Caja de luz con control de temperatura para experimentos optogenéticos . (A) Un iluminador de microplaca LED se monta en la parte superior de una incubadora utilizando un soporte LED hecho a medida. Los embriones de pez cebra en una placa de 6 pocillos en el primer estante se exponen a la luz a través de un orificio perforado en la parte superior de la incubadora. El estante inferior contiene un segundo conjunto de embriones de control no expuestos en una placa de 6 pocillos envuelta en papel de aluminio. La puerta de la incubadora está forrada con burletes para evitar la exposición inadvertida a la luz de la habitación o a la luz solar. (B) Detalle del procedimiento para crear un agujero en la incubadora usando un taladro escalonado. El modelo de incubadora utilizado aquí tiene un panel interno que requirió perforar un segundo orificio más grande (Tabla de materiales). (C) Detalle del soporte LED personalizado diseñado para un sistema de iluminación de tres longitudes de onda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Flujo de trabajo del experimento bOpto-BMP/Nodal. Ensayo fenotípico y tinción de inmunofluorescencia pSmad para probar la actividad de bOpto-BMP/Nodal. Los embriones se inyectan con ARNm en la etapa de una célula y se transfieren a una caja de luz a más tardar 1,5 h después de la fertilización (hpf). (A) Ensayo fenotípico. Los embriones inyectados y los hermanos no inyectados se crían en la oscuridad o se exponen a una luz azul uniforme a partir de 1,5 hpf hasta 1 día después de la fertilización (dpf). La actividad de señalización optogenética se puede evaluar mediante la puntuación de los embriones para fenotipos consistentes con el exceso de actividad de la vía. (B) tinción de inmunofluorescencia pSmad. Los embriones inyectados y los hermanos no inyectados se crían en la oscuridad hasta un 40% de epibolía (~6 hpf). La mitad de los embriones inyectados y la mitad de los embriones no inyectados se exponen a una luz azul uniforme durante 20 minutos. Después de la exposición, todos los embriones se fijan y se someten a tinción de inmunofluorescencia para pSmad. Los niveles elevados de pSmad1/5/9 o pSmad2/3 reflejan la activación optogenética de la señalización de BMP o Nodal, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Evaluación de las respuestas de señalización activadas por la luz en embriones de pez cebra. Los embriones de pez cebra se inyectaron en la etapa de una célula con ARNm que codifica bOpto-BMP/Nodal. (A) Los embriones se criaron en la oscuridad o se expusieron a una luz azul uniforme a partir de 1,5 h después de la fertilización (hpf). Los fenotipos se puntuaron 1 día después de la fecundación (dpf). Se muestran fenotipos representativos. El exceso de señalización de BMP conduce a la ventralización (panel izquierdo), mientras que el exceso de señalización ganglionar causa defectos de desarrollo asociados con el mesendodermo adicional (panel derecho). Barra de escala = 500 μm. (B) Cuantificación del fenotipo. Los embriones inyectados y los hermanos no inyectados se criaron en la oscuridad a partir de 1,5 hpf (bulbo negro). La mitad de los embriones inyectados y la mitad de los embriones no inyectados fueron expuestos a una luz azul uniforme (bombilla azul). (C) Los embriones inyectados y los hermanos no inyectados se criaron en la oscuridad a partir de 1,5 hpf (bulbo negro). Al 40% de epiboly (~6 hpf), la mitad de los embriones inyectados y la mitad de los no inyectados fueron expuestos a una luz azul uniforme (bombilla azul). Después de 20 min, todos los embriones se fijaron y se sometieron a tinción de inmunofluorescencia para Smad1/5/9 o Smad2/3 fosforilados. Las intensidades más altas de pSmad indican un aumento de la señalización BMP/Nodal, respectivamente. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Montaje completo de la caja de luz. Archivo PDF 3D que muestra una vista 3D del conjunto completo de la caja de luz. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Despiece de caja de luz. Archivo PDF 3D que muestra una vista 3D del conjunto de la caja de luz despiezada. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 3: Junta de luz grande. Archivo de dibujo CAD (. DWG) para fabricar la junta de luz grande para el soporte LED utilizando una cortadora láser. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 4: Junta de luz pequeña. Archivo de dibujo CAD (. DWG) para fabricar la pequeña junta de luz para el soporte del LED utilizando una cortadora láser. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 5: Base de plataforma acrílica. Archivo de dibujo CAD (. DWG) para fabricar la base de la plataforma acrílica del soporte LED utilizando una cortadora láser. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 6: Plataforma acrílica vertical. Archivo de dibujo CAD (. DWG) para fabricar el soporte LED de la plataforma acrílica vertical utilizando una cortadora láser. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 7: Soporte acrílico a la izquierda. Archivo de dibujo CAD (. DWG) para fabricar el soporte izquierdo acrílico del soporte LED mediante una cortadora láser. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo Complementario 8: Derecho de soporte acrílico. Archivo de dibujo CAD (. DWG) para fabricar el soporte derecho acrílico del soporte LED mediante una cortadora láser. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La inyección de ARNm es la estrategia actual para administrar bOpto-BMP/Nodal a embriones de pez cebra. Este método tiene varios inconvenientes. En primer lugar, la cantidad adecuada de ARNm varía de un laboratorio a otro. La cantidad utilizada debe ser suficiente para activar la señalización de forma robusta con la exposición a la luz, pero sin la activación inadvertida de la oscuridad. Es una buena idea probar varias cantidades para encontrar niveles óptimos de ARNm y, una vez establecidos, crear alícuotas de una mezcla maestra para introducir de forma reproducible la misma cantidad de ARNm. En segundo lugar, la distribución desigual del ARNm inyectado puede conducir a una activación desigual de la señalización. Se cree que la inyección en el centro de la célula (no en la yema) promueve una distribución uniforme del ARNm. Finalmente, debido a que el ARNm inyectado se degrada con el tiempo, este enfoque puede no ser adecuado para experimentos en embriones más viejos. En el futuro, estos problemas podrían abordarse mediante líneas transgénicas de pez cebra que expresen de forma ubicua bOpto-BMP/Nodal con un promotor materno o inducible por fármacos. Aunque trabajar con peces cebra adultos potencialmente sensibles a la luz puede ser un desafío en este contexto, se han desarrollado con éxito los transgénicos de pez cebra 61,62 y Drosophila 22,34,35,63 que albergan herramientas optogenéticas.

Evitar la fotoactivación inadvertida es un desafío general con las herramientas optogenéticas. Para simplificar, trate los embriones inyectados de más de 1,5 hpf como sensibles a la luz. La exposición inadvertida a la luz a menudo se puede evitar simplemente envolviendo platos o platos con papel de aluminio. Sin embargo, para los experimentos que requieren la observación visual de embriones vivos de más de 1,5 hpf, es posible utilizar fuentes de luz roja o cubrir las fuentes de luz blanca con papel de filtro de gel económico que bloquea las longitudes de onda de dimerización de LOV (Tabla de materiales).

La caja de luz descrita aquí está diseñada para aplicaciones específicas que requieren un control preciso sobre los niveles de irradiancia de la luz, la dinámica y las longitudes de onda (Figura 2). Otros beneficios de esta caja de luz incluyen una exposición uniforme a la luz, un calentamiento involuntario insignificante de la muestra, un amplio espacio para múltiples placas de 6 pocillos y fuentes de luz de larga duración y bien caracterizadas espectralmente. Sin embargo, pueden ser preferibles diferentes estrategias de exposición a la luz dependiendo de la aplicación de la investigación. Muchos laboratorios han desarrollado sistemas de exposición a la luz uniforme más simples y rentables con huellas más pequeñas, incluido el revestimiento de incubadoras con tiras de LED, la suspensión de paneles LED sobre las muestras o la incorporación de LED en las tapas de los platos de cultivo 32,38,39,40,64,65,66. Es importante destacar que la caja de luz utilizada en este protocolo no permite a los usuarios regular de forma independiente los pozos individuales (a diferencia de Bugaj et al.52) ni proporcionar control espacial sobre la exposición a la luz. La activación optogenética localizada espacialmente se ha demostrado con bOpto-BMP38 y bOpto-Nodal39 utilizando láseres en sistemas SPIM o confocal, respectivamente, y también se ha realizado con muchas otras estrategias optogenéticas en una variedad de sistemas modelo (discutidos en Rogers y Müller12). Algunos enfoques incluso han logrado una resolución espacial subcelular 29,30,31. Aunque la implementación de sistemas de exposición a la luz localizados espacialmente está fuera del alcance de este protocolo, los experimentos de activación espacial con bOpto-BMP/Nodal son teóricamente posibles con equipos especializados, como dispositivos de microespejos digitales o enfoques de enmascaramiento. Se anima a los lectores a explorar la extensa literatura sobre cajas de luz de bricolaje para experimentos optogenéticos antes de comprometerse con una estrategia de exposición a la luz (véase, por ejemplo, Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar y Khammash 53 y más en https://www.optobase.org/materials/).

Las estrategias de optogenética molecular a menudo ofrecen un mayor grado de control espacio-temporal sobre los procesos biológicos en comparación con los enfoques históricos como los mutantes, la expresión génica ectópica, las proteínas recombinantes y los fármacos. Los lectores que estén interesados en los beneficios de los enfoques optogenéticos pueden explorar otras herramientas publicadas disponibles en el pez cebra y otros organismos. Estos incluyen herramientas para manipular vías de señalización adicionales 32,65,67,68, regular la expresión génica 61,64,66,69,70,71, alterar la localización de proteínas 31,72 y activar la apoptosis 62. Estas herramientas y muchas otras están convenientemente catalogadas en OptoBase, un recurso web curado para enfoques de optogenética molecular28. Para aquellos que se inspiran en la creación de nuevas herramientas optogenéticas, el recurso también presenta descripciones útiles de proteínas que responden a la luz que se han empleado en una amplia gama de estrategias, incluidas las proteínas que responden a la luz y a las longitudes de onda verde, roja e infrarroja cercana. Estamos entusiasmados de que la comunidad científica se dé cuenta de todo el potencial de los enfoques de optogenética molecular.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los fondos para este protocolo fueron proporcionados por el Programa Intramuros del NICHD a KWR (ZIA HD009002-01). Agradecemos a Jeff Farrell y a su laboratorio por sus esclarecedores comentarios, a Will Anderson por su excelente apoyo técnico, a Leanne Iannucci por realizar pruebas de estrés en el protocolo y medir la irradiancia, y a las instalaciones de pez cebra compartidas de los NIH por su arduo trabajo para mantener saludable al pez cebra.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Construyendo una caja de luz & Protocolo de exposición a la luz
#8 x 1" Hexagonal Tornillo AutoperforanteMcMaster-Carr99663A2221.4.5
Medidor digital de potencia y energíaóptica ThorLabsPM100D1.7
4
Incubadora (142 litros)Boekel Scientific1394001.3.1
Montaje en panel de incubadora (acrílico negro fundido de 1/4" de espesor)Personalizado parte / Piedmont PlasticsIncubator_panel1.4.4
Broca escalonada de ranura en espiral HSSgrande CO-ZSDB0001TA1.3.2
Junta de lente LED, junta de incubadora; silicona negra de 1/32" de espesorMcMaster-Carr5812T121.4.3
1.4.4
Iluminador de microplaca LEDPrizmatixNA1.1
1.4.3
M3 Separador de cubo de 10 mmNewark Electrónica005.60.5331.4.1
M3 x 10mm 316SS Tornillo de cabeza planaMcMaster-Carr91801A1561.4.1
M6 x 10mm 316SS Tornillo de cabeza planaMcMaster-Carr91801A3051.4.3
Termómetro de tarjeta de memoriaFisherbrand15-081-1111.9
3.2.1
Cabezal del sensor del medidor de potencia de deslizamiento del microscopio (150 mW)ThorLabsS170C1.7< br/> 4
Papel de filtro de gel rojo #E106Rosco / B& H Foto & Electrónica110084014805-E1064.2.1
Soportes laterales (acrílico negro fundido de 1/4" de espesor)Pieza personalizada / Piedmont PlasticsSide_bracket1.4.2
Soporte vertical (acrílico negro fundido de 1/4" de espesor)Pieza personalizada / Piedmont PlasticsVertical_bracket1.4.1
Burletes: Espuma EPDM de alta resistencia, 1/2" wd 1/4" tkMcMaster-Carr8694K121.8
ARNm fuerte
EZNA MicroElute Cycle Pure KitOmegaD6293-022.4
GeneJET Miniprep Kit (250 rxns)Thermo ScientificK05032.2
Incubadora de micromuestras (Hybex)SciGene1057-30-02
Incubadora de micromuestras bloque de tubo de 1,5 ml (Hybex)SciGene1057-34-02
Espectrofotómetro Nanodrop OneThermo ScientificND-ONE-W2.4
Enzima de restricción NotI-HFNew England Biolabs (NEB)R3189L2.1
pCS2-Opto-Alk3Addgene2076142
pCS2-Opto-Alk8Addgene207615 2
pCS2-Opto-BMPR2aAddgene2076162
RNeasy Mini Kit (250 rxns)Qiagen741062.3
Inyecting mRNA
Agarose (UltraPure)Invitrogen / Thermo Fisher165005003.1.1
250 ml vasos de precipitados de vidrioFisherbrandFB1002503.3.2
platos de 6 pocillos (caja de 50)Falcon08 772 1B3.1.6
B-8A rótulaNarishigeB-8A3.3
Unidad de contrapresión (componente del equipo de microinyección)Instrumentación científica aplicada (ASI)BPU3.3
Interruptor de pie (componente del equipo de microinyección)Instrumentación científica aplicada (ASI)FWS3.3
Soporte magnético GJ-1NarishigeGJ-13.3
Capilares de vidrio (4 pulgadas, diámetro exterior 1 mm, filamento)World Precision Instruments1B100F-43.1.11
Fondos de placas de Petri de vidrio (para descorionado)Pyrex08-748A3.3.2
Pipetas de vidrio (5 3/4" con punta ancha)Kimble-Chase63A53WT3.1.9
Moldes para placas de inyecciónAdaptive Science Toolstu13.1.3
Placa de hierro IPNarishigeIP3.3
M-152 micromanipuladorNarishigeM-1523.3
Kit de soporte de micropipeta (componente de la plataforma de microinyección)Instrumentación Científica Aplicada (ASI)MIMPH-MPIP-Kit 3.3
micrómetrosMeiji Techno AmericaMA2853.3
Inyector de presión MPPI-2 (componente de la plataforma de microinyección)Instrumentación Científica Aplicada (ASI)MPPI-33.3
Extractor de agujasWorld Precision InstrumentsPUL-10003.1.11
Placas de Petri (100 mm x 15 mm, caja de 500)Falcon08-757-100D3.1.2
Pipeta (10 ml, verde)Bel-ArtF37898-00003.3
PronaseRoche114596430013.3.2
Frascos exprimibles (500 ml)Nalgene / Thermo Scientific2402-05003.3

Referencias

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