Identificación, diagnóstico y clasificación de tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos en modelos de ratón modificados genéticamente

Summary

Hemos desarrollado una metodología para evaluar si las neoplasias del sistema nervioso en ratones modificados genéticamente recapitulan con precisión la patología de sus homólogos humanos. Aquí, aplicamos estas técnicas histológicas, criterios patológicos definidos y metodologías de cultivo a neurofibromas y tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos que surgen en el modelo de ratón P 0-GGFβ3.

Abstract

Los pacientes con neurofibromatosis tipo 1 (NF1) del síndrome de susceptibilidad tumoral autosómica dominante suelen presentar neurofibromas plexiformes (NP) que posteriormente se transforman en tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos (MPNST) muy agresivos. La comprensión del proceso por el cual una NP se transforma en una MPNST se vería facilitada por la disponibilidad de modelos de ratón modificados genéticamente (GEM) que replican con precisión la progresión de la NP-MPNST observada en humanos con NF1. Desafortunadamente, los modelos GEM con ablación de Nf1 no recapitulan completamente este proceso. Esto nos llevó a desarrollar ratones P 0-GGFβ3, un modelo GEM en el que la sobreexpresión del mitógeno de la célula de Schwann neuregulina-1 (NRG1) en las células de Schwann da lugar al desarrollo de NPs que progresan hasta convertirse en MPNSTs con alta frecuencia. Sin embargo, para determinar si la tumorigénesis y la progresión neoplásica en ratones P 0-GGFβ3 modelan con precisión los procesos observados en pacientes con NF1, primero tuvimos que demostrar que la patología de los tumores de la vaina del nervio periférico P_0-GGFβ3 recapitula la patología de sus homólogos humanos.

En este trabajo se describen las metodologías especializadas utilizadas para diagnosticar y clasificar con precisión las neoplasias del sistema nervioso periférico en modelos GEM, utilizando P 0-GGFβ3 y P_0-GGFβ3; Trp53^+/- ratones como ejemplo. Describimos los métodos histológicos, inmunohistoquímicos e histoquímicos utilizados para diagnosticar NP y MPNST, cómo distinguir estas neoplasias de otros tipos de tumores que imitan su patología y cómo clasificar estas neoplasias. Discutimos el establecimiento de cultivos de paso temprano a partir de MPNST GEM, cómo caracterizar estos cultivos mediante inmunocitoquímica y cómo verificar su tumorigénesis mediante el establecimiento de aloinjertos. En conjunto, estas técnicas caracterizan la patología de las NP y MPNST que surgen en los modelos GEM y comparan críticamente la patología de estos tumores murinos con sus homólogos humanos.

Introduction

Durante las últimas tres décadas, numerosos laboratorios han intentado crear modelos de ratón de cánceres humanos mediante la introducción de mutaciones asociadas al cáncer humano en el genoma del ratón o mediante la sobreexpresión de un producto génico que se sobreexpresa en los cánceres humanos. Los modelos de ratón modificados genéticamente (GEM) resultantes se pueden utilizar para una variedad de propósitos, como establecer que la modificación genómica recién introducida inicia la tumorigénesis, identificar otros cambios genéticos o epigenéticos que ocurren posteriormente y que contribuyen a la progresión tumoral y definir las vías de señalización clave que impulsan el inicio y la progresión del tumor. A diferencia de los modelos de xenoinjertos ortotópicos, que se basan en el uso de ratones inmunodeficientes, los modelos de cáncer GEM tienen un sistema inmunitario completamente funcional y, por lo tanto, modelan con mayor precisión las respuestas a los agentes terapéuticos candidatos. Sin embargo, cuando se utilizan modelos de cáncer GEM para fines como estos, es esencial que los investigadores confirmen que las observaciones realizadas con las neoplasias GEM son relevantes para sus contrapartes humanas. Esta validación debe incluir una evaluación exhaustiva de la patología de las neoplasias GEM y la determinación de si las características patológicas de las neoplasias GEM recapitulan la patología del tipo de tumor humano correspondiente.

El síndrome de susceptibilidad tumoral neurofibromatosis tipo 1 (NF1) es la enfermedad genética más común que afecta al sistema nervioso humano, ocurriendo en aproximadamente 1 de cada 3.000-3.500 nacidos vivos ^1,2,3. Las personas afectadas por NF1 desarrollan múltiples tumores benignos de la vaina de los nervios periféricos conocidos como neurofibromas en la piel (neurofibromas dérmicos) y en los nervios grandes y plexos nerviosos (neurofibromas plexiformes). Mientras que tanto los neurofibromas dérmicos como los plexiformes empeoran la calidad de vida del paciente al producir deterioro físico, conductual y/o social, los neurofibromas plexiformes (NP) son particularmente peligrosos ^4,5. Esto se debe a que las NP se transforman con frecuencia en tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos (MPNST), que son neoplasias agresivas de células fusiformes con una tasa de supervivencia excepcionalmente baja ^1,2. En gran parte, esta baja tasa de supervivencia se debe a que los regímenes radioterapéuticos y quimioterapéuticos que se usan actualmente para tratar las MPNST son ineficaces. Sin embargo, el desarrollo de terapias nuevas y más efectivas ha sido un desafío. Esto se debe a que, a pesar de la frecuencia con la que se presentan las MPNST en pacientes con NF1, siguen siendo neoplasias raras. Como resultado, es muy difícil obtener un gran número de tumores humanos para su estudio; también es difícil reclutar suficientes pacientes con MPNST para ensayos clínicos. Para superar estas limitaciones, se han generado varios modelos GEM con el objetivo de obtener más información sobre las anomalías que impulsan la patogénesis del neurofibroma y la progresión de la NP-MPNST y facilitar los ensayos preclínicos con agentes terapéuticos candidatos.

Los pacientes con NF1 tienen mutaciones inactivadoras en una copia del gen NF1. La patogénesis del neurofibroma se desencadena cuando se produce una mutación inactivadora en el gen NF1 funcional restante en una célula del linaje celular de Schwann. Sorprendentemente, sin embargo, cuando los ratones fueron generados con mutaciones Nf1 inactivadoras de la línea germinal, no desarrollaron neurofibromas ^6,7. La demostración posterior de que los ratones con células de Schwann nulas de Nf1 y haploinsuficiencia de Nf1 en todos los demás tipos de células (Krox20-Cre;Los neurofibromas plexiformes desarrollados por Nf1 ^flox/- desarrollaron neurofibromas sugirieron que se requería una dosis reducida del gen Nf1 en otros tipos celulares para la patogénesis del neurofibroma⁸. Incluso entonces, los neurofibromas plexiformes en Krox20-Cre; Los ratones ^{Nf1 flox/-} no progresaron hasta convertirse en MPNST y, por lo tanto, solo imitaron parcialmente la biología de sus contrapartes humanas. La patogénesis de MPNST se produjo cuando las mutaciones en Nf1 se asociaron con mutaciones en genes supresores de tumores adicionales, como Trp53⁹ o Cdkn2a¹⁰, pero las MPNST en estos modelos GEM se desarrollaron de novo o a partir de neoplasias neurofibromatosas atípicas de potencial biológico incierto (ANNUBP)^11,12, en lugar de a partir de neurofibromas plexiformes benignos preexistentes (ver^13,14 para excelentes revisiones de estos modelos, así como de otros modelos que introducen mutaciones adicionales de pérdida de función asociadas a MPNST en genes como Suz12 y Pten¹⁵).

Estos modelos de ratón han sido muy valiosos para establecer el papel que desempeñan genes como NF1, TP53 y CDKN2A en la patogénesis de las neoplasias del sistema nervioso periférico asociadas a NF1 y para los ensayos preclínicos que prueban agentes terapéuticos candidatos. Sin embargo, todavía tenemos una comprensión incompleta del proceso por el cual los neurofibromas plexiformes progresan para convertirse en neoplasias neurofibromatosas atípicas de potencial biológico incierto (ANNUBPs¹⁶) y luego MPNST. Recientemente se han hecho algunos progresos en la comprensión de este proceso con el reciente informe de que los ratones con deleciones en Nf1 y Arf desarrollan ANNUBP que progresan hasta convertirse en MPNST¹¹. Sin embargo, aún no existen modelos de ratón basados en mutaciones Nf1 que recapitulen completamente el proceso de progresión del neurofibroma plexiforme-MPNST observado en humanos. Además, no está claro si existen múltiples vías distintas que conducen al desarrollo de MPNST. Teniendo en cuenta esto, es posible que los GEM descritos anteriormente solo modelen un subconjunto de varias vías diferentes que conducen a la progresión del neurofibroma-MPNST y a la patogénesis de MPNST. Este punto se ve enfatizado por el hecho de que las MPNST también ocurren esporádicamente y que algunas MPNST esporádicas aparentemente no tienen mutaciones en NF1 ^17,18.

Aunque este último punto ha sido cuestionado por la reciente sugerencia de Magollon-Lorenz et al. de que al menos algunos MPNST esporádicos que carecen de mutaciones NF1 son melanomas o un tipo diferente de sarcoma¹⁹, recientemente hemos informado de un MPNST esporádico y una línea celular derivada de este tumor (células 2XSB) que era NF1 de tipo salvaje²⁰. Durante la caracterización del tumor progenitor y de la línea celular 2XSB, descartamos sistemáticamente posibilidades diagnósticas alternativas, incluyendo el melanoma y los múltiples otros tipos de sarcoma que se consideran rutinariamente en el diagnóstico diferencial de un tumor maligno esporádico de la vaina del nervio periférico²⁰. Además, observamos que Magollon-Lorenz et al. reconocieron que sus hallazgos en las tres líneas celulares esporádicas de MPNST que estudiaron no podían generalizarse para indicar que todos los tumores identificados como MPNST esporádicos no son MPNST.

Para construir un modelo GEM en el que el neurofibroma y la patogénesis de MPNST no dependieran necesariamente de mutaciones específicas de genes supresores de tumores, generamos ratones transgénicos en los que la sobreexpresión del potente mitógeno de la célula de Schwann, la neuregulina-1 (NRG1), fue impulsada por el promotor de la proteína de mielina cero (P₀) específica de la célula de Schwann (ratones P 0-GGFβ3)²¹. Hemos demostrado previamente que los neurofibromas humanos, las MPNST y las líneas celulares MPNST expresan varias isoformas de NRG1 junto con las tirosina quinasas del receptor erbB (erbB2, erbB3 y erbB4) que median la señalización de NRG1 y que estos receptores erbB se activan constitutivamente²². También hemos demostrado que los inhibidores farmacológicos de las quinasas erbB inhiben potentemente la proliferación de MPNST²², la supervivencia²³ y la migración²⁴. De acuerdo con nuestras observaciones en humanos, los ratones P 0-GGFβ3 desarrollan neurofibromas plexiformes²⁵ que progresan hasta convertirse en MPNST con una alta frecuencia^21,25. Hemos demostrado que las MPNST P 0-GGFβ3, al igual que sus contrapartes humanas, comúnmente desarrollan mutaciones de Trp53 y Cdkn2a, así como muchas otras anomalías genómicas que potencialmente contribuyen a la tumorigénesis²⁵. Las MPNST que surgen en ratones P 0-GGFβ3 no tienen mutaciones inactivadoras en Nf1. Sin embargo, utilizando la complementación genética, demostramos que NRG1 promueve la tumorigénesis en ratones P 0-GGFβ3 predominantemente a través de las mismas cascadas de señalización que se ven alteradas por la pérdida de Nf1 ²⁶; esta conclusión se basa en nuestro hallazgo de que la sustitución de la sobreexpresión de NRG1 por la pérdida de Nf1 en presencia de haploinsuficiencia de Trp53 (P 0-GGFβ3;Trp53^+/- ratones) produce animales en los que las MPNST se desarrollan de novo, como se observa en cis-Nf1^+/-; Ratones Trp53^{+/- 27}.

Para obtener esta y otra información que demuestre que los ratones P 0-GGFβ3 modelan con precisión los procesos de patogénesis del neurofibroma y la progresión del neurofibroma-MPNST observados en humanos con NF1, hemos desarrollado metodologías especializadas para procesar tejidos de estos animales, diagnosticar con precisión sus tumores, clasificar los MPNST que surgen en estos ratones, establecer y caracterizar el paso temprano de P_0-GGFβ3 y P_0-GGFβ3; Trp53^+/- cultivos de MPNST y comparación crítica de la patología de P 0-GGFβ3 NPs y MPNSTs y P_0-GGFβ3; Trp53^+/- MPNST a la de sus homólogos humanos. Muchas de estas metodologías son generalizables a otros modelos GEM de neoplasia del sistema nervioso. Además, varias de estas metodologías son aplicables de manera más amplia a los modelos GEM en los que las neoplasias surgen en otros sitios de órganos. En consecuencia, aquí presentamos una descripción detallada de estas metodologías.

Protocol

Los procedimientos descritos aquí fueron aprobados por la IACUC de la Universidad Médica de Carolina del Sur y fueron realizados por personal debidamente capacitado de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y las pautas institucionales de cuidado de animales de MUSC.

1. Determinación de la penetrancia tumoral y la supervivencia en ratones P 0-GGFβ3 e identificación de tumores en estos animales para su posterior caracterización

1. Generar la cohorte de ratones que serán evaluados para tumorigénesis. El número de ratones necesarios depende de la penetrancia del fenotipo tumoral. Para compensar pérdidas como estas, comience con una cohorte que sea un 10-15% más alta que el número final deseado de animales.
   NOTA: Determinamos empíricamente la penetrancia tumoral en ratones P 0-GGFβ3 en una cohorte inicial de 50 ratones (seis de los cuales se perdieron por razones no relacionadas con la neoplasia (p. ej., peleas)⁾²⁵.
2. Evalúe la salud de los animales tres veces por semana y registre las puntuaciones de la condición corporal, incluido el peso y los cambios de comportamiento en cada examen. Acabar con ratones portadores de tumores o moribundos (ver nota a continuación) utilizando la eutanasia con dióxido de carbono seguida de una dislocación cervical. Registre la edad al morir en días. Si los tumores son visibles externamente, registre las dimensiones del tumor (largo, ancho y alto).
   NOTA: Es esencial que no se permita que los animales continúen más allá del tamaño máximo permisible del tumor aprobado por la IACUC y/o el criterio de valoración humanitario.
3. Utilizando la edad de muerte, establezca una curva de supervivencia de Kaplan-Meier para determinar la edad media de muerte y el rango de supervivencia.
   NOTA: Los ratones P 0-GGFβ3 tuvieron una edad media de muerte de 261,5 días, con un rango de 74-533 días; El 91% de nuestra cohorte tenía neurofibromas múltiples y el 71% tenía MPNST²¹.
4. Determinar si hay tumores muy visibles y, si lo están, diseccionarlos en condiciones estériles para establecer si el tumor está asociado con un nervio periférico y, a continuación, extirpar el tumor. En P 0-GGFβ3 y P_0-GGFβ3; Los ratones Trp53^+/- y los tumores de la vaina de los nervios periféricos se encuentran con mayor frecuencia en los nervios trigémino y ciático. Incluso si no se observan tumores muy visibles en asociación con estos nervios, fije e inserte estos nervios como se describe a continuación para que puedan ser examinados para detectar la presencia de microtumores. Por lo general, los microtumores ocurren dentro de los ganglios asociados con estos nervios.
5. Cortar los tumores macroscópicamente visibles en tres pedazos (Figura 1A). Utilice la pieza 1 para histología (secciones de parafina, inmunohistoquímica e histoquímica). Utilice la pieza 2 para establecer culturas de pasaje temprano. Congele a presión la pieza 3 (usando nitrógeno líquido) para posibles experimentos futuros (por ejemplo, inmunomanchas, aislamiento de ARN y ADN).
6. Fijar la pieza 1 en paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante la noche a 4 ^°C. Fijar el resto del cuerpo del animal por inmersión en paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 °C.

2. Inclusión en parafina de tumores macroscópicamente visibles y preparación de secciones teñidas con hematoxilina y eosina para la evaluación diagnóstica inicial

1. Inclusión en parafina de tumores muy visibles
   1. Después de fijar la pieza tumoral 1 durante la noche en paraformaldehído al 4%, enjuague el tejido colocándolo en un volumen de PBS que sea al menos 10 veces mayor que el volumen del tejido durante 15 minutos; Use el mismo volumen para todos los enjuagues posteriores. Repita dos enjuagues más de PBS de 15 minutos, usando un volumen nuevo de PBS para cada enjuague.
   2. Transfiera la pieza tumoral de 1 a 70% de etanol. Mantener el tejido en etanol al 70% durante 24 h a 4 °C. Si lo desea, almacene el tejido a largo plazo en estas condiciones.
      NOTA: Los pasos 2.1.1 a 2.1.7 se proporcionan para el beneficio de los investigadores que no tienen acceso a una máquina comercial de procesamiento de tejidos. Si el investigador tiene acceso a un procesador de tejidos, el tejido se procesará a través de etanoles y xilenos clasificados según el protocolo del instrumento programado.
   3. Transfiera la pieza tumoral de 1 a 80% de etanol durante 30 minutos a temperatura ambiente. Repita la incubación durante 30 minutos más en un volumen fresco de etanol al 80%.
   4. Transfiera la pieza tumoral de 1 a 95% de etanol durante 75 min a temperatura ambiente. Repita la incubación dos veces más, cada vez durante 75 minutos adicionales en un volumen fresco de etanol al 95%.
   5. Transfiera la pieza tumoral de 1 a 100% de etanol e incube durante 60 minutos a temperatura ambiente. Repita la incubación de 60 minutos dos veces más, cada vez utilizando un volumen fresco de etanol al 100%.
   6. Transfiera la pieza tumoral 1 a un solvente a base de d-limoneno e incube durante 30-60 minutos a temperatura ambiente. Transfiera la pieza tumoral 1 a un volumen nuevo del solvente a base de d-limoneno e incube durante 30-60 minutos adicionales a temperatura ambiente.
   7. Transfiera la pieza tumoral 1 al disolvente 1:1 a base de parafina/d-limoneno durante 1 h a 60 ^°C. Deseche el disolvente 1:1 a base de parafina/d-limoneno y transfiera la pieza tumoral 1 a 60 ^°C de parafina e incube durante 20 min a 60 ^°C. Repita la incubación en un volumen fresco de parafina a 60 ^°C una vez más durante 20 minutos. Incubar la pieza tumoral 1 en parafina durante la noche a 60 ^oC.
   8. Vierta una capa base de parafina en un molde de histología de acero y deje que se solidifique. Transfiera la pieza tumoral 1 a la superficie de la parafina base e inmediatamente después de la colocación, cubra el tejido con parafina de 60 ^oC y coloque el casete de tejido encima y en contacto con la parafina fundida. Transfiera el molde al lado frío de la estación de inclusión y deje que se solidifique durante 10-15 minutos.
   9. Retire del molde el bloque de parafina con el casete de pañuelo adjunto. Utilice el casete de tejido adjunto para sujetar el bloque en el micrótomo durante el corte.
      NOTA: El bloque de parafina ahora se puede almacenar indefinidamente a temperatura ambiente.
2. Prepare secciones teñidas con hematoxilina y eosina de tumores muy visibles.
   1. Corte secciones de 4-5 μm de tejido tumoral con un micrótomo y móntelas en portaobjetos de vidrio cargados positivamente.
   2. Para realizar la tinción con hematoxilina y eosina (H&E), desparafinar las secciones de tejido incubando los portaobjetos en un disolvente a base de d-limoneno durante 10 min a temperatura ambiente. Repita la incubación en un volumen fresco de disolvente a base de d-limoneno durante 10 min.
   3. Transfiera los portaobjetos a etanol al 100% e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. Transfiera los portaobjetos a un volumen fresco de etanol al 100% e incube durante otros 5 minutos a temperatura ambiente.
   4. Transfiera los portaobjetos a etanol al 95% e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. Transfiera los portaobjetos a un volumen fresco de etanol al 95% e incube durante otros 5 minutos a temperatura ambiente.
   5. Transfiera los portaobjetos a etanol al 70% e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. Luego, transfiera a etanol al 50% e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   6. Transfiera los portaobjetos a agua destilada e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   7. Tiñe los portaobjetos sumergiéndolos en hematoxilina durante 5 minutos a temperatura ambiente. Enjuague con agua corriente del grifo durante 1-2 minutos. Diferencie sumergiendo portaobjetos 2-5x en ácido clorhídrico al 0,5 % en etanol al 70 %. Enjuague en un baño de agua corriente del grifo durante 1-2 minutos. Coloque los portaobjetos en etanol al 95% con ácido acético al 0,5% durante 10 s.
   8. Tiñir los portaobjetos con eosina-Y durante 30 s a temperatura ambiente y luego transferir los portaobjetos a etanol al 100% durante 5 min. Limpie las muestras en un disolvente a base de d-limoneno durante 5 min.
   9. Monte los cubreobjetos con un medio de montaje a base de xileno mientras el portaobjetos aún está húmedo con el solvente a base de d-limoneno. Deje que el medio de montaje se asiente durante la noche.
      NOTA : No utilice un medio de montaje a base de agua.
3. Preparar tejidos sin tumores muy visibles para identificar neurofibromas plexiformes y micro-MPNST. Incrustar los tejidos en parafina, preparar cortes histológicos y teñir estos cortes con hematoxilina y eosina.
   1. Extirpar los órganos internos e incrustar porciones representativas de cada órgano en parafina para preparar secciones teñidas con H y E que se examinarán en busca de evidencia microscópica de tumores (Figura 1B). Retire la cabeza, las extremidades delanteras, las extremidades posteriores y la cola (Figura 1C). Para examinar la médula espinal y las raíces nerviosas in situ en busca de evidencia de tumores de raíces nerviosas, descalcificar la columna vertebral y las costillas y tejidos blandos asociados mediante inmersión en 0,3 M de EDTA/4% de paraformaldehído (pH 8,0) durante 48-72 h a 4 ^oC; luego, enjuague las muestras con 1x PBS. Al final de la descalcificación, asegúrese de que la descalcificación se haya completado intentando perforar la columna vertebral con una aguja. La descalcificación es exitosa si la aguja penetra fácilmente en el hueso sin crujir.
   2. Corte la columna vertebral descalcificada y las estructuras asociadas en bloques que quepan en un casete de pañuelos. Deshidratar mediante etanoles graduados seguidos de un disolvente a base de d-limoneno, tal como se describe en los pasos 2.1.2 a 2.1.7. Incrustar en parafina y preparar secciones de 4-5 μm como se describe en los pasos 2.1.7-2.2.1. Realice tinciones de H&E como se describe en los pasos 2.2.2-2.2.9; Deje que el medio de montaje se asiente durante la noche.

3. Identificar posibles neurofibromas plexiformes y realizar tinciones especiales para confirmar diagnósticos

NOTA: Recomendamos encarecidamente incluir a un patólogo humano o veterinario con experiencia en la evaluación de la H&E y las tinciones especiales de las secciones tumorales GEM.

1. Examinar los portaobjetos teñidos con H y E preparados como se describió anteriormente utilizando microscopía de campo claro para identificar posibles tumores de la vaina de los nervios periféricos. Dado que los neurofibromas y los MPNST surgen dentro de los nervios periféricos, es importante determinar si los tumores microscópicos están asociados con un nervio periférico. Identificar bloqueos con posibles tumores de la vaina de los nervios periféricos para que se puedan realizar inmunotinciones y otras tinciones especiales para confirmar o refutar los diagnósticos.
2. Distinguir las NP potenciales de las MPNST u otras neoplasias de grado alto en función de las características histológicas observadas durante el examen de campo claro de las secciones teñidas con H y E. Las NP humanas son neoplasias levemente hipercelulares compuestas predominantemente por células con núcleos alargados, a menudo ondulados. En muchas áreas, las células están poco empaquetadas y pueden estar separadas por material extracelular mixoide; Las NP en ratones P 0-GGFβ3 tienen una apariencia similar. Por lo general, las mitosis no están presentes; si lo son y el tumor es de moderada a altamente hipercelular, el tumor es un MPNST u otro tipo de neoplasia de alto grado (consulte más adelante).
3. Las NP están compuestas por una mezcla de células de Schwann neoplásicas y otros tipos de células no neoplásicas, como los mastocitos. Para confirmar la identidad de una NP, realizar inmunotinciones para los marcadores de células de Schwann S100β y Sox10 y el marcador de mastocitos CD117 (c-Kit) en secciones de bloques que contienen NP potenciales identificadas en el examen de H&E (ver sección 3.4 para opciones alternativas de tinción de marcadores de mastocitos). Realizar inmunotinciones de Ki67 para confirmar bajas tasas de proliferación.
   NOTA: En la Tabla 1 se enumeran los marcadores de antígenos utilizados para la identificación rutinaria de los neurofibromas plexiformes GEM (S100β, Sox10, CD117, Ki67), el diagnóstico de los MPNST y para una evaluación completa de otros tipos celulares presentes en los neurofibromas; solo se tiñe para estos últimos antígenos cuando se describe por primera vez un nuevo modelo GEM. Consulte la hoja de datos del fabricante del anticuerpo para conocer las condiciones recomendadas. Tenga en cuenta si el prospecto del fabricante del anticuerpo recomienda la recuperación del antígeno; No todos los antígenos requieren recuperación para ser detectables.
   1. Prepare secciones de 4-5 μm a partir de los bloques de parafina seleccionados y móntelas en portaobjetos cargados positivamente. Desparafinar las secciones como se describe en los pasos 2.2.2-2.2.6.
   2. Enjuague las secciones con 1x PBS durante 3-5 min.
   3. Si el fabricante del anticuerpo recomienda la recuperación del antígeno, prepare un tampón de citrato. Combine 9 ml de solución de ácido cítrico (10,5 g de ácido cítrico en 500 ml de agua destilada) y 41 ml de solución de citrato de sodio (14,7 g de citrato de sodio en 500 ml de agua destilada).
   4. Realice la recuperación de antígenos colocando portaobjetos en tampón de citrato durante 20 minutos en una olla arrocera caliente.
   5. Transfiera los portaobjetos a peróxido de hidrógeno al 3%/1x PBS durante 10 minutos para eliminar la actividad de la peroxidasa en el tejido.
      NOTA: Haga que esta solución esté fresca cada vez y no use la solución madre de peróxido de hidrógeno si tiene más de 3-4 meses.
   6. Enjuague las secciones en 1x PBS.
   7. Bloquee las secciones con tampón de bloqueo (2% BSA, 0,1% Triton X-100 en 1x PBS) durante 1 h. Enjuague brevemente los portaobjetos en 1x PBS.
   8. Agregue el anticuerpo primario a las secciones de tejido. Preparar anticuerpos primarios en tampón de bloqueo diluido. Incubar los portaobjetos durante 2 h a 37 ^°C o durante la noche a 4 ^°C.
   9. Lave los portaobjetos en 1x PBS durante 5 min. Repita 3 veces.
   10. Incubar el tejido con anticuerpo secundario biotinilado durante 1-2 h.
   11. Prepare la solución de diaminobencidina (DAB) según el protocolo del fabricante y sumerja los portaobjetos en la solución durante 2-10 minutos. Lave los portaobjetos en agua durante 5 min.
   12. Contratiñe las secciones sumergiéndolas en hematoxilina durante 10-15 min. Exponga al agua corriente hasta que salga clara. Sumerja rápidamente los portaobjetos en alcohol y enjuáguelos con agua.
   13. Deshidrate los portaobjetos en etanol graduado sumergiendo rápidamente los portaobjetos, 4-5 veces por solución, en etanol al 70%, etanol al 95% y luego etanol al 100%. Incubar los portaobjetos en un disolvente a base de d-limoneno durante 2 min. Incubar los portaobjetos en un segundo lote de disolvente a base de d-limoneno durante 2 min.
   14. Monte las guías con un medio de montaje a base de xileno.
   15. Examine los portaobjetos mediante microscopía de campo claro.
   16. Para la inmunofluorescencia, omitir los pasos 3.3.10-3.3.15. En su lugar, incubar el tejido con un anticuerpo secundario específico de la especie diluido en tampón de bloqueo durante 1-2 h.
   17. Enjuague los portaobjetos en 1x PBS durante 5 min. Repita 3 veces.
   18. Monte los portaobjetos usando 1x PBS/glicerol.
   19. Examine los portaobjetos con microscopía de fluorescencia.
4. Método alternativo para la tinción de mastocitos: tinción con azul de toluidina
   1. Preparar solución madre de azul de toluidina disolviendo 1 g de azul de toluidina O en 100 ml de etanol al 70%.
   2. Preparar una solución de cloruro de sodio (NaCl) al 1% disolviendo 0,5 g de NaCl en 50 ml de agua destilada. Mezclar para disolver. Ajuste el pH a aproximadamente 2.0-2.5 usando HCl.
      NOTA: Esta solución de NaCl debe hacerse fresca cada vez que se realicen manchas.
   3. Prepare la solución de trabajo azul de toluidina agregando 5 ml de solución madre de azul de toluidina a 45 ml de la solución de NaCl al 1%. Mezcle bien y asegúrese de que el pH sea de aproximadamente 2,3.
      NOTA: Un pH superior a 2,5 dará lugar a tinciones con menos metacromasia. Haga que esta solución sea fresca cada vez que se realice la tinción.
   4. Desparafinar secciones de 4-5 μm montadas en portaobjetos cargados positivamente, como se describe en los pasos 2.2.2-2.2.6. Lavar las secciones desparafinadas en agua corriente durante 2 min.
   5. Tiñe las secciones en una solución de trabajo azul de toluidina durante 2-3 min. Lavar en agua destilada durante 2 min.
   6. Deshidrata las secciones sumergiéndolas 10 veces en etanol al 95%. Portaobjetos de inmersión en etanol 100% 10x. Sumerja los portaobjetos en etanol fresco al 100% 10 veces más.
   7. Incubar los portaobjetos en un disolvente a base de d-limoneno durante 2 min. Incubar los portaobjetos en un segundo lote de disolvente a base de d-limoneno durante 2 min.
   8. Monte los cubreobjetos con un medio de montaje a base de xileno mientras el portaobjetos aún está húmedo con un solvente a base de d-limoneno.
      NOTA : No utilice un medio de montaje a base de agua.
   9. Examine los portaobjetos mediante microscopía de campo claro. Identificar los mastocitos por la presencia de gránulos de color púrpura oscuro en su citoplasma. Otros tipos de células se tiñen de azul claro.

4. Tinciones especiales para diagnosticar MPNST y descartar diagnósticos alternativos

1. El aspecto histológico de los MPNST humanos es muy variable y varios tipos de tumores diferentes tienen un aspecto similar al de los MPNST²⁸. Dado que los MPNST se derivan del linaje de las células de Schwann, se debe determinar si el tumor surge de un nervio periférico o dentro de una NP benigna existente mediante un examen macroscópico o un examen microscópico de campo claro de secciones teñidas con H y E. Aunque en ocasiones las MPNST no se encuentran asociadas con un nervio periférico o NP (por lo general, debido a la separación inadvertida del nervio durante la disección, la destrucción de la NP preexistente a través del crecimiento excesivo de la MPNST o porque la lesión es metastásica), busque la asociación del tumor con un nervio o NP, ya que el diagnóstico es menos probable si el tumor no está asociado con un nervio o NP.
2. Preparar secciones de 4-5 μm a partir de bloques de parafina que contengan posibles MPNST y montarlas en portaobjetos cargados positivamente, tal como se describe en el paso 2.2.1. Desparafinar las secciones como se describe en los pasos 2.2.2-2.2.6.
3. Realizar inmunohistoquímica con el panel de anticuerpos indicado en la Tabla 2 como se describe en los pasos 3.3.1-3.3.15.
4. Examinar las inmunotinciones mediante microscopía de campo claro. Dado que los MPNST demuestran diferenciación schwanniana, busque una inmunorreactividad uniforme o irregular para S100β, nestina y Sox10. Si los tumores no son positivos para estos tres marcadores, consultar el Cuadro 2 para establecer el diagnóstico.
   NOTA: Los MPNST humanos y de ratón pueden demostrar una diferenciación divergente. Por ejemplo, algunos MPNST humanos demuestran diferenciación rabdomioblástica focal (estas variantes se conocen como tumores malignos de Tritón); aunque estas neoplasias se tiñen para los marcadores de Schwann, también expresan marcadores musculares como desmina, MyoD1 y miogenina. La inmunorreactividad de estos últimos marcadores no debe disuadir a los investigadores de diagnosticar el tumor como MPNST. Aunque se han establecido múltiples modelos de ratón que expresan condicionalmente el gen de fusión SS18-SSX para modelar la patogénesis del sarcoma sinovial²⁹, hasta donde sabemos, no se conocen modelos de sarcoma sinovial que generen espontáneamente la transcripción de fusión equivalente. En consecuencia, no buscamos transcritos de fusión SS18-SSX en los tumores GEM y, en cambio, nos basamos en perfiles inmunohistoquímicos.

5. Clasificación de los MPNST

1. Determinar si hay necrosis tumoral, una característica distintiva de los MPNST de grado IV de la OMS. En el caso de los MPNST de grado IV, se debe buscar hipercelularidad prominente, actividad mitótica enérgica (≥4 mitosis por cada 10 campos de alta potencia (40x)) y atipia citológica.
   1. Si no hay necrosis, se debe evaluar el tumor para determinar si hay hipercelularidad, actividad mitótica enérgica y atipia citológica. Si todas estas características están presentes en ausencia de necrosis, clasifique el tumor como MPNST de grado III de la OMS.
   2. Los tumores de grado II de la OMS se caracterizan por un aumento de la celularidad, pero en menor grado que los MPNST de grado III y IV de la OMS. Los núcleos de las células tumorales en un MPNST de grado II de la OMS muestran un aumento de tamaño (más de 3 veces el tamaño de los núcleos de las células tumorales en los neurofibromas) e hipercromasia. El aumento de la actividad mitótica (<4 mitosis por cada 10 campos de alta potencia) se relaciona con los tumores de grado II de la OMS, pero no es un requisito para ellos.
      NOTA: Dado que los tumores de grado más alto suelen progresar a partir de los grados más bajos, es posible que haya regiones de grado bajo y de grado alto en el mismo MPNST. En esta circunstancia, el grado del tumor está determinado por la región de grado más alto presente.
      NOTA: Existe controversia entre los patólogos humanos en cuanto a si el sistema de clasificación de la OMS descrito anteriormente es predictivo de los resultados de los pacientes y algunos de estos patólogos prefieren simplemente clasificar los MPNST como de bajo grado o de alto grado. Bajo este esquema, los MPNST de alto grado tienen atipia citológica prominente, actividad mitótica enérgica (>5 mitosis por 10 campos de alta potencia) e hipercelularidad marcada con o sin necrosis. Los MPNST de bajo grado carecen de necrosis, pero muestran actividad mitótica, atipia citológica y celularidad intermedia entre un MPNST de alto grado y una neoplasia neurofibromatosa atípica con potencial biológico desconocido (ANNUBP). Preferimos el sistema descrito anteriormente porque distinguir entre un ANNUBP y un MPNST de bajo grado puede ser un desafío para los investigadores que no tienen una larga experiencia con estas entidades.

6. Preparación de cultivos decélulas MPNST P 0-GGFβ3 de paso temprano

1. Cultivo de células tumorales P 0-GGFβ3 de paso temprano a partir de una pieza tumoral fresca 2 (paso 1.5, Figura 1A). Mantenga las condiciones estériles a partir de este momento.
   1. Disociar el tumor cortándolo en trozos pequeños (2-4 mm) y picándolo en DMEM10 (medio esencial mínimo de Dulbecco) que contiene 10% de suero fetal de ternero, 2 μmol/L de forskolina y 10 nmol/L de neuregulina 1β (NRG1β) en placas de cultivo de tejidos de 100 mm.
   2. Deje que las células crezcan a partir de los fragmentos de tejido picado a 37 ^°C en 5% de CO₂ hasta que las placas sean confluentes. Cambie el medio cada 3-4 días.
   3. Divida el cultivo celular. Retire el medio del plato de 100 mm y lave las celdas con PBS; Retire y deseche el pañuelo picado. Retire el PBS y agregue 1 ml de tripsina al 0,25% durante 2-5 minutos a temperatura ambiente. Para promover el desprendimiento celular, golpee suavemente la placa y verifique si hay desprendimiento con un microscopio óptico; Extender la incubación de tripsina según sea necesario.
   4. Neutralizar la tripsina añadiendo 2 mL de DMEM10. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga y las celdas de gránulos a 500 × g durante 5 min. Retire el medio y agregue 5 ml de DMEM10 fresco al gránulo.
   5. Distribuya la suspensión de la celda en dos a cuatro platos de 100 mm que contengan DMEM10. No divida las células por más de cinco pasos (pasos 6.1.3 y 6.1.4) y manténgalas en DMEM sin forskolina y NRG1β. Recuerde congelar las celdas en el pasaje 2 para usarlas en el futuro.

7. Verificación de la identidad de las células MPNST de paso temprano mediante inmunocitoquímica

1. Coloque cubreobjetos de vidrio redondos estériles de 18 mm # 1.5 en los pocillos de las placas de cultivo de tejidos estériles de 6 pocillos.
   1. Coloque la solución de poli-L-lisina/laminina en los pocillos en un volumen suficiente para cubrir el cubreobjetos. Selle la placa con una envoltura de plástico para minimizar la evaporación. Incubar a 4 °C durante la noche. A la mañana siguiente, lave las cubreobjetos 3 veces con PBS estéril.
      NOTA: Hemos intentado colocar placas de células MPNST de paso temprano en cubreobjetos sin recubrimiento y hemos encontrado que las células no se adhieren bien en ausencia de recubrimiento de poli-L-lisina/laminina.
   2. Aplique 10,000 células en el cubreobjetos agregando suavemente 2 ml de la suspensión celular en el medio de crecimiento en cada pocillo que contenga el cubreobjetos. Incubar las placas durante la noche a 37 °C con 5% de CO₂ en una incubadora de cultivo de tejidos.
   3. A la mañana siguiente, enjuague los cubreobjetos durante 2 x 5 minutos con PBS.
   4. Fije las células con paraformaldehído al 4% en PBS durante 18 min a temperatura ambiente.
   5. Enjuague los cubreobjetos 3 x 5 min con PBS. Si lo desea, selle la placa con una película de plástico y guárdela a 4 °C en este punto.
   6. Hacer 50 mM de NH₄Cl frescos en PBS. Enfríe los aldehídos incubando cubreobjetos en 50 mM de NH₄Cl en PBS durante 10 min a temperatura ambiente.
   7. Permeabilizar las células incubando cubreobjetos en Triton X-100 al 0,3% en PBS durante 15 min a temperatura ambiente. Lave los cubreobjetos durante 3 x 5 minutos con PBS.
   8. Bloquee la unión inespecífica incubando cubreobjetos en tampón de bloqueo (1x PBS que contenga 1% de albúmina sérica bovina, 0,2% de leche en polvo descremada y 0,3% de Triton X-100) durante 1 h a temperatura ambiente.
   9. Retire el tampón de bloqueo y agregue anticuerpos primarios que reconozcan los marcadores MPNST presentes en el tumor principal (generalmente S100β, Nestin y Sox10) diluidos a la dilución óptima predeterminada en el tampón de bloqueo. Envuelva la placa con una película de plástico e incube a 4 °C durante la noche en una cámara humidificada.
   10. Lavar 3 x 5 min con PBS para eliminar el anticuerpo primario no unido. Añadir anticuerpo secundario marcado con fluorescencia diluido en tampón de bloqueo e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Protégete de la luz.
   11. Lavar 3 x 5 min con PBS. Incubar los cubreobjetos en 1-5 μg de tinte Hoechst durante 10 min. Continúe protegiéndolos de la luz.
   12. Lave los cubreobjetos con PBS durante 5 min. Monte los portaobjetos con PBS/glicerol 1:1 1x. Imagen con un microscopio fluorescente.

8. Aloinjerto de células tumorales de paso temprano para demostrar la tumorigénesis

1. Cultive células MPNST P 0-GGFβ3 de paso temprano en DMEM10 a 80% de confluencia. Enjuague las celdas una vez con una solución salina balanceada de Hanks (HBSS) a temperatura ambiente. Trate las células durante 30 s a 1 min con una solución de disociación celular no enzimática para eliminarlas del sustrato. Añadir 5 ml de DMEM10 por 1 ml de un reactivo de disociación celular no enzimática.
   NOTA: La disociación celular puede tardar mucho más, hasta 10-20 minutos. Consulte el protocolo del fabricante.
   NOTA: No cultive células hasta la confluencia, ya que esto reducirá la eficacia del injerto.
   1. Cuente las células con un hemocitómetro. Centrifugar las células a 5 × g durante 5 min y volver a suspenderlas a una concentración de 1-2 × 10⁶ células por cada 100 μL de DMEM10. Mantenga las células en hielo hasta que estén listas para la inyección.
   2. Anestesiar ratones NOD-SCIDγ (NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1wjl/SzJ) en la cámara de inducción de un vaporizador de isoflurano. Coloque al animal boca abajo y esterilice el lugar de la inyección con etanol al 70%. Deje que el sitio se seque al aire antes de la inyección. Antes de la inyección, deje que las células alcancen la temperatura ambiente.
   3. Inyectar 1-2 x 10⁶ células por vía subcutánea en el flanco derecho. Coloca al ratón solo en una jaula libre de ropa de cama y deja que se recupere. Asegúrese de que solo una parte de la jaula esté sobre una almohadilla térmica para evitar la hipotermia. Esto proporciona una zona a la que el mouse puede moverse si se sobrecalienta.
      NOTA: Injertamos un mínimo de tres ratones con cada cultivo de paso temprano, ya que es posible que algunos injertos no se realicen.
   4. Deje que el injerto crezca durante 15-60 días; Evalúe la salud animal 3 veces por semana y registre las puntuaciones de la condición corporal, incluido el peso y los cambios de comportamiento en cada examen. Terminar con los ratones que han alcanzado el tamaño máximo permitido del injerto o con los ratones moribundos mediante eutanasia con dióxido de carbono seguida de dislocación cervical. Registre la edad al morir en días. A medida que los tumores se vuelven visibles externamente, registre las dimensiones del tumor (largo, ancho y alto).
      NOTA: En nuestra experiencia, los diferentes cultivos de MPNST de paso temprano se injertan con una eficiencia variable y difieren en el tiempo requerido para el crecimiento del injerto. No se debe permitir que los animales avancen más allá del tamaño máximo permitido del tumor aprobado por la IACUC y/o el criterio de valoración humanitario.
2. Extraer el tumor, fijarlo en paraformaldehído al 4%, incrustarlo en parafina y realizar tinciones de H&E como se describe en las secciones 2.1-2.2.9 para verificar que el aloinjerto es un tumor y no un tejido reactivo. Si es necesario, inmunotiñir el injerto para los marcadores que estaban presentes en el tumor padre.

Results

La Figura 2 ilustra ejemplos de neoplasias de gran evidencia que surgen en ratones P 0-GGFβ3. Los tumores que son fácilmente identificables a simple vista pueden verse como masas que distienden regiones del cuerpo, como se muestra en la Figura 2A (flecha). Al determinar si la neoplasia es potencialmente un tumor de la vaina del nervio periférico, es esencial establecer que el tumor está asociado con un nervio periférico. En este caso, una resonancia magnética (Figura 2B) demuestra que el tumor está asociado con el nervio ciático (punta de flecha); Esta asociación se confirmó después de la eutanasia del ratón y la disección del tumor. Hay que tener en cuenta que un tamaño grande no indica necesariamente que el tumor sea maligno. En este caso, el examen histológico del tumor (Figura 2C) demostró que se trataba de un neurofibroma. Sin embargo, lo más común es que los tumores macroscópicamente evidentes no se identifiquen hasta que se realiza la necropsia del ratón. La Figura 2D ilustra un MPNST grande y carnoso que surgió dentro del plexo braquial de este animal.

La Figura 3 ilustra ejemplos representativos de MPNST y neurofibromas de ratones P 0-GGFβ3 preparados de acuerdo con los procedimientos descritos en la sección 1 del protocolo. La Figura 3A-J ilustra diez ejemplos de MPNST que surgen de forma independiente de nuestra colonia de ratones P_0-GGFβ3. Obsérvese que el aspecto histológico de las MPNST puede ser muy variable, incluso entre las MPNST que surgen de forma independiente en el mismo animal. Esta variabilidad histológica ilustra por qué confirmamos de forma rutinaria el diagnóstico de MPNST P 0-GGFβ3 con tinciones inmunohistoquímicas. También nos gustaría señalar que otros tipos de tumores, aparentemente no relacionados, ocurren esporádicamente con una baja frecuencia en algunas cepas de ratones endogámicos (por ejemplo, hemos encontrado varias veces linfomas en ratones P 0-GGFβ3 portadores del transgén en un fondo C57BL/6J), lo que enfatiza aún más la importancia de usar la inmunohistoquímica para confirmar los diagnósticos tumorales. A pesar de la variabilidad de su aspecto histológico, los diez tumores ilustrados en la figura 3A-J fueron inmunorreactivos para S100β y nestina y negativos para marcadores de otros tipos de tumores. La figura 3K ilustra una imagen representativa de una columna vertebral correctamente descalcificada y los tejidos asociados. Tenga en cuenta que la médula espinal, las raíces nerviosas, el cuerpo vertebral y el músculo esquelético mantienen su relación anatómica adecuada entre sí. La figura 3L es una imagen de mayor potencia del cuerpo vertebral y la médula espinal suprayacente. Dado que este tejido está correctamente descalcificado, el hueso se ha cortado fácilmente sin triturarse ni doblarse, y la médula ósea es fácilmente identificable en los espacios de la médula. Si el tejido no se hubiera descalcificado correctamente, se habría enganchado en la hoja del micrótomo y se habría arrancado de la sección, causando un daño significativo a los tejidos adyacentes (médula espinal, raíces nerviosas espinales y músculo esquelético). La Figura 3M presenta una imagen representativa de un neurofibroma que surge dentro de una raíz nerviosa dorsal en un ratón P 0-GGFβ3. Tenga en cuenta que este tumor es menos celular que los MPNST que se muestran en la Figura 3A-J. El diagnóstico clave para los neurofibromas es que están compuestos por una mezcla compleja de células de Schwann neoplásicas y mastocitos no neoplásicos, macrófagos, fibroblastos y elementos perineurales que se infiltran en el nervio y separan los axones.

La Figura 4 ilustra ejemplos de las tinciones que son más útiles para la identificación inicial de un neurofibroma plexiforme y la distinción entre un neurofibroma plexiforme y un MPNST. La figura 4A ilustra la inmunorreactividad de S100β en un neurofibroma plexiforme P 0-GGFβ3. Hay que tener en cuenta que la inmunorreactividad de S100β solo es evidente en una subpoblación de células, lo que concuerda con el hecho de que los neurofibromas están compuestos por una mezcla de células de Schwann neoplásicas y otros elementos no neoplásicos (fibroblastos, mastocitos, macrófagos, células perineurales, una población celular inmunorreactiva CD34 mal definida y vasculatura). Desafortunadamente, la tinción de S100β en parches no distingue entre neurofibromas plexiformes y MPNST, ya que la tinción de S100β puede ser irregular en los MPNST (la tinción de H&E es útil para este propósito; sin embargo, dado que los MPNST suelen ser más celulares que los neurofibromas plexiformes [consulte la Figura 3]). Las células neoplásicas de Schwann también son inmunorreactivas para el filamento intermedio nestina, como se demuestra en el MPNST P 0-GGFβ3 presentado en la Figura 4B. Las células neoplásicas de Schwann también suelen demostrar inmunorreactividad nuclear para el factor de transcripción Sox10, como se muestra en un MPNST en la Figura 4C. Las características útiles para distinguir entre los neurofibromas plexiformes y los MPNST son la presencia de mastocitos y la inmunorreactividad prominente para el marcador de proliferación Ki67. La figura 4D ilustra una tinción de Unna realizada en un neurofibroma plexiforme P 0-GGFβ3 para resaltar la presencia de mastocitos, que son fácilmente identificables por la prominente tinción violeta metacromática de sus gránulos citoplasmáticos. Los mastocitos no están presentes en los MPNST. Por el contrario, la inmunorreactividad de Ki67 es prácticamente inexistente en los neurofibromas plexiformes, como se observa en el tumor P 0-GGFβ3 que se muestra en la Figura 4E. El marcaje nuclear de Ki67 suele estar presente en una fracción muy alta de células tumorales, como se observa en el MPNST microscópico que surge en el ganglio trigémino de un ratón P 0-GGFβ3 (Figura 4F).

La Figura 5 ilustra ejemplos de las tinciones que realizamos para caracterizar completamente la composición celular de los neurofibromas en un modelo GEM recientemente desarrollado. Aunque las tinciones que se muestran en esta figura se obtuvieron en neurofibromas dérmicos humanos, son idénticas en apariencia a lo que hemos visto en los tumores GEM. La inmunorreactividad para CD117 (c-Kit) está presente en los mastocitos dentro de los neurofibromas y, por lo tanto, tiene una distribución muy similar a la observada con las tinciones de Unna (ver Figura 3A). Los macrófagos también están presentes dispersos en los neurofibromas, como se observa con el marcador panmacrófago Iba1 (véase la figura 5D); esto incluye subclases de macrófagos que son inmunorreactivos para CD163 y CD86 (ver Figura 5B y Figura 5C, respectivamente). Una fracción del elemento Schwanniano en los neurofibromas también demuestra inmunorreactividad nuclear para Sox10. Los fibroblastos pueden destacarse por su inmunorreactividad para el TCF4. En la Figura 5G, CD31 etiqueta los elementos vasculares dentro del neurofibroma, mientras que CD34, demostrado en la Figura 5H, etiqueta una enigmática población dendrítica de células que se ha sugerido que es una subpoblación de macrófagos de tejido residente³⁰ o una nueva población de células de la vaina nerviosa que no son ni células de Schwann ni fibroblastos³¹.

La figura 6 se incluye para permitir la comparación de los neurofibromas plexiformes humanos y los MPNST con los tumores observados en ratones P 0-GGFβ3 y para proporcionar ejemplos representativos de algunos de los tipos de tumores humanos que pueden confundirse con los MPNST. La figura 6A ilustra un neurofibroma plexiforme que surgió en el plexo braquial de un paciente con NF1. mientras que en la Figura 6B se presenta el MPNST grado IV de la OMS que surgió dentro de este mismo neurofibroma plexiforme. En la figura 6B se muestran algunos de los rasgos característicos de un MPNST de grado IV de la OMS, como la hipercelularidad marcada y la atipia celular, la actividad mitótica enérgica y la necrosis tumoral. A modo de comparación, la Figura 6C muestra un MPNST de grado II de la OMS que tiene atipia celular significativa, pero es menos hipercelular que el MPNST de grado IV y, aunque hay mitosis, demuestra menos actividad mitótica. La figura 6D ilustra un fibrosarcoma con su característico patrón de "espiga" de vainas entrelazadas de células tumorales. Sin embargo, este patrón no necesariamente distingue entre fibrosarcomas y MPNST, ya que algunos MPNST tendrán un patrón similar. Además, la vista de mayor potencia presentada en la Figura 6E muestra una morfología celular que es similar a la observada en el MPNST de grado IV de la OMS presentado en la Figura 6B. La figura 6F ilustra un leiomiosarcoma. A diferencia de la mayoría de los MPNST, los leiomiosarcomas son inmunorreactivos para marcadores musculares como la actina y la desmina del músculo liso. Sin embargo, la inmunorreactividad de la actina del músculo liso puede variar de un tumor a otro, ya que algunos tumores muestran una inmunorreactividad intensa y uniforme (Figura 6G) y otros muestran una inmunorreactividad que muestra variabilidad celular dentro del tumor (Figura 6H). La inmunorreactividad de la desmina también puede ser irregular en los leiomiosarcomas (Figura 6I). Los melanomas son muy variables en cuanto a su morfología, ya que algunos tumores están compuestos por células poligonales (Figura 6J) y otros por células fusiformes que pueden imitar la morfología de las células MPNST. Los melanomas se pueden distinguir de los MPNST por la inmunorreactividad de marcadores melanosomáticos como MART1 (Figura 6K). Sin embargo, los melanomas, al igual que los MPNST, con frecuencia son positivos para S100β y Sox10 (Figura 6L).

La Figura 7 ilustra las características patológicas de los MPNST de grado II, III y IV de la OMS aislados de ratones P0-GGFβ3. La Figura 8 muestra imágenes representativas de células MPNST P 0-GGFβ3 de paso temprano a baja (Figura 7A) y alta potencia (Figura 7B). La tumorigénesis de estas células se demuestra tanto por su capacidad para formar colonias cuando se suspenden en agar blando (Figura 7C) como para formar injertos cuando se aloinjertan por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes (Figura 7D).

Figura 1: Flujo de trabajo utilizado para procesar tumores y otros tejidos de ratones P 0-GGFβ3. (A) Los tumores macroscópicamente visibles se extraen y se segmentan en tres porciones para 1) la fijación en paraformaldehído al 4% seguido de inmunohistoquímica e histoquímica, 2) el establecimiento de cultivos celulares tumorales de paso temprano y/o análisis genómicos, y 3) la congelación instantánea utilizando nitrógeno líquido para el aislamiento de proteínas, ADN o ARN. (B) Después de la escisión del tumor, el cuerpo del ratón se fija en paraformaldehído al 4% y se extirpan los órganos internos. Se toman muestras de estos órganos para realizar un examen histológico que permita identificar evidencia microscópica de neoplasias y otros procesos patológicos. (C) Después de la extracción de los órganos internos, las extremidades (cabeza, extremidades, cola) y la piel se extraen de la canal. La columna vertebral, las costillas adyacentes y el músculo esquelético adyacente se descalcifican con EDTA 0,3 M/paraformaldehído al 4% (pH 8,0). A continuación, los tejidos descalcificados se incluyen en parafina y se preparan secciones de los tejidos para su examen inmunohistoquímico e histoquímico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imágenes representativas de neurofibromas macroscópicamente evidentes y MPNST en ratones P 0-GGFβ3. (A) Ratón P 0-GGFβ3 con un tumor grande y macroevidente en el flanco derecho (flecha). (B) Una resonancia magnética de este ratón muestra que el tumor está conectado al nervio ciático (punta de flecha) y que ha crecido a través de la fascia suprayacente para expandirse dentro de la subcutánea (flecha, masa tumoral a granel). (C) El examen microscópico de este tumor muestra que, a pesar de su gran tamaño, el tumor es un neurofibroma. (D) MPNST grande y carnoso que surgió en el plexo braquial de un ratón P 0-GGFβ3. Barra de escala = 100 μm. (C). Abreviaturas: MPNST = tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos; RM = imágenes por resonancia magnética. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes representativas de MPNST, columna vertebral descalcificada y neurofibromas preparadas como se describe en la sección 1 del protocolo. (A-J) Las MPNST de P 0-GGFβ3 extirpadas y teñidas con H&E muestran variabilidad histológica. Todas las imágenes son MPNST que surgen de forma independiente. A pesar de esta variabilidad histológica, todos estos tumores mostraron un etiquetado adecuado para los marcadores MPNST indicados en el Cuadro 1. Barras de escala = 200 μm. (K) Imagen representativa de una sección transversal de la columna vertebral descalcificada teñida con H&E. En esta imagen se visualizan fácilmente las siguientes estructuras: la médula espinal; hueso vertebral; los ganglios de la raíz dorsal en la raíz del nervio espinal dorsal; y músculo esquelético paravertebral. Aumento 4x. (L) Una imagen de mayor potencia de la médula espinal y las vértebras que se muestra en K demuestra el aspecto adecuado del hueso después de la descalcificación con esta metodología. Aumento 10x. (M) Imagen representativa de un neurofibroma de la raíz nerviosa dorsal en un ratón P_0-GGFβ3. Aumento 40x. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: MPNST = tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos; H&E = hematoxilina y eosina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Tinción diagnóstica utilizada para la identificación inicial de neurofibromas plexiformes y su distinción de MPNST. (A) Inmunotinciones para S100β en un neurofibroma plexiforme P 0-GGFβ3. Tenga en cuenta que la tinción marrón intenso para este antígeno solo está presente en un subconjunto de células de este tumor, lo que es coherente con el hecho de que los neurofibromas están compuestos por células de Schwann neoplásicas y muchos otros tipos de células no neoplásicas. (B) Imagen de inmunofluorescencia de un MPNST P 0-GGFβ3 teñido para el filamento intermedio nestina (rojo) y contrateñido con bisbenzimida (azul, tinción nuclear). (C) MPNST teñido para el factor de transcripción Sox10. La inmunorreactividad intensa (marrón) es evidente en los núcleos de un subconjunto de células tumorales. (D) Vista de alta potencia de un neurofibroma plexiforme P 0-GGFβ3 después de una tinción de Unna. Esta tinción produce una tinción metacromática (violeta) de los gránulos de los mastocitos. Los neurofibromas plexiformes se pueden distinguir de los MPNST porque estos últimos carecen de mastocitos. (E,F) Inmunohistoquímica de Ki67 en (E) un neurofibroma plexiforme P 0-GGFβ3 y (F) un MPNST P_0-GGFβ3. Ambas secciones se han contrateñido con hematoxilina (tinción nuclear azul), siendo evidente la inmunorreactividad de Ki67 como tinción nuclear marrón en estas tinciones de inmunoperoxidasa. Obsérvese que no se evidencia tinción nuclear marrón en el neurofibroma plexiforme, mientras que la mayoría de los núcleos de las células tumorales son positivos en el MPNST. Barras de escala = 100 μm. Abreviatura: MPNST = tumor maligno de la vaina del nervio periférico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Imágenes representativas de las inmunotinciones utilizadas para identificar las subpoblaciones de células que componen los neurofibromas. Estas imágenes inmunofluorescentes de un neurofibroma dérmico humano se han teñido para (A) CD117 (c-Kit; un marcador de mastocitos), (B) CD163 (macrófagos M2), (C) CD86 (macrófagos M1), (D) Iba1 (marcador panmacrófago), (E) Sox10 (marcador de células de Schwann), (F) TCF4 (marcador de fibroblastos), (G) CD31 (marcador de vasculatura) y (H) CD34 (marca una subpoblación distinta y poco conocida de células en neurofibromas). Aumento 60x, barras de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Imágenes representativas de neurofibromas plexiformes, MPNST y algunos otros tipos de tumores humanos que se consideran en el diagnóstico diferencial de un MPNST. (A) Neurofibroma plexiforme que surge en el plexo braquial de un paciente con NF1, que muestra la menor celularidad general y el aspecto benigno de esta neoplasia. Aunque no se visualiza fácilmente en secciones teñidas con H&E, está presente una mezcla compleja de tipos de células. Las mitosis no se ven. Aumento: 40x. (B) Un MPNST de grado IV de la OMS que surgió del neurofibroma plexiforme ilustrado en A. Nótese el grado mucho mayor de celularidad. La flecha indica una figura mitótica y el asterisco denota una región de necrosis tumoral en la parte superior derecha de este campo microscópico. Aumento: 40x. (C) Un MPNST de grado II de la OMS. Este tumor tiene un grado de celularidad menor que el MPNST grado IV de la OMS ilustrado en B. Sin embargo, hay más atipia nuclear e hipercromasia de lo que es evidente en el neurofibroma plexiforme ilustrado en A. La flecha indica una de las figuras mitóticas ocasionales que se encontraron en esta neoplasia. Aumento: 63x. (D) Una vista de baja potencia de un fibrosarcoma de tipo adulto que ilustra el patrón de "espiga" (las vainas entrelazadas de las células tumorales) que se observa típicamente en este tipo de tumor. Desafortunadamente, la arquitectura de espiga también se encuentra en algunos MPNST humanos y, por lo tanto, no se puede usar para distinguir entre fibrosarcomas y MPNST. Aumento: 20x. (E) Una vista de mayor potencia del fibrosarcoma ilustrado en D. Obsérvese la similitud entre la morfología celular de este fibrosarcoma y la morfología celular evidente en el MPNST de grado IV de la OMS que se muestra en B. Aumento: 40x. (F) Imagen de alta potencia de un leiomiosarcoma, que demuestra la morfología celular que cae dentro del rango de variación observado en los MPNST. Aumento: 40x. (G) Inmunotinciones para actina de músculo liso en el leiomiosarcoma ilustrado en F. Tenga en cuenta que las células tumorales muestran una inmunorreactividad intensa uniforme para este antígeno. Aumento: 40x. (H) Inmunotinciones para actina de músculo liso en un leiomiosarcoma diferente. En este tumor, existe una mayor variabilidad en el grado de inmunorreactividad, con algunas células que se tiñen más intensamente que otras. No es raro que la inmunorreactividad del mismo antígeno esté presente de manera uniforme en un tumor y que esté presente solo en un subconjunto de células tumorales en una neoplasia diferente. Aumento: 40x. (I) Inmunotinción para desmina en un tercer leiomiosarcoma. En este tumor, solo un subconjunto de células tumorales es intensamente inmunorreactivo para este antígeno. (J) Melanoma metastásico. Los melanomas son conocidos por tener una morfología muy variable que puede variar desde cuboidal hasta fusiforme; es más probable que los tumores con esta última morfología se confundan con los MPNST, sobre todo teniendo en cuenta que tanto los melanomas como los MPNST pueden demostrar inmunorreactividad a S100β y Sox10. Aumento: 40x. (K) Inmunorreactividad para el marcador de melanoma MART1 en el tumor ilustrado en J. Aumento: 40x. (L) Inmunorreactividad nuclear para el factor de transcripción Sox10 en el melanoma que se muestra en J. Aumento: 40x, barras de escala = 100 μm. Abreviatura: MPNST = tumor maligno de la vaina del nervio periférico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Imágenes representativas de MPNST de grado II-IV P 0-GGFβ3 de la OMS. (A) Fotomicrografías de baja y (B) alta potencia de un MPNST de grado II de la OMS. Obsérvese que la celularidad es inferior a la MPNST de grado III de la OMS ilustrada en el panel C y que los núcleos de las células tumorales en D son más hipercromáticos (más oscuros) que los observados en el panel B. (C) Fotomicrografías de baja y (D) alta potencia de un MPNST de grado III de la OMS. Este tumor mostró >4 figuras mitóticas por cada 10 campos de alta potencia, con células más densamente empaquetadas y núcleos atípicos más hipercromáticos. (E) Vistas de baja y (F) alta potencia de un MPNST de grado IV de la OMS. Obsérvese el foco de necrosis en la parte inferior central del panel F. Baja potencia = 20x. Alta potencia = 40x, barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Imágenes representativas de las células MPNST P 0-GGFβ3 de paso temprano y su tumorigenicidad demostrada por el crecimiento en agar blando y su capacidad para crecer como aloinjertos. (A) Imágenes de contraste de fase de baja y (B) alta potencia de células MPNST P_0-GGFβ3 de paso temprano. (C) Células P 0-GGFβ3 MPNST cultivadas en agar blando y teñidas con negro de Sudán; Las colonias son evidentes como puntas negras en el agar. (D) Imagen teñida con hematoxilina y eosina de un tumor que se formó después de que las células MPNST P 0-GGFβ3 se injertaron por vía subcutánea en un ratón inmunodeficiente, como se describe en el protocolo. (E) Proliferación de células MPNST P 0-GGFβ3 de paso temprano durante un período de 5 días según lo determinado por un citómetro de imagen Celigo. Baja potencia = 10x, alta potencia = 40x; barra de escala = 100 μm para todos los paneles Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre	Uso	Reactividad/Clase de Especie
CD117	Prediluido	monoclonal de conejo
CD163	1:200	monoclonl de ratón
CD31	1:50	policlonal de conejo
CD34	1:2000	monoclonal de conejo
CD86	1:1000	monoclonal de conejo
Citoqueratina	1 μg/mL	monoclonal de ratón
Desmin	1:50	monoclonal de ratón
Iba1	1:500	conejo policlonal
Ki-67	1:50	monoclonal de conejo
MART1	1 μg/mL	monoclonal de ratón
Nestin	1:1,000	monoclonal de ratón
PMEL	1:100	Rabbot monoclonal
S100B	1:200	policlonal de conejo
SMA	1:100	monoclonal de ratón
Sox10	1:10	monoclonal de ratón
TCF4/TCFL2	1:100	monoclonal de conejo

Tabla 1: Anticuerpos utilizados para el diagnóstico de neurofibroma plexiforme y tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos. Anticuerpos utilizados para la identificación rutinaria de neurofibromas plexiformes GEM (S100β, Sox10, CD117, Ki67), el diagnóstico de MPNST y una evaluación completa de otros tipos celulares presentes en los neurofibromas. Abreviatura: MPNST = tumor maligno de la vaina del nervio periférico.

		S100β	Nestin	Sox10	MART1	PMEL	Desmin	Actina del músculo liso	Citoqueratina	SS18-SSX Fusión
MPNST		50-90%, generalmente focal	Positivo1	~30%	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo
Fibrosarcoma		Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo
Leiomyosarcoma		Raro	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	50-100%	Positivo	~40%	Negativo
Sarcoma epiteloide		Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Positivo	Negativo
Melanoma		Positivo	Positivo	85%	Positivo	Positivo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo
Sarcoma sinovial monofásico		~30%	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Positivo	Positivo

Tabla 2: Marcadores utilizados para establecer la identidad tumoral en humanos. Estos marcadores inmunohistoquímicos e histoquímicos, junto con una evaluación de la morfología microscópica del tumor, se utilizan para distinguir las MPNST de otras neoplasias que las imitan. El diagnóstico diferencial que se suele considerar para los MPNST humanos incluye fibrosarcoma de tipo adulto, sarcoma epiteloide, leiomiosarcoma, sarcoma sinovial monofásico y melanoma. Los fibrosarcomas de tipo adulto tienen un patrón microscópico de espiga y tinción para vimentina, pero no para S100β. Los leiomiosarcomas, pero no los MPNST, son inmunorreactivos para la desmina; Los leiomiosarcomas también tienen núcleos con una morfología notablemente roma. Los sarcomas epitloides, pero no los MPNST, son inmunorreactivos para la citoqueratina. Los melanomas, al igual que los MPNST, pueden ser S100β positivos, pero también son inmunorreactivos para MART-1 y PMEL. Abreviatura: MPNST = tumor maligno de la vaina del nervio periférico. ¹La combinación de S100β y nestina es altamente predictiva de MPNST.

Discussion

Los métodos histológicos y bioquímicos presentados aquí proporcionan un marco para el diagnóstico y la caracterización de los modelos GEM de neurofibroma y patogénesis MPNST. A lo largo de los años, hemos encontrado que estas metodologías son de gran utilidad para evaluar la patología de los tumores de la vaina de los nervios periféricos que surgen en los modelos GEM 21,25,26. Sin embargo, si bien los protocolos descritos aquí son útiles para determinar la precisión con la que los tumores en los modelos GEM recapitulan la patología de sus contrapartes humanas, existen algunas limitaciones de estas estrategias que deben apreciarse. Para empezar, los ratones P 0-GGFβ3 muestran una penetrancia casi completa de su fenotipo tumoral, lo que hace relativamente fácil obtener un gran número de ratones con neurofibromas y MPNST 21,25,26 que puedan ser utilizados para estudios genómicos y cribados de shRNA a escala genómica. La alta penetrancia del fenotipo en este modelo también hace que los ratones P 0-GGFβ3 sean bastante útiles para ensayos preclínicos. Sin embargo, debe reconocerse que este no será el caso de todos los modelos de cáncer GEM. Esta es la razón por la que hemos enfatizado la importancia de determinar la fracción de animales que se puede predecir que desarrollarán tumores. Cuando se trabaja con un modelo animal que desarrolla tumores con menos frecuencia, hemos encontrado ventajoso utilizar modalidades de imagen como la resonancia magnética o la tomografía por emisión de positrones para identificar definitivamente a los animales portadores de tumores que pueden ser incluidos en ensayos preclínicos u otros estudios. Sin embargo, este enfoque puede tener un costo prohibitivo si se requieren escaneos repetidos. Es por ello que también se hizo hincapié en la importancia de establecer el tiempo medio de supervivencia del modelo GEM de interés^{26-comprender} cuándo se puede esperar que un animal desarrolle un tumor reduce el número de exploraciones que se requieren para identificar a los animales con el fenotipo deseado y los costes asociados.

También es importante reconocer que un tumor grande en un ratón sigue siendo en realidad una cantidad bastante pequeña de tejido. En este protocolo, recomendamos un proceso en el que el tejido tumoral se divide en tercios, con porciones dedicadas a la histología/inmunohistoquímica, el establecimiento de cultivos celulares de paso temprano y el aislamiento de biomoléculas (proteínas, ARN, ADN) de interés. Sin embargo, el tamaño del tumor variará y si el tumor es bastante pequeño, esto puede impedir tener suficiente tejido para dividirse de esta manera. En ese caso, el investigador debe determinar si se prioriza el diagnóstico del tumor u otro uso del tejido tumoral³². En esas circunstancias, nuestro sesgo es que debemos tener un diagnóstico adecuado para entender con qué estamos trabajando antes de embarcarnos en otros experimentos. Hemos encontrado que los diagnósticos tumorales generalmente se pueden establecer fácilmente utilizando menos de un tercio de la neoplasia. Cuando se trata de tumores pequeños, normalmente extraemos un pequeño fragmento de tejido tumoral, lo envolvemos en tejido histológico y lo colocamos en un casete de tejido para asegurarnos de que el tejido no se pierda durante el procesamiento. La desventaja de este enfoque es que puede hacer que el investigador subcalifique la neoplasia si se desea clasificar con la OMS; Esto se debe a que en los cánceres suelen coexistir regiones de grado inferior y superior y, si se toma una muestra muy pequeña, el grado obtenido dependerá del lugar de donde se haya extraído la muestra tumoral.

Los protocolos que describimos para establecer la identidad tumoral de la vaina de los nervios periféricos se basan en gran medida en la inmunohistoquímica. Si bien existen enfoques alternativos ocasionales que se pueden usar para algunos tipos de células (p. ej., realizar tinciones de Unna para identificar mastocitos), esto no es uniformemente cierto para la mayoría de los tipos de células presentes en los neurofibromas y MPNST. En consecuencia, se debe tener mucho cuidado para establecer que los procedimientos inmunohistoquímicos que se utilizarán se han optimizado adecuadamente. En nuestra experiencia, hay varios problemas que pueden comprometer la inmunohistoquímica diagnóstica. Es de vital importancia que el investigador realice una serie de dilución con un anticuerpo primario que no haya utilizado antes; Además, se debe realizar una serie dilucional cuando se utiliza un nuevo lote de un anticuerpo que ha sido previamente optimizado³³. También se debe tener cuidado para asegurarse de que haya nuevos lotes de reactivos a mano. En nuestra experiencia, cuando envejecen, el peróxido de hidrógeno y el DAB son particularmente propensos a no funcionar correctamente, lo que puede llevar al investigador a decidir inadecuadamente que sus tinciones son negativas.

Los perfiles inmunohistoquímicos que describimos para los neurofibromas plexiformes, los MPNST y los diversos tipos de neoplasias que se consideran en el diagnóstico diferencial de los MPNST son los que hemos encontrado con mayor frecuencia 21,25,26,34. Sin embargo, como la diferenciación divergente no es infrecuente en las MPNST y en estas otras neoplasias malignas, el investigador puede encontrar perfiles de tinción que difieren un poco de lo que describimos aquí. Estos matices son la razón por la que recomendamos encarecidamente que el equipo que caracteriza un nuevo modelo GEM de tumorigénesis incluya a un patólogo humano o veterinario experimentado. En este protocolo, hemos aplicado la clasificación de la OMS a los GEM y a los MPNST humanos. Preferimos este sistema de clasificación porque los criterios de clasificación están relativamente bien definidos y son fáciles de comparar entre los MPNST humanos y de ratón ^2,28. Cabe señalar, sin embargo, que los criterios de clasificación de la OMS no son aceptados uniformemente por los patólogos. Esto se debe a que no está claro que los tres grados de la OMS que se aplican a los MPNST sean predictivos de los resultados clínicos en los pacientes. Debido a eso, muchos patólogos prefieren clasificar las MPNST simplemente como neoplasias malignas de bajo o alto grado. Con este abordaje, alrededor del 85 % de las MPNST se consideran neoplasias malignas de grado alto caracterizadas por actividad mitótica enérgica, atipia celular marcada e hipercromasia que puede acompañarse de necrosis tumoral. Los MPNST de bajo grado muestran menos celularidad, hipercromasia y actividad mitótica.

Hemos encontrado que el aloinjerto de células MPNST de paso temprano es un medio sencillo de verificar la tumorigénesis de estos cultivos. Sin embargo, se deben considerar algunas cuestiones cuando las células no establecen un aloinjerto³². En nuestra experiencia, si bien la abrumadora mayoría de las células MPNST de paso temprano establecerán un aloinjerto, ocasionalmente hemos encontrado cultivos de pasaje temprano que no lo hacen. A pesar de este fracaso, la hibridación genómica comparativa de matrices (aCGH) y la secuenciación del exoma completo demostraron que estos cultivos de paso temprano tenían múltiples anomalías genómicas consistentes con que eran células tumorales^25,26. También hemos encontrado cultivos de paso temprano que no son saludables, generalmente porque se permitió que los cultivos se volvieran confluentes antes de cosecharlos para injertos. Las células dañadas por un manejo brusco (p. ej., incubadas demasiado tiempo con una solución de disociación celular no enzimática pipeteada hacia arriba y hacia abajo un número excesivo de veces) también tienen un rendimiento deficiente cuando se injertan. También cabe señalar que los tiempos que hemos indicado para el establecimiento de la injerta son una estimación basada en nuestra experiencia. En ocasiones, nos hemos encontrado con culturas de paso temprano que establecerán aloinjertos con éxito, pero tardan más tiempo en hacerlo.

Los enfoques descritos anteriormente proporcionan un medio integral para caracterizar los aspectos clave de un modelo GEM recientemente desarrollado de neoplasia del sistema nervioso periférico y diagnosticar adecuadamente cualquier neurofibroma y MPNST que desarrollen estos animales. Los métodos que describimos para establecer cultivos de MPNST de paso temprano y usar estos cultivos para aloinjertos también proporcionan evidencia clara de la tumorigénesis de las neoplasias identificadas en los modelos GEM. Quisiéramos enfatizar que no estamos realizando la selección de clones individuales cuando establecemos cultivos de paso temprano. Aunque reconocemos que cierta selección es inevitable cuando se colocan células tumorales en cultivos, estos hallazgos iniciales sugieren que las mutaciones identificadas en los cultivos de MPNST de GEM de paso temprano siguen siendo muy similares a las presentes en el tumor original. Sin embargo, mediante el uso de aCGH, también hemos encontrado que continuar con estos cultivos de pasaje temprano para pasajes más prolongados da como resultado cambios genómicos que comienzan a divergir de lo que se observa en los pasajes anteriores de estas células tumorales.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placas de cultivo de tejidos de 100 mm	Corning Falcon	353003
3, 3'- Diaminobensidina (DAB)	Vector Laboratories	SK-400
Placas de 6 pocillos	Corning Costar	3516
Ácido Acético	Fisher Scientific	A38-212
Alexa Fluor 488 Secundario (Cabra Anti-Ratón)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 568 Secundario (Anti-Ratón de Cabra)	Invitrogen	A21043 o A11004
Alexa Fluor 568 Secundario (Anti-Conejo de Cabra)	Invitrogen	A11036
Cloruro de amonio (NH4Cl)Kit de ensayo de	Fisher Scientific	A661-500
BCA	Albúmina
	Fisher Scientific	BP1600-100
Caldesmon	ABCAM	E89, ab32330
CD117	Marca de celda	117R-18-ASR
CD163	Leica	NCL-L-CD163
CD31	ABCAM	ab29364
CD34	ABCAM	ab81289
CD86	ABCAM	ab53004
Raspador de células	Sarstedt	83.183
Separador de células	Corning	25-056-CI
Cubreobjetos circulares	Fisher Scientific	12-545-100
Citrisolve Híbrido (disolvente a base de d-limoneno)	Decon Laboratories	5989-27-5
Ácido crítico	Fisher Scientific	A104-500
Citoqueratina	ABCAM	C-11, ab7753
Desmin	Agilent Dako	clon D33 (M0760)
Diaminobensizdina (DAB)	Solución Vector Laboratories	SK-4100
DMEM	Corning	15-013-CV
Eosina Y	Thermo Scientific	7111
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Fetal Calf Serum	Omega Scientific	FB-01
Forksolin	Sigma-Aldrich	F6886
Glicerol	Sigma-Aldrich	G6279
Hank's Solución salina equilibrada (HBSS)	Corning	21-022-CV
Harris Hematoxilina	Fisherbrand	245-677
Hemacitómetro	Brightline-Hauser Scientific	1490
Ácido clorhídrico	Fisher Scientific	A144-212
Peróxido de hidrógeno	Fisher Scientific	327-500
Iba1	Wako Chemicals	019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidasa) Kit de polímero	Mouse on Mouse Vector Laboratories	MP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidasa) Kit de polímero, Horse Anti-Rabbit	Vector Laboratories	MP-7401
Incubadora	Thermo Scientific	Heracell 240i Incubadora
Isoflurano	Piramal	NDC 66794-017-25
Isopropanol	Fisher Scientific	A415
Ki-67	Cell Signaling	12202
Laminina	Thermo Fisher Scientific	23017015
Nitrógeno líquido
MART1	ABCAM	M2-9E3, ab187369
Microtomo
Nestin	Millipore	Humano: MAD5236 (10C2), Humano:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 beta	Hecho internamente	por S.L.C. (también disponible como 396-HB-050/CF de R& D Systems)
Neurofibromin	Santa Cruz Biotechnology	SC-67
ASINTIÓ. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ ratones	Jackson Laboratory	5557
Leche en polvo descremada	Walmart	Marca
P0-GGFβ 3 ratones	Cera
	Leica	Paraplast 39601006
Parafilm M	Sigma-Aldrich	PM-999
Paraformaldehído (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
Permount (medio de montaje de xileno)	Fisher Scientific	SP15-100
Medidor de pH	Mettler Toldedo	Seven Excellence, 8603
solución salina tamponada con fosfato (Dulbecco's)	Corning	20-031-CV
PMEL	ABCAM	EP4863(2), ab137078
Hidrobromuro de poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P5899-5MG
Máquina de isoflurancia portátil			anestesia inhalatoria
PVA-DABCO (medio de montaje acuoso)	Millipore Sigma	10981100ML
Olla arrocera	Haya Hamilton
S100B	Agilent Dako	Z0311  (ahora GA504)
SMA	Ventana Medical Systems	clon 1A4
Cloruro de sodio	Fisher Scientific	S640
Citrato de sodio (dihidratado)	Fisher Scientific	BP327-1
Sox10	ABCAM	ab212843
			de histología de acero
Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio	Fisher Scientific	12-550-15
TCF4/TCFL2	Señalización celular	(CH48H11) #2569
Casete
Azul Toluidina	ACROS Organics 348600050
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
TRIzol	Invitrogen	15596026
Tripsina	Corning	25-051-31