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Artículo de método

Identificación, diagnóstico y clasificación de tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos en modelos de ratón modificados genéticamente

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DOI:

10.3791/65740

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17 de mayo de 2024

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1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina

En este artículo

Resumen

Hemos desarrollado una metodología para evaluar si las neoplasias del sistema nervioso en ratones modificados genéticamente recapitulan con precisión la patología de sus homólogos humanos. Aquí, aplicamos estas técnicas histológicas, criterios patológicos definidos y metodologías de cultivo a neurofibromas y tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos que surgen en el modelo de ratón P 0-GGFβ3.

Resumen

Los pacientes con neurofibromatosis tipo 1 (NF1) del síndrome de susceptibilidad tumoral autosómica dominante suelen presentar neurofibromas plexiformes (NP) que posteriormente se transforman en tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos (MPNST) muy agresivos. La comprensión del proceso por el cual una NP se transforma en una MPNST se vería facilitada por la disponibilidad de modelos de ratón modificados genéticamente (GEM) que replican con precisión la progresión de la NP-MPNST observada en humanos con NF1. Desafortunadamente, los modelos GEM con ablación de Nf1 no recapitulan completamente este proceso. Esto nos llevó a desarrollar ratones P 0-GGFβ3, un modelo GEM en el que la sobreexpresión del mitógeno de la célula de Schwann neuregulina-1 (NRG1) en las células de Schwann da lugar al desarrollo de NPs que progresan hasta convertirse en MPNSTs con alta frecuencia. Sin embargo, para determinar si la tumorigénesis y la progresión neoplásica en ratones P 0-GGFβ3 modelan con precisión los procesos observados en pacientes con NF1, primero tuvimos que demostrar que la patología de los tumores de la vaina del nervio periférico P0-GGFβ3 recapitula la patología de sus homólogos humanos.

En este trabajo se describen las metodologías especializadas utilizadas para diagnosticar y clasificar con precisión las neoplasias del sistema nervioso periférico en modelos GEM, utilizando P 0-GGFβ3 y P0-GGFβ3; Trp53+/- ratones como ejemplo. Describimos los métodos histológicos, inmunohistoquímicos e histoquímicos utilizados para diagnosticar NP y MPNST, cómo distinguir estas neoplasias de otros tipos de tumores que imitan su patología y cómo clasificar estas neoplasias. Discutimos el establecimiento de cultivos de paso temprano a partir de MPNST GEM, cómo caracterizar estos cultivos mediante inmunocitoquímica y cómo verificar su tumorigénesis mediante el establecimiento de aloinjertos. En conjunto, estas técnicas caracterizan la patología de las NP y MPNST que surgen en los modelos GEM y comparan críticamente la patología de estos tumores murinos con sus homólogos humanos.

Introducción

Durante las últimas tres décadas, numerosos laboratorios han intentado crear modelos de ratón de cánceres humanos mediante la introducción de mutaciones asociadas al cáncer humano en el genoma del ratón o mediante la sobreexpresión de un producto génico que se sobreexpresa en los cánceres humanos. Los modelos de ratón modificados genéticamente (GEM) resultantes se pueden utilizar para una variedad de propósitos, como establecer que la modificación genómica recién introducida inicia la tumorigénesis, identificar otros cambios genéticos o epigenéticos que ocurren posteriormente y que contribuyen a la progresión tumoral y definir las vías de señalización clave que impulsan el inicio y la progresión del tumor. A diferencia de los modelos de xenoinjertos ortotópicos, que se basan en el uso de ratones inmunodeficientes, los modelos de cáncer GEM tienen un sistema inmunitario completamente funcional y, por lo tanto, modelan con mayor precisión las respuestas a los agentes terapéuticos candidatos. Sin embargo, cuando se utilizan modelos de cáncer GEM para fines como estos, es esencial que los investigadores confirmen que las observaciones realizadas con las neoplasias GEM son relevantes para sus contrapartes humanas. Esta validación debe incluir una evaluación exhaustiva de la patología de las neoplasias GEM y la determinación de si las características patológicas de las neoplasias GEM recapitulan la patología del tipo de tumor humano correspondiente.

El síndrome de susceptibilidad tumoral neurofibromatosis tipo 1 (NF1) es la enfermedad genética más común que afecta al sistema nervioso humano, ocurriendo en aproximadamente 1 de cada 3.000-3.500 nacidos vivos 1,2,3. Las personas afectadas por NF1 desarrollan múltiples tumores benignos de la vaina de los nervios periféricos conocidos como neurofibromas en la piel (neurofibromas dérmicos) y en los nervios grandes y plexos nerviosos (neurofibromas plexiformes). Mientras que tanto los neurofibromas dérmicos como los plexiformes empeoran la calidad de vida del paciente al producir deterioro físico, conductual y/o social, los neurofibromas plexiformes (NP) son particularmente peligrosos 4,5. Esto se debe a que las NP se transforman con frecuencia en tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos (MPNST), que son neoplasias agresivas de células fusiformes con una tasa de supervivencia excepcionalmente baja 1,2. En gran parte, esta baja tasa de supervivencia se debe a que los regímenes radioterapéuticos y quimioterapéuticos que se usan actualmente para tratar las MPNST son ineficaces. Sin embargo, el desarrollo de terapias nuevas y más efectivas ha sido un desafío. Esto se debe a que, a pesar de la frecuencia con la que se presentan las MPNST en pacientes con NF1, siguen siendo neoplasias raras. Como resultado, es muy difícil obtener un gran número de tumores humanos para su estudio; también es difícil reclutar suficientes pacientes con MPNST para ensayos clínicos. Para superar estas limitaciones, se han generado varios modelos GEM con el objetivo de obtener más información sobre las anomalías que impulsan la patogénesis del neurofibroma y la progresión de la NP-MPNST y facilitar los ensayos preclínicos con agentes terapéuticos candidatos.

Los pacientes con NF1 tienen mutaciones inactivadoras en una copia del gen NF1. La patogénesis del neurofibroma se desencadena cuando se produce una mutación inactivadora en el gen NF1 funcional restante en una célula del linaje celular de Schwann. Sorprendentemente, sin embargo, cuando los ratones fueron generados con mutaciones Nf1 inactivadoras de la línea germinal, no desarrollaron neurofibromas 6,7. La demostración posterior de que los ratones con células de Schwann nulas de Nf1 y haploinsuficiencia de Nf1 en todos los demás tipos de células (Krox20-Cre;Los neurofibromas plexiformes desarrollados por Nf1 flox/- desarrollaron neurofibromas sugirieron que se requería una dosis reducida del gen Nf1 en otros tipos celulares para la patogénesis del neurofibroma8. Incluso entonces, los neurofibromas plexiformes en Krox20-Cre; Los ratones Nf1 flox/- no progresaron hasta convertirse en MPNST y, por lo tanto, solo imitaron parcialmente la biología de sus contrapartes humanas. La patogénesis de MPNST se produjo cuando las mutaciones en Nf1 se asociaron con mutaciones en genes supresores de tumores adicionales, como Trp539 o Cdkn2a10, pero las MPNST en estos modelos GEM se desarrollaron de novo o a partir de neoplasias neurofibromatosas atípicas de potencial biológico incierto (ANNUBP)11,12, en lugar de a partir de neurofibromas plexiformes benignos preexistentes (ver13,14 para excelentes revisiones de estos modelos, así como de otros modelos que introducen mutaciones adicionales de pérdida de función asociadas a MPNST en genes como Suz12 y Pten15).

Estos modelos de ratón han sido muy valiosos para establecer el papel que desempeñan genes como NF1, TP53 y CDKN2A en la patogénesis de las neoplasias del sistema nervioso periférico asociadas a NF1 y para los ensayos preclínicos que prueban agentes terapéuticos candidatos. Sin embargo, todavía tenemos una comprensión incompleta del proceso por el cual los neurofibromas plexiformes progresan para convertirse en neoplasias neurofibromatosas atípicas de potencial biológico incierto (ANNUBPs16) y luego MPNST. Recientemente se han hecho algunos progresos en la comprensión de este proceso con el reciente informe de que los ratones con deleciones en Nf1 y Arf desarrollan ANNUBP que progresan hasta convertirse en MPNST11. Sin embargo, aún no existen modelos de ratón basados en mutaciones Nf1 que recapitulen completamente el proceso de progresión del neurofibroma plexiforme-MPNST observado en humanos. Además, no está claro si existen múltiples vías distintas que conducen al desarrollo de MPNST. Teniendo en cuenta esto, es posible que los GEM descritos anteriormente solo modelen un subconjunto de varias vías diferentes que conducen a la progresión del neurofibroma-MPNST y a la patogénesis de MPNST. Este punto se ve enfatizado por el hecho de que las MPNST también ocurren esporádicamente y que algunas MPNST esporádicas aparentemente no tienen mutaciones en NF1 17,18.

Aunque este último punto ha sido cuestionado por la reciente sugerencia de Magollon-Lorenz et al. de que al menos algunos MPNST esporádicos que carecen de mutaciones NF1 son melanomas o un tipo diferente de sarcoma19, recientemente hemos informado de un MPNST esporádico y una línea celular derivada de este tumor (células 2XSB) que era NF1 de tipo salvaje20. Durante la caracterización del tumor progenitor y de la línea celular 2XSB, descartamos sistemáticamente posibilidades diagnósticas alternativas, incluyendo el melanoma y los múltiples otros tipos de sarcoma que se consideran rutinariamente en el diagnóstico diferencial de un tumor maligno esporádico de la vaina del nervio periférico20. Además, observamos que Magollon-Lorenz et al. reconocieron que sus hallazgos en las tres líneas celulares esporádicas de MPNST que estudiaron no podían generalizarse para indicar que todos los tumores identificados como MPNST esporádicos no son MPNST.

Para construir un modelo GEM en el que el neurofibroma y la patogénesis de MPNST no dependieran necesariamente de mutaciones específicas de genes supresores de tumores, generamos ratones transgénicos en los que la sobreexpresión del potente mitógeno de la célula de Schwann, la neuregulina-1 (NRG1), fue impulsada por el promotor de la proteína de mielina cero (P0) específica de la célula de Schwann (ratones P 0-GGFβ3)21. Hemos demostrado previamente que los neurofibromas humanos, las MPNST y las líneas celulares MPNST expresan varias isoformas de NRG1 junto con las tirosina quinasas del receptor erbB (erbB2, erbB3 y erbB4) que median la señalización de NRG1 y que estos receptores erbB se activan constitutivamente22. También hemos demostrado que los inhibidores farmacológicos de las quinasas erbB inhiben potentemente la proliferación de MPNST22, la supervivencia23 y la migración24. De acuerdo con nuestras observaciones en humanos, los ratones P 0-GGFβ3 desarrollan neurofibromas plexiformes25 que progresan hasta convertirse en MPNST con una alta frecuencia21,25. Hemos demostrado que las MPNST P 0-GGFβ3, al igual que sus contrapartes humanas, comúnmente desarrollan mutaciones de Trp53 y Cdkn2a, así como muchas otras anomalías genómicas que potencialmente contribuyen a la tumorigénesis25. Las MPNST que surgen en ratones P 0-GGFβ3 no tienen mutaciones inactivadoras en Nf1. Sin embargo, utilizando la complementación genética, demostramos que NRG1 promueve la tumorigénesis en ratones P 0-GGFβ3 predominantemente a través de las mismas cascadas de señalización que se ven alteradas por la pérdida de Nf1 26; esta conclusión se basa en nuestro hallazgo de que la sustitución de la sobreexpresión de NRG1 por la pérdida de Nf1 en presencia de haploinsuficiencia de Trp53 (P 0-GGFβ3;Trp53+/- ratones) produce animales en los que las MPNST se desarrollan de novo, como se observa en cis-Nf1+/-; Ratones Trp53+/- 27.

Para obtener esta y otra información que demuestre que los ratones P 0-GGFβ3 modelan con precisión los procesos de patogénesis del neurofibroma y la progresión del neurofibroma-MPNST observados en humanos con NF1, hemos desarrollado metodologías especializadas para procesar tejidos de estos animales, diagnosticar con precisión sus tumores, clasificar los MPNST que surgen en estos ratones, establecer y caracterizar el paso temprano de P0-GGFβ3 y P0-GGFβ3; Trp53+/- cultivos de MPNST y comparación crítica de la patología de P 0-GGFβ3 NPs y MPNSTs y P0-GGFβ3; Trp53+/- MPNST a la de sus homólogos humanos. Muchas de estas metodologías son generalizables a otros modelos GEM de neoplasia del sistema nervioso. Además, varias de estas metodologías son aplicables de manera más amplia a los modelos GEM en los que las neoplasias surgen en otros sitios de órganos. En consecuencia, aquí presentamos una descripción detallada de estas metodologías.

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Protocolo

Los procedimientos descritos aquí fueron aprobados por la IACUC de la Universidad Médica de Carolina del Sur y fueron realizados por personal debidamente capacitado de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y las pautas institucionales de cuidado de animales de MUSC.

1. Determinación de la penetrancia tumoral y la supervivencia en ratones P 0-GGFβ3 e identificación de tumores en estos animales para su posterior caracterización

  1. Generar la cohorte de ratones que serán evaluados para tumorigénesis. El número de ratones necesarios depende de la penetrancia del fenotipo tumoral. Para compensar pérdidas como estas, comience con una cohorte que sea un 10-15% más alta que el número final deseado de animales.
    NOTA: Determinamos empíricamente la penetrancia tumoral en ratones P 0-GGFβ3 en una cohorte inicial de 50 ratones (seis de los cuales se perdieron por razones no relacionadas con la neoplasia (p. ej., peleas))25.
  2. Evalúe la salud de los animales tres veces por semana y registre las puntuaciones de la condición corporal, incluido el peso y los cambios de comportamiento en cada examen. Acabar con ratones portadores de tumores o moribundos (ver nota a continuación) utilizando la eutanasia con dióxido de carbono seguida de una dislocación cervical. Registre la edad al morir en días. Si los tumores son visibles externamente, registre las dimensiones del tumor (largo, ancho y alto).
    NOTA: Es esencial que no se permita que los animales continúen más allá del tamaño máximo permisible del tumor aprobado por la IACUC y/o el criterio de valoración humanitario.
  3. Utilizando la edad de muerte, establezca una curva de supervivencia de Kaplan-Meier para determinar la edad media de muerte y el rango de supervivencia.
    NOTA: Los ratones P 0-GGFβ3 tuvieron una edad media de muerte de 261,5 días, con un rango de 74-533 días; El 91% de nuestra cohorte tenía neurofibromas múltiples y el 71% tenía MPNST21.
  4. Determinar si hay tumores muy visibles y, si lo están, diseccionarlos en condiciones estériles para establecer si el tumor está asociado con un nervio periférico y, a continuación, extirpar el tumor. En P 0-GGFβ3 y P0-GGFβ3; Los ratones Trp53+/- y los tumores de la vaina de los nervios periféricos se encuentran con mayor frecuencia en los nervios trigémino y ciático. Incluso si no se observan tumores muy visibles en asociación con estos nervios, fije e inserte estos nervios como se describe a continuación para que puedan ser examinados para detectar la presencia de microtumores. Por lo general, los microtumores ocurren dentro de los ganglios asociados con estos nervios.
  5. Cortar los tumores macroscópicamente visibles en tres pedazos (Figura 1A). Utilice la pieza 1 para histología (secciones de parafina, inmunohistoquímica e histoquímica). Utilice la pieza 2 para establecer culturas de pasaje temprano. Congele a presión la pieza 3 (usando nitrógeno líquido) para posibles experimentos futuros (por ejemplo, inmunomanchas, aislamiento de ARN y ADN).
  6. Fijar la pieza 1 en paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante la noche a 4 °C. Fijar el resto del cuerpo del animal por inmersión en paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 °C.

2. Inclusión en parafina de tumores macroscópicamente visibles y preparación de secciones teñidas con hematoxilina y eosina para la evaluación diagnóstica inicial

  1. Inclusión en parafina de tumores muy visibles
    1. Después de fijar la pieza tumoral 1 durante la noche en paraformaldehído al 4%, enjuague el tejido colocándolo en un volumen de PBS que sea al menos 10 veces mayor que el volumen del tejido durante 15 minutos; Use el mismo volumen para todos los enjuagues posteriores. Repita dos enjuagues más de PBS de 15 minutos, usando un volumen nuevo de PBS para cada enjuague.
    2. Transfiera la pieza tumoral de 1 a 70% de etanol. Mantener el tejido en etanol al 70% durante 24 h a 4 °C. Si lo desea, almacene el tejido a largo plazo en estas condiciones.
      NOTA: Los pasos 2.1.1 a 2.1.7 se proporcionan para el beneficio de los investigadores que no tienen acceso a una máquina comercial de procesamiento de tejidos. Si el investigador tiene acceso a un procesador de tejidos, el tejido se procesará a través de etanoles y xilenos clasificados según el protocolo del instrumento programado.
    3. Transfiera la pieza tumoral de 1 a 80% de etanol durante 30 minutos a temperatura ambiente. Repita la incubación durante 30 minutos más en un volumen fresco de etanol al 80%.
    4. Transfiera la pieza tumoral de 1 a 95% de etanol durante 75 min a temperatura ambiente. Repita la incubación dos veces más, cada vez durante 75 minutos adicionales en un volumen fresco de etanol al 95%.
    5. Transfiera la pieza tumoral de 1 a 100% de etanol e incube durante 60 minutos a temperatura ambiente. Repita la incubación de 60 minutos dos veces más, cada vez utilizando un volumen fresco de etanol al 100%.
    6. Transfiera la pieza tumoral 1 a un solvente a base de d-limoneno e incube durante 30-60 minutos a temperatura ambiente. Transfiera la pieza tumoral 1 a un volumen nuevo del solvente a base de d-limoneno e incube durante 30-60 minutos adicionales a temperatura ambiente.
    7. Transfiera la pieza tumoral 1 al disolvente 1:1 a base de parafina/d-limoneno durante 1 h a 60 °C. Deseche el disolvente 1:1 a base de parafina/d-limoneno y transfiera la pieza tumoral 1 a 60 °C de parafina e incube durante 20 min a 60 °C. Repita la incubación en un volumen fresco de parafina a 60 °C una vez más durante 20 minutos. Incubar la pieza tumoral 1 en parafina durante la noche a 60 oC.
    8. Vierta una capa base de parafina en un molde de histología de acero y deje que se solidifique. Transfiera la pieza tumoral 1 a la superficie de la parafina base e inmediatamente después de la colocación, cubra el tejido con parafina de 60 oC y coloque el casete de tejido encima y en contacto con la parafina fundida. Transfiera el molde al lado frío de la estación de inclusión y deje que se solidifique durante 10-15 minutos.
    9. Retire del molde el bloque de parafina con el casete de pañuelo adjunto. Utilice el casete de tejido adjunto para sujetar el bloque en el micrótomo durante el corte.
      NOTA: El bloque de parafina ahora se puede almacenar indefinidamente a temperatura ambiente.
  2. Prepare secciones teñidas con hematoxilina y eosina de tumores muy visibles.
    1. Corte secciones de 4-5 μm de tejido tumoral con un micrótomo y móntelas en portaobjetos de vidrio cargados positivamente.
    2. Para realizar la tinción con hematoxilina y eosina (H&E), desparafinar las secciones de tejido incubando los portaobjetos en un disolvente a base de d-limoneno durante 10 min a temperatura ambiente. Repita la incubación en un volumen fresco de disolvente a base de d-limoneno durante 10 min.
    3. Transfiera los portaobjetos a etanol al 100% e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. Transfiera los portaobjetos a un volumen fresco de etanol al 100% e incube durante otros 5 minutos a temperatura ambiente.
    4. Transfiera los portaobjetos a etanol al 95% e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. Transfiera los portaobjetos a un volumen fresco de etanol al 95% e incube durante otros 5 minutos a temperatura ambiente.
    5. Transfiera los portaobjetos a etanol al 70% e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. Luego, transfiera a etanol al 50% e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    6. Transfiera los portaobjetos a agua destilada e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    7. Tiñe los portaobjetos sumergiéndolos en hematoxilina durante 5 minutos a temperatura ambiente. Enjuague con agua corriente del grifo durante 1-2 minutos. Diferencie sumergiendo portaobjetos 2-5x en ácido clorhídrico al 0,5 % en etanol al 70 %. Enjuague en un baño de agua corriente del grifo durante 1-2 minutos. Coloque los portaobjetos en etanol al 95% con ácido acético al 0,5% durante 10 s.
    8. Tiñir los portaobjetos con eosina-Y durante 30 s a temperatura ambiente y luego transferir los portaobjetos a etanol al 100% durante 5 min. Limpie las muestras en un disolvente a base de d-limoneno durante 5 min.
    9. Monte los cubreobjetos con un medio de montaje a base de xileno mientras el portaobjetos aún está húmedo con el solvente a base de d-limoneno. Deje que el medio de montaje se asiente durante la noche.
      NOTA : No utilice un medio de montaje a base de agua.
  3. Preparar tejidos sin tumores muy visibles para identificar neurofibromas plexiformes y micro-MPNST. Incrustar los tejidos en parafina, preparar cortes histológicos y teñir estos cortes con hematoxilina y eosina.
    1. Extirpar los órganos internos e incrustar porciones representativas de cada órgano en parafina para preparar secciones teñidas con H y E que se examinarán en busca de evidencia microscópica de tumores (Figura 1B). Retire la cabeza, las extremidades delanteras, las extremidades posteriores y la cola (Figura 1C). Para examinar la médula espinal y las raíces nerviosas in situ en busca de evidencia de tumores de raíces nerviosas, descalcificar la columna vertebral y las costillas y tejidos blandos asociados mediante inmersión en 0,3 M de EDTA/4% de paraformaldehído (pH 8,0) durante 48-72 h a 4 oC; luego, enjuague las muestras con 1x PBS. Al final de la descalcificación, asegúrese de que la descalcificación se haya completado intentando perforar la columna vertebral con una aguja. La descalcificación es exitosa si la aguja penetra fácilmente en el hueso sin crujir.
    2. Corte la columna vertebral descalcificada y las estructuras asociadas en bloques que quepan en un casete de pañuelos. Deshidratar mediante etanoles graduados seguidos de un disolvente a base de d-limoneno, tal como se describe en los pasos 2.1.2 a 2.1.7. Incrustar en parafina y preparar secciones de 4-5 μm como se describe en los pasos 2.1.7-2.2.1. Realice tinciones de H&E como se describe en los pasos 2.2.2-2.2.9; Deje que el medio de montaje se asiente durante la noche.

3. Identificar posibles neurofibromas plexiformes y realizar tinciones especiales para confirmar diagnósticos

NOTA: Recomendamos encarecidamente incluir a un patólogo humano o veterinario con experiencia en la evaluación de la H&E y las tinciones especiales de las secciones tumorales GEM.

  1. Examinar los portaobjetos teñidos con H y E preparados como se describió anteriormente utilizando microscopía de campo claro para identificar posibles tumores de la vaina de los nervios periféricos. Dado que los neurofibromas y los MPNST surgen dentro de los nervios periféricos, es importante determinar si los tumores microscópicos están asociados con un nervio periférico. Identificar bloqueos con posibles tumores de la vaina de los nervios periféricos para que se puedan realizar inmunotinciones y otras tinciones especiales para confirmar o refutar los diagnósticos.
  2. Distinguir las NP potenciales de las MPNST u otras neoplasias de grado alto en función de las características histológicas observadas durante el examen de campo claro de las secciones teñidas con H y E. Las NP humanas son neoplasias levemente hipercelulares compuestas predominantemente por células con núcleos alargados, a menudo ondulados. En muchas áreas, las células están poco empaquetadas y pueden estar separadas por material extracelular mixoide; Las NP en ratones P 0-GGFβ3 tienen una apariencia similar. Por lo general, las mitosis no están presentes; si lo son y el tumor es de moderada a altamente hipercelular, el tumor es un MPNST u otro tipo de neoplasia de alto grado (consulte más adelante).
  3. Las NP están compuestas por una mezcla de células de Schwann neoplásicas y otros tipos de células no neoplásicas, como los mastocitos. Para confirmar la identidad de una NP, realizar inmunotinciones para los marcadores de células de Schwann S100β y Sox10 y el marcador de mastocitos CD117 (c-Kit) en secciones de bloques que contienen NP potenciales identificadas en el examen de H&E (ver sección 3.4 para opciones alternativas de tinción de marcadores de mastocitos). Realizar inmunotinciones de Ki67 para confirmar bajas tasas de proliferación.
    NOTA: En la Tabla 1 se enumeran los marcadores de antígenos utilizados para la identificación rutinaria de los neurofibromas plexiformes GEM (S100β, Sox10, CD117, Ki67), el diagnóstico de los MPNST y para una evaluación completa de otros tipos celulares presentes en los neurofibromas; solo se tiñe para estos últimos antígenos cuando se describe por primera vez un nuevo modelo GEM. Consulte la hoja de datos del fabricante del anticuerpo para conocer las condiciones recomendadas. Tenga en cuenta si el prospecto del fabricante del anticuerpo recomienda la recuperación del antígeno; No todos los antígenos requieren recuperación para ser detectables.
    1. Prepare secciones de 4-5 μm a partir de los bloques de parafina seleccionados y móntelas en portaobjetos cargados positivamente. Desparafinar las secciones como se describe en los pasos 2.2.2-2.2.6.
    2. Enjuague las secciones con 1x PBS durante 3-5 min.
    3. Si el fabricante del anticuerpo recomienda la recuperación del antígeno, prepare un tampón de citrato. Combine 9 ml de solución de ácido cítrico (10,5 g de ácido cítrico en 500 ml de agua destilada) y 41 ml de solución de citrato de sodio (14,7 g de citrato de sodio en 500 ml de agua destilada).
    4. Realice la recuperación de antígenos colocando portaobjetos en tampón de citrato durante 20 minutos en una olla arrocera caliente.
    5. Transfiera los portaobjetos a peróxido de hidrógeno al 3%/1x PBS durante 10 minutos para eliminar la actividad de la peroxidasa en el tejido.
      NOTA: Haga que esta solución esté fresca cada vez y no use la solución madre de peróxido de hidrógeno si tiene más de 3-4 meses.
    6. Enjuague las secciones en 1x PBS.
    7. Bloquee las secciones con tampón de bloqueo (2% BSA, 0,1% Triton X-100 en 1x PBS) durante 1 h. Enjuague brevemente los portaobjetos en 1x PBS.
    8. Agregue el anticuerpo primario a las secciones de tejido. Preparar anticuerpos primarios en tampón de bloqueo diluido. Incubar los portaobjetos durante 2 h a 37 °C o durante la noche a 4 °C.
    9. Lave los portaobjetos en 1x PBS durante 5 min. Repita 3 veces.
    10. Incubar el tejido con anticuerpo secundario biotinilado durante 1-2 h.
    11. Prepare la solución de diaminobencidina (DAB) según el protocolo del fabricante y sumerja los portaobjetos en la solución durante 2-10 minutos. Lave los portaobjetos en agua durante 5 min.
    12. Contratiñe las secciones sumergiéndolas en hematoxilina durante 10-15 min. Exponga al agua corriente hasta que salga clara. Sumerja rápidamente los portaobjetos en alcohol y enjuáguelos con agua.
    13. Deshidrate los portaobjetos en etanol graduado sumergiendo rápidamente los portaobjetos, 4-5 veces por solución, en etanol al 70%, etanol al 95% y luego etanol al 100%. Incubar los portaobjetos en un disolvente a base de d-limoneno durante 2 min. Incubar los portaobjetos en un segundo lote de disolvente a base de d-limoneno durante 2 min.
    14. Monte las guías con un medio de montaje a base de xileno.
    15. Examine los portaobjetos mediante microscopía de campo claro.
    16. Para la inmunofluorescencia, omitir los pasos 3.3.10-3.3.15. En su lugar, incubar el tejido con un anticuerpo secundario específico de la especie diluido en tampón de bloqueo durante 1-2 h.
    17. Enjuague los portaobjetos en 1x PBS durante 5 min. Repita 3 veces.
    18. Monte los portaobjetos usando 1x PBS/glicerol.
    19. Examine los portaobjetos con microscopía de fluorescencia.
  4. Método alternativo para la tinción de mastocitos: tinción con azul de toluidina
    1. Preparar solución madre de azul de toluidina disolviendo 1 g de azul de toluidina O en 100 ml de etanol al 70%.
    2. Preparar una solución de cloruro de sodio (NaCl) al 1% disolviendo 0,5 g de NaCl en 50 ml de agua destilada. Mezclar para disolver. Ajuste el pH a aproximadamente 2.0-2.5 usando HCl.
      NOTA: Esta solución de NaCl debe hacerse fresca cada vez que se realicen manchas.
    3. Prepare la solución de trabajo azul de toluidina agregando 5 ml de solución madre de azul de toluidina a 45 ml de la solución de NaCl al 1%. Mezcle bien y asegúrese de que el pH sea de aproximadamente 2,3.
      NOTA: Un pH superior a 2,5 dará lugar a tinciones con menos metacromasia. Haga que esta solución sea fresca cada vez que se realice la tinción.
    4. Desparafinar secciones de 4-5 μm montadas en portaobjetos cargados positivamente, como se describe en los pasos 2.2.2-2.2.6. Lavar las secciones desparafinadas en agua corriente durante 2 min.
    5. Tiñe las secciones en una solución de trabajo azul de toluidina durante 2-3 min. Lavar en agua destilada durante 2 min.
    6. Deshidrata las secciones sumergiéndolas 10 veces en etanol al 95%. Portaobjetos de inmersión en etanol 100% 10x. Sumerja los portaobjetos en etanol fresco al 100% 10 veces más.
    7. Incubar los portaobjetos en un disolvente a base de d-limoneno durante 2 min. Incubar los portaobjetos en un segundo lote de disolvente a base de d-limoneno durante 2 min.
    8. Monte los cubreobjetos con un medio de montaje a base de xileno mientras el portaobjetos aún está húmedo con un solvente a base de d-limoneno.
      NOTA : No utilice un medio de montaje a base de agua.
    9. Examine los portaobjetos mediante microscopía de campo claro. Identificar los mastocitos por la presencia de gránulos de color púrpura oscuro en su citoplasma. Otros tipos de células se tiñen de azul claro.

4. Tinciones especiales para diagnosticar MPNST y descartar diagnósticos alternativos

  1. El aspecto histológico de los MPNST humanos es muy variable y varios tipos de tumores diferentes tienen un aspecto similar al de los MPNST28. Dado que los MPNST se derivan del linaje de las células de Schwann, se debe determinar si el tumor surge de un nervio periférico o dentro de una NP benigna existente mediante un examen macroscópico o un examen microscópico de campo claro de secciones teñidas con H y E. Aunque en ocasiones las MPNST no se encuentran asociadas con un nervio periférico o NP (por lo general, debido a la separación inadvertida del nervio durante la disección, la destrucción de la NP preexistente a través del crecimiento excesivo de la MPNST o porque la lesión es metastásica), busque la asociación del tumor con un nervio o NP, ya que el diagnóstico es menos probable si el tumor no está asociado con un nervio o NP.
  2. Preparar secciones de 4-5 μm a partir de bloques de parafina que contengan posibles MPNST y montarlas en portaobjetos cargados positivamente, tal como se describe en el paso 2.2.1. Desparafinar las secciones como se describe en los pasos 2.2.2-2.2.6.
  3. Realizar inmunohistoquímica con el panel de anticuerpos indicado en la Tabla 2 como se describe en los pasos 3.3.1-3.3.15.
  4. Examinar las inmunotinciones mediante microscopía de campo claro. Dado que los MPNST demuestran diferenciación schwanniana, busque una inmunorreactividad uniforme o irregular para S100β, nestina y Sox10. Si los tumores no son positivos para estos tres marcadores, consultar el Cuadro 2 para establecer el diagnóstico.
    NOTA: Los MPNST humanos y de ratón pueden demostrar una diferenciación divergente. Por ejemplo, algunos MPNST humanos demuestran diferenciación rabdomioblástica focal (estas variantes se conocen como tumores malignos de Tritón); aunque estas neoplasias se tiñen para los marcadores de Schwann, también expresan marcadores musculares como desmina, MyoD1 y miogenina. La inmunorreactividad de estos últimos marcadores no debe disuadir a los investigadores de diagnosticar el tumor como MPNST. Aunque se han establecido múltiples modelos de ratón que expresan condicionalmente el gen de fusión SS18-SSX para modelar la patogénesis del sarcoma sinovial29, hasta donde sabemos, no se conocen modelos de sarcoma sinovial que generen espontáneamente la transcripción de fusión equivalente. En consecuencia, no buscamos transcritos de fusión SS18-SSX en los tumores GEM y, en cambio, nos basamos en perfiles inmunohistoquímicos.

5. Clasificación de los MPNST

  1. Determinar si hay necrosis tumoral, una característica distintiva de los MPNST de grado IV de la OMS. En el caso de los MPNST de grado IV, se debe buscar hipercelularidad prominente, actividad mitótica enérgica (≥4 mitosis por cada 10 campos de alta potencia (40x)) y atipia citológica.
    1. Si no hay necrosis, se debe evaluar el tumor para determinar si hay hipercelularidad, actividad mitótica enérgica y atipia citológica. Si todas estas características están presentes en ausencia de necrosis, clasifique el tumor como MPNST de grado III de la OMS.
    2. Los tumores de grado II de la OMS se caracterizan por un aumento de la celularidad, pero en menor grado que los MPNST de grado III y IV de la OMS. Los núcleos de las células tumorales en un MPNST de grado II de la OMS muestran un aumento de tamaño (más de 3 veces el tamaño de los núcleos de las células tumorales en los neurofibromas) e hipercromasia. El aumento de la actividad mitótica (<4 mitosis por cada 10 campos de alta potencia) se relaciona con los tumores de grado II de la OMS, pero no es un requisito para ellos.
      NOTA: Dado que los tumores de grado más alto suelen progresar a partir de los grados más bajos, es posible que haya regiones de grado bajo y de grado alto en el mismo MPNST. En esta circunstancia, el grado del tumor está determinado por la región de grado más alto presente.
      NOTA: Existe controversia entre los patólogos humanos en cuanto a si el sistema de clasificación de la OMS descrito anteriormente es predictivo de los resultados de los pacientes y algunos de estos patólogos prefieren simplemente clasificar los MPNST como de bajo grado o de alto grado. Bajo este esquema, los MPNST de alto grado tienen atipia citológica prominente, actividad mitótica enérgica (>5 mitosis por 10 campos de alta potencia) e hipercelularidad marcada con o sin necrosis. Los MPNST de bajo grado carecen de necrosis, pero muestran actividad mitótica, atipia citológica y celularidad intermedia entre un MPNST de alto grado y una neoplasia neurofibromatosa atípica con potencial biológico desconocido (ANNUBP). Preferimos el sistema descrito anteriormente porque distinguir entre un ANNUBP y un MPNST de bajo grado puede ser un desafío para los investigadores que no tienen una larga experiencia con estas entidades.

6. Preparación de cultivos decélulas MPNST P 0-GGFβ3 de paso temprano

  1. Cultivo de células tumorales P 0-GGFβ3 de paso temprano a partir de una pieza tumoral fresca 2 (paso 1.5, Figura 1A). Mantenga las condiciones estériles a partir de este momento.
    1. Disociar el tumor cortándolo en trozos pequeños (2-4 mm) y picándolo en DMEM10 (medio esencial mínimo de Dulbecco) que contiene 10% de suero fetal de ternero, 2 μmol/L de forskolina y 10 nmol/L de neuregulina 1β (NRG1β) en placas de cultivo de tejidos de 100 mm.
    2. Deje que las células crezcan a partir de los fragmentos de tejido picado a 37 °C en 5% de CO2 hasta que las placas sean confluentes. Cambie el medio cada 3-4 días.
    3. Divida el cultivo celular. Retire el medio del plato de 100 mm y lave las celdas con PBS; Retire y deseche el pañuelo picado. Retire el PBS y agregue 1 ml de tripsina al 0,25% durante 2-5 minutos a temperatura ambiente. Para promover el desprendimiento celular, golpee suavemente la placa y verifique si hay desprendimiento con un microscopio óptico; Extender la incubación de tripsina según sea necesario.
    4. Neutralizar la tripsina añadiendo 2 mL de DMEM10. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga y las celdas de gránulos a 500 × g durante 5 min. Retire el medio y agregue 5 ml de DMEM10 fresco al gránulo.
    5. Distribuya la suspensión de la celda en dos a cuatro platos de 100 mm que contengan DMEM10. No divida las células por más de cinco pasos (pasos 6.1.3 y 6.1.4) y manténgalas en DMEM sin forskolina y NRG1β. Recuerde congelar las celdas en el pasaje 2 para usarlas en el futuro.

7. Verificación de la identidad de las células MPNST de paso temprano mediante inmunocitoquímica

  1. Coloque cubreobjetos de vidrio redondos estériles de 18 mm # 1.5 en los pocillos de las placas de cultivo de tejidos estériles de 6 pocillos.
    1. Coloque la solución de poli-L-lisina/laminina en los pocillos en un volumen suficiente para cubrir el cubreobjetos. Selle la placa con una envoltura de plástico para minimizar la evaporación. Incubar a 4 °C durante la noche. A la mañana siguiente, lave las cubreobjetos 3 veces con PBS estéril.
      NOTA: Hemos intentado colocar placas de células MPNST de paso temprano en cubreobjetos sin recubrimiento y hemos encontrado que las células no se adhieren bien en ausencia de recubrimiento de poli-L-lisina/laminina.
    2. Aplique 10,000 células en el cubreobjetos agregando suavemente 2 ml de la suspensión celular en el medio de crecimiento en cada pocillo que contenga el cubreobjetos. Incubar las placas durante la noche a 37 °C con 5% de CO2 en una incubadora de cultivo de tejidos.
    3. A la mañana siguiente, enjuague los cubreobjetos durante 2 x 5 minutos con PBS.
    4. Fije las células con paraformaldehído al 4% en PBS durante 18 min a temperatura ambiente.
    5. Enjuague los cubreobjetos 3 x 5 min con PBS. Si lo desea, selle la placa con una película de plástico y guárdela a 4 °C en este punto.
    6. Hacer 50 mM de NH4Cl frescos en PBS. Enfríe los aldehídos incubando cubreobjetos en 50 mM de NH4Cl en PBS durante 10 min a temperatura ambiente.
    7. Permeabilizar las células incubando cubreobjetos en Triton X-100 al 0,3% en PBS durante 15 min a temperatura ambiente. Lave los cubreobjetos durante 3 x 5 minutos con PBS.
    8. Bloquee la unión inespecífica incubando cubreobjetos en tampón de bloqueo (1x PBS que contenga 1% de albúmina sérica bovina, 0,2% de leche en polvo descremada y 0,3% de Triton X-100) durante 1 h a temperatura ambiente.
    9. Retire el tampón de bloqueo y agregue anticuerpos primarios que reconozcan los marcadores MPNST presentes en el tumor principal (generalmente S100β, Nestin y Sox10) diluidos a la dilución óptima predeterminada en el tampón de bloqueo. Envuelva la placa con una película de plástico e incube a 4 °C durante la noche en una cámara humidificada.
    10. Lavar 3 x 5 min con PBS para eliminar el anticuerpo primario no unido. Añadir anticuerpo secundario marcado con fluorescencia diluido en tampón de bloqueo e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Protégete de la luz.
    11. Lavar 3 x 5 min con PBS. Incubar los cubreobjetos en 1-5 μg de tinte Hoechst durante 10 min. Continúe protegiéndolos de la luz.
    12. Lave los cubreobjetos con PBS durante 5 min. Monte los portaobjetos con PBS/glicerol 1:1 1x. Imagen con un microscopio fluorescente.

8. Aloinjerto de células tumorales de paso temprano para demostrar la tumorigénesis

  1. Cultive células MPNST P 0-GGFβ3 de paso temprano en DMEM10 a 80% de confluencia. Enjuague las celdas una vez con una solución salina balanceada de Hanks (HBSS) a temperatura ambiente. Trate las células durante 30 s a 1 min con una solución de disociación celular no enzimática para eliminarlas del sustrato. Añadir 5 ml de DMEM10 por 1 ml de un reactivo de disociación celular no enzimática.
    NOTA: La disociación celular puede tardar mucho más, hasta 10-20 minutos. Consulte el protocolo del fabricante.
    NOTA: No cultive células hasta la confluencia, ya que esto reducirá la eficacia del injerto.
    1. Cuente las células con un hemocitómetro. Centrifugar las células a 5 × g durante 5 min y volver a suspenderlas a una concentración de 1-2 × 106 células por cada 100 μL de DMEM10. Mantenga las células en hielo hasta que estén listas para la inyección.
    2. Anestesiar ratones NOD-SCIDγ (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl/SzJ) en la cámara de inducción de un vaporizador de isoflurano. Coloque al animal boca abajo y esterilice el lugar de la inyección con etanol al 70%. Deje que el sitio se seque al aire antes de la inyección. Antes de la inyección, deje que las células alcancen la temperatura ambiente.
    3. Inyectar 1-2 x 106 células por vía subcutánea en el flanco derecho. Coloca al ratón solo en una jaula libre de ropa de cama y deja que se recupere. Asegúrese de que solo una parte de la jaula esté sobre una almohadilla térmica para evitar la hipotermia. Esto proporciona una zona a la que el mouse puede moverse si se sobrecalienta.
      NOTA: Injertamos un mínimo de tres ratones con cada cultivo de paso temprano, ya que es posible que algunos injertos no se realicen.
    4. Deje que el injerto crezca durante 15-60 días; Evalúe la salud animal 3 veces por semana y registre las puntuaciones de la condición corporal, incluido el peso y los cambios de comportamiento en cada examen. Terminar con los ratones que han alcanzado el tamaño máximo permitido del injerto o con los ratones moribundos mediante eutanasia con dióxido de carbono seguida de dislocación cervical. Registre la edad al morir en días. A medida que los tumores se vuelven visibles externamente, registre las dimensiones del tumor (largo, ancho y alto).
      NOTA: En nuestra experiencia, los diferentes cultivos de MPNST de paso temprano se injertan con una eficiencia variable y difieren en el tiempo requerido para el crecimiento del injerto. No se debe permitir que los animales avancen más allá del tamaño máximo permitido del tumor aprobado por la IACUC y/o el criterio de valoración humanitario.
  2. Extraer el tumor, fijarlo en paraformaldehído al 4%, incrustarlo en parafina y realizar tinciones de H&E como se describe en las secciones 2.1-2.2.9 para verificar que el aloinjerto es un tumor y no un tejido reactivo. Si es necesario, inmunotiñir el injerto para los marcadores que estaban presentes en el tumor padre.

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Resultados

La Figura 2 ilustra ejemplos de neoplasias de gran evidencia que surgen en ratones P 0-GGFβ3. Los tumores que son fácilmente identificables a simple vista pueden verse como masas que distienden regiones del cuerpo, como se muestra en la Figura 2A (flecha). Al determinar si la neoplasia es potencialmente un tumor de la vaina del nervio periférico, es esencial establecer que el tumor está asociado con un nervio periférico. En este caso, una resonancia m...

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Discusión

Los métodos histológicos y bioquímicos presentados aquí proporcionan un marco para el diagnóstico y la caracterización de los modelos GEM de neurofibroma y patogénesis MPNST. A lo largo de los años, hemos encontrado que estas metodologías son de gran utilidad para evaluar la patología de los tumores de la vaina de los nervios periféricos que surgen en los modelos GEM 21,25,26. Sin embargo, si bien los protocolos descritos aquí s...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por subvenciones del Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares (R01 NS048353 y R01 NS109655 a S.L.C.; R01 NS109655-03S1 a D.P.J.), el Instituto Nacional del Cáncer (R01 CA122804 a S.L.C.) y el Departamento de Defensa (X81XWH-09-1-0086 y W81XWH-12-1-0164 a S.L.C.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placas de cultivo de tejidos de 100 mmCorning Falcon353003
3, 3'- Diaminobensidina (DAB)Vector LaboratoriesSK-400
Placas de 6 pocillosCorning Costar3516
Ácido AcéticoFisher ScientificA38-212
Alexa Fluor 488 Secundario (Cabra Anti-Ratón)InvitrogenA11029
Alexa Fluor 568 Secundario (Anti-Ratón de Cabra)InvitrogenA21043 o A11004
Alexa Fluor 568 Secundario (Anti-Conejo de Cabra)InvitrogenA11036
Cloruro de amonio (NH4Cl)Kit de ensayo deFisher ScientificA661-500
BCAAlbúmina
Fisher ScientificBP1600-100
CaldesmonABCAM E89, ab32330
CD117Marca de celda117R-18-ASR
CD163LeicaNCL-L-CD163
CD31ABCAM ab29364
CD34ABCAM ab81289
CD86ABCAM ab53004
Raspador de célulasSarstedt83.183
Separador de célulasCorning25-056-CI
Cubreobjetos circularesFisher Scientific12-545-100
Citrisolve Híbrido (disolvente a base de d-limoneno)Decon Laboratories5989-27-5
Ácido críticoFisher ScientificA104-500
CitoqueratinaABCAM C-11, ab7753
DesminAgilent Dako clon D33 (M0760)
Diaminobensizdina (DAB)Solución Vector LaboratoriesSK-4100
DMEMCorning15-013-CV
Eosina YThermo Scientific7111
Ethanol (200 Proof)Decon Laboratories2716
Fetal Calf SerumOmega ScientificFB-01
ForksolinSigma-AldrichF6886
GlicerolSigma-AldrichG6279
Hank's Solución salina equilibrada (HBSS)Corning21-022-CV
Harris HematoxilinaFisherbrand245-677
HemacitómetroBrightline-Hauser Scientific1490
Ácido clorhídricoFisher ScientificA144-212
Peróxido de hidrógenoFisher Scientific327-500
Iba1Wako Chemicals019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidasa) Kit de polímeroMouse on Mouse Vector LaboratoriesMP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidasa) Kit de polímero, Horse Anti-RabbitVector LaboratoriesMP-7401
IncubadoraThermo ScientificHeracell 240i Incubadora
IsofluranoPiramalNDC 66794-017-25
IsopropanolFisher ScientificA415
Ki-67Cell Signaling 12202
LamininaThermo Fisher Scientific23017015
Nitrógeno líquido
MART1ABCAM M2-9E3, ab187369
Microtomo
NestinMillipore Humano: MAD5236 (10C2), Humano:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 betaHecho internamentepor S.L.C. (también disponible como 396-HB-050/CF de R& D Systems)
NeurofibrominSanta Cruz Biotechnology SC-67
ASINTIÓ. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ ratonesJackson Laboratory5557
Leche en polvo descremadaWalmartMarca
P0-GGFβ 3 ratonesCera
LeicaParaplast 39601006
Parafilm MSigma-AldrichPM-999
Paraformaldehído (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
Permount (medio de montaje de xileno)Fisher ScientificSP15-100
Medidor de pHMettler ToldedoSeven Excellence, 8603
solución salina tamponada con fosfato (Dulbecco's)Corning20-031-CV
PMELABCAM EP4863(2), ab137078
Hidrobromuro de poli-L-lisinaSigma-AldrichP5899-5MG
Máquina de isoflurancia portátilanestesia inhalatoria
PVA-DABCO (medio de montaje acuoso)Millipore Sigma10981100ML
Olla arroceraHaya Hamilton
S100BAgilent Dako Z0311  (ahora GA504)
SMAVentana Medical Systems clon 1A4
Cloruro de sodioFisher ScientificS640
Citrato de sodio (dihidratado)Fisher ScientificBP327-1
Sox10ABCAM ab212843
de histología de acero
Superfrost Plus Portaobjetos de microscopioFisher Scientific12-550-15
TCF4/TCFL2 Señalización celular (CH48H11) #2569
Casete
Azul ToluidinaACROS Organics 348600050
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
TRIzolInvitrogen15596026
TripsinaCorning25-051-31
proteínas sérica bovina Thermo Scientific 23225 , de CO2de gran valor de parafina interna VetEquip Sistemas de Molde de Pañuelo

Referencias

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