Retina dividida como una preparación mejorada de montaje plano para estudiar las neuronas de la capa nuclear interna en la retina de vertebrados

Resumen

Este trabajo presenta una preparación alternativa de retina de montaje plano en la que la eliminación de los cuerpos de las células fotorreceptoras permite una difusión más rápida de los anticuerpos y un mejor acceso de la pipeta de parche a las neuronas internas de la retina para experimentos de inmunohistoquímica, hibridación in situ y electrofisiología.

Resumen

Las células bipolares y las células horizontales de la retina de los vertebrados son las primeras neuronas en procesar la información visual después de que los fotones son detectados por los fotorreceptores. Realizan operaciones fundamentales como la adaptación a la luz, la sensibilidad al contraste y la oposición espacial y de color. Una comprensión completa de los circuitos precisos y los mecanismos bioquímicos que gobiernan su comportamiento hará avanzar la investigación en neurociencia visual y la medicina oftalmológica. Sin embargo, las preparaciones actuales para examinar las células bipolares y horizontales (montajes enteros de la retina y cortes verticales) son limitadas en su capacidad para capturar la anatomía y la fisiología de estas células. En este trabajo, presentamos un método para eliminar cuerpos de células fotorreceptoras de retinas de ratón vivas de montaje plano, proporcionando un mejor acceso a las células bipolares y horizontales para un pinzamiento eficiente del parche y un rápido inmunomarcado. Las retinas divididas se preparan intercalando una retina de ratón aislada entre dos trozos de nitrocelulosa y luego separándolas suavemente. La separación divide la retina justo por encima de la capa plexiforme externa para producir dos piezas de nitrocelulosa, una que contiene los cuerpos celulares fotorreceptores y otra que contiene la retina interna restante. A diferencia de los cortes verticales de retina, la preparación de la retina dividida no corta los procesos dendríticos de las neuronas internas de la retina, lo que permite grabaciones de células bipolares y horizontales que integran las contribuciones de las redes acopladas a uniones gap y las células amacrinas de campo amplio. Este trabajo demuestra la versatilidad de esta preparación para el estudio de células horizontales y bipolares en experimentos de electrofisiología, inmunohistoquímica e hibridación in situ .

Introducción

La retina es un tejido neural delgado ubicado en la parte posterior del ojo donde la luz es interceptada y procesada en una señal electroquímica que puede ser interpretada por el cerebro. En la parte posterior de la retina, los fotorreceptores de bastones y conos son estimulados por la luz, lo que reduce la tasa de liberación tónica del neurotransmisor glutamato¹. Las primeras neuronas que experimentan y responden a este cambio inducido por la luz en la concentración de glutamato son las células bipolares (BC) y las células horizontales (HC), cuyos somas residen en la región más externa de la capa nuclear interna (INL). Estas neuronas de segundo orden realizan la primera etapa del procesamiento de señales en la retina y dan forma a características críticas de la visión, como la adaptación a la luz, la sensibilidad al contraste y la oponencia espacial/^color. Si bien estas funciones se han atribuido a los BC y HC, los circuitos y los mecanismos bioquímicos que subyacen a estos procesos no se comprenden completamente³. Por lo tanto, el avance de herramientas y métodos para explorar la fisiología de la CM y la HC es de suma importancia.

Las secciones verticales (transversales) de la retina han demostrado durante mucho tiempo ser el modelo más práctico para estudiar los BC y HC; sin embargo, ciertos aspectos de la fisiología de BC y HC son inaccesibles para el experimentador bajo este modelo. Los registros directos de las HC o las mediciones indirectas de sus efectos sobre las CC no reflejan la conectividad endógena de la retina, ya que los procesos laterales de estas células se cortan durante el corte. Las preparaciones de retina de montaje completo evitan este problema al preservar estos procesos laterales, pero las capas retinianas circundantes plantean un desafío para acceder a^{estas células}. Si bien hay abundantes ejemplos de inmunotinción 5,6,7,8 y registros de pinza de parche⁹ de neuronas INL en retinas de montaje completo, existe la oportunidad de acelerar y simplificar la recopilación de estos datos. Por lo tanto, las limitaciones inherentes de las secciones transversales y los desafíos del modelo de montura completa inspiraron el desarrollo de esta preparación alternativa para la retina de montaje plano.

El siguiente trabajo describe un protocolo para eliminar fácilmente la capa fotorreceptora de las retinas vivas de montaje plano para mejorar el acceso a los BC y HC para simplificar el pinzamiento del parche y un inmunomarcaje más rápido y eficiente. Al despegar dos piezas de membrana de nitrocelulosa unidas a cada lado de una retina aislada, se desgarra el tejido a través de los axones fotorreceptores, dejando una retina dividida que retiene la capa plexiforme externa (OPL) y todas las capas internas de la retina. Mientras que otros han descrito protocolos para separar mecánicamente las capas de la retina, estos métodos no son adecuados para aplicaciones de pinzamiento de parches y microscopía o requieren una manipulación tediosa del tejido. Varios de estos métodos requieren tejido congelado o liofilizado para la separación de capas, lo que los hace incompatibles con los experimentos de electrofisiología^10,11,12. Otros están diseñados para tejido vivo, pero requieren de 5 a 15 exfoliaciones secuenciales con papel de filtro ^4,11 o tratamiento con tripsina ¹³ para eliminar los fotorreceptores. La técnica descrita aquí mejora sus predecesoras al simplificar el procedimiento de eliminación de fotorreceptores y ampliar el repertorio de aplicaciones posteriores.

Protocolo

A los ratones se les proporcionó agua y comida ad libitum y se les mantuvo en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Los ratones fueron sacrificados mediante la exposición al isoflurano seguida de una luxación cervical. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Salud y Ciencias de Oregón.

NOTA: La enucleación ocular, la disección de la retina y la división de la retina deben realizarse lo más rápido posible para preservar la salud del tejido vivo. Intenta completar la disección en < 4 minutos por ojo. Estos tres pasos deben realizarse secuencialmente. Ratones de tipo salvaje: Se utilizaron ratones C57BL/6J machos y hembras adultos (>3 meses) para los experimentos. Para la morfología de la sinapsis se utilizaron ratones que expresaban proteína verde fluorescente (GFP) bajo el promotor de Pcp2 (Pcp2-cre/GFP)¹⁴ . Ratones transgénicos: Para la visualización celular horizontal con GFP durante experimentos de inmunohistoquímica o electrofisiología, se utilizó un ratón triple transgénico: vGATFLPo; vGlut2Cre; Ai80d. Las cepas vGATFlpo y vGluT2Cre son ratones knock-in que expresan Flpo o Cre recombinasa aguas abajo de sus respectivos promotores. El ratón Ai80d es un ratón reportero interseccional (CatCh/EYFP) y solo expresará rodopsina de canal permeable a Ca²⁺ (ChR2) en células que expresan recombinasas Cre y Flpo. Por lo tanto, el ratón triple transgénico solo expresa ChR2 en células con antecedentes de expresión de VGAT y vGluT2.

1. Preparación de materiales para la disección y división de la retina

1. Preparar trozos de membrana de nitrocelulosa
   NOTA: La separación de la retina dividida de la membrana de nitrocelulosa reduce la fluorescencia de fondo en la microscopía y simplifica el registro de la pinza del parche. La extracción de la membrana se puede realizar antes o después de la fijación del tejido. En el caso de las retinas divididas fijas, no es necesario tratar los trozos de membrana de nitrocelulosa. En el caso de las retinas vivas divididas, trate la membrana de acuerdo con los pasos 1.1.3 - 1.1.5 para facilitar el desprendimiento suave del tejido.
   1. Corta 16 piezas (o más) de membrana de nitrocelulosa en cuadrados de 5 mm x 5 mm. Extra se puede preparar a granel y almacenar para uso futuro.
   2. Reserve la mitad de los trozos de membrana para su uso posterior. Estas piezas no se tratarán con una solución de bloqueo.
   3. Incubar las piezas restantes en una solución bloqueadora de IHQ sin detergente (como suero de caballo al 3% + NaN₃ al 0,025% diluido en PBS) durante 10 minutos a temperatura ambiente, agitando suavemente.
      PRECAUCIÓN: Utilice el EPP adecuado cuando manipule NaN₃, ya que es una toxina potente.
   4. Lave bien las piezas de membrana mediante incubación en medios Ames tamponados con bicarbonato durante 10 minutos a temperatura ambiente, agitando suavemente.
   5. Seque completamente al aire las piezas bloqueadas de membrana (~20 min). Etiquete y almacene las piezas de membrana a temperatura ambiente, manteniéndolas separadas de las piezas de membrana sin tratar.
2. Preparar los medios de comunicación de Ames
   1. Prepare medios Ames tamponados con bicarbonato y mantenga la solución a temperatura ambiente bajo carbogenación constante (95% de_O2 y 5% de CO₂).

2. Enucleación del ojo del ratón

1. Sacrificar al ratón por cualquier método disponible de acuerdo con las pautas institucionales de la IACUC.
2. Voltee el mouse hacia un lado y use dos dedos para presionar suavemente alrededor de la cuenca del ojo. Esto hará que el ojo sobresalga del cráneo.
3. Con unas tijeras de disección curvas, corte debajo del ojo abultado para cortar el nervio óptico y separar el ojo del cráneo.
4. Saca el ojo con unas tijeras y colócalo en una placa de Petri llena de medios Ames helados.
   NOTA: Para aplicaciones posteriores en las que el tejido se fijará después de dividirlo, se puede usar PBS helado en lugar de medios Ames.
5. Repita los pasos 2.1 a 2.4 para el ojo restante.

3. Disección de retina

1. Utilice la pipeta de transferencia de vidrio personalizada para transferir un ojo a una nueva placa de Petri que contenga medios Ames frescos y helados.
   NOTA: La amplia abertura de la pipeta de transferencia personalizada evita el aplastamiento accidental del tejido, y el uso de vidrio minimiza la adhesión del tejido a las paredes de la pipeta. Sin embargo, una pipeta de transferencia de plástico de boca ancha también es aceptable si el experimentador ya domina el uso de esta herramienta.
2. Use fórceps para estabilizar el ojo fijando su tejido conectivo adicional en la parte inferior de la placa de Petri. Luego, perfora el ojo a lo largo de la línea de ora serrata con una aguja de 25G para crear un punto de entrada para las tijeras Vannas.
3. Use las tijeras Vannas para cortar a lo largo de la línea de la ora serrata hasta que la córnea se libere del resto del ojo (Figura suplementaria 1A). Retire el cristalino del ocular con unas pinzas (Figura complementaria 1B).
4. Utilice la pipeta de vidrio personalizada para transferir el ocular a un gran volumen (≥100 ml) de Ames carbugenado y repita los pasos 3.1 a 3.3 con el ojo restante.
   NOTA: Las copas oculares se colocan en Ames carbugenados para mantener la salud de los tejidos mientras se realiza la disección en el otro ojo.
5. Transfiera un ocular a una placa de Petri llena de Ames recién carbogenados.
6. Con las tijeras Vannas, haga un pequeño corte hacia adentro desde el borde de la esclerótica, luego use dos pares de pinzas para despegar la esclerótica de la retina (Figura complementaria 1C). Evite agarrar la retina con las pinzas. En su lugar, separe las solapas de la esclerótica creadas por la tijera.
7. Use las tijeras Vannas para cortar el nervio óptico que conecta la esclerótica y la retina (Figura suplementaria 1D), luego haga palanca suavemente en la retina de la esclerótica con las tijeras o fórceps para aislar la retina. (Figura 1A).
   NOTA: Si bien el EPR generalmente permanecerá adherido al ocular, no se requieren pasos adicionales para extraer el EPR en caso de que esté adherido a la retina. En este punto, los bordes de la retina se pueden recortar opcionalmente con un bisturí para evitar que se enrosquen durante el paso de aplanamiento (Figura 1B).
8. Use un bisturí para cortar la retina en mitades o cuartos (Figura 1C) y, a continuación, use la pipeta de transferencia personalizada para devolver las piezas a un gran volumen (≥ 100 ml) de medios Ames carbogenados continuamente.
   NOTA: La elección de mitades o cuartos es subjetiva. Elija la mejor opción para la aplicación deseada.
9. Repita los pasos 3.5 a 3.8 para el ojo restante antes de proceder a la división de la retina.

4. División de la retina

1. Deseche los medios Ames de las placas de Petri y reemplácelos con Ames recién carbogenados.
   NOTA: Para mantener la carbogenación durante el resto del procedimiento de división de la retina, reemplace los medios en la placa de Petri con Ames recién carbogenados aproximadamente cada 5 minutos.
2. Con la pipeta de transferencia personalizada, coloque un trozo de retina en un portaobjetos de vidrio (7,5 cm x 5 cm), con las células ganglionares hacia arriba, y luego aplánelo eliminando el líquido circundante con una toallita delicada (Figura 1D). Si es necesario, tire suavemente de los bordes de la retina con un pincel de punta fina bajo un microscopio de disección.
3. Use fórceps para bajar un trozo seco de membrana de nitrocelulosa de 5 mm x 5 mm sobre la retina, haciendo que se adhiera al lado de las células ganglionares (Figura 1E).
   NOTA: Si se requiere la extracción de la membrana del tejido vivo (es decir, para electrofisiología), use un trozo seco de membrana tratada con suero para este paso (consulte los pasos 1.1.3 - 1.1.5 para obtener más detalles). Esto reduce la fuerza de la adhesión a la capa de células ganglionares, lo que facilita la extracción de la retina de la nitrocelulosa después de la división.
4. Dé la vuelta a la retina para que la nitrocelulosa descanse sobre el portaobjetos de vidrio y coloque un trozo seco de membrana de 5 mm x 5 mm en el lado fotorreceptor de la retina (Figura 1F).
5. Toque con la punta húmeda del pincel el espacio entre las dos membranas y permita que la acción capilar succione el Ames en el sándwich (Figura 1G). Esto reduce la adherencia de las membranas a la retina y solo es necesario si la retina se ha secado demasiado con la toallita delicada.
   NOTA: Si la retina ha perdido su aspecto brillante, se ha secado demasiado y es necesario el paso 4.5.
6. Para asegurar una adherencia uniforme, aplique una ligera presión hacia abajo sobre la membrana superior con un pincel húmedo (Figura 1H).
7. Mientras sujeta la membrana inferior al vidrio con un par de pinzas, use un movimiento lento y constante para despegar suavemente la membrana superior con un segundo par de pinzas. Esto hará que la retina se divida justo por encima de la OPL (Figura 1I).
8. Deseche la membrana superior que contiene los fotorreceptores (Figura 1J, izquierda). La membrana inferior contiene la retina interna, a partir de ahora denominada retina dividida (Figura 1J, derecha).
9. Devolver inmediatamente la retina dividida a la media de Ames carbogenada.
   NOTA: Para experimentos con tejido vivo, las retinas pueden beneficiarse de un período de recuperación de 15 a 30 minutos en Ames carbogenado después de la división.

Figura 1: Procedimiento de retina dividida. (A) Después de la enucleación y la preparación del ocular en medios fríos de PBS o Ames, aísle la retina del ratón del ocular y reemplace el PBS con medios de Ames carbogenados a temperatura ambiente. (B) Con un bisturí, recorte los bordes de la retina hasta que no queden regiones con una curvatura hacia adentro (opcional). (C) Cortar la retina en cuartos o mitades con un bisturí. (D) Coloque una pieza de retina en un portaobjetos de vidrio (con la célula ganglionar hacia arriba) con la pipeta de transferencia personalizada y elimine todo el exceso de Ames con una toallita delicada. Asegúrese de que la retina semiseca esté plana sobre el vidrio antes de continuar con el siguiente paso. Use una punta de pincel mojada en Ames para desplegar suavemente las regiones de la retina que no son planas. (E) Con unas pinzas, coloque un trozo precortado de membrana de nitrocelulosa seca (5 mm x 5 mm) sobre la retina aplanada. (F) Voltee el pedazo de nitrocelulosa de modo que el lado fotorreceptor de la retina quede hacia arriba. A continuación, coloque otro trozo seco de membrana sobre la retina. (G) Toque con la punta húmeda del cepillo el espacio entre las dos membranas y permita que la acción capilar succione el Ames en el sándwich. Esto reduce la adherencia de las membranas a la retina y solo es necesario si la retina se secó demasiado con la toallita delicada. (H) Use la punta de un pincel húmedo para presionar suavemente hacia abajo sobre el centro de la retina intercalada. (I) Use un par de pinzas para sujetar la pieza inferior de la membrana en el portaobjetos de vidrio, mientras usa otro par de pinzas para despegar suavemente la pieza superior de la membrana de la inferior. (J) La retina interna (izquierda) permanece en la membrana inferior, mientras que los fotorreceptores (derecha) se separan con la membrana superior. Los paneles (A), (B), (C), (D) y (J) se adquirieron utilizando un microscopio de disección; la barra de escala representa aproximadamente 1 mm; Los paneles (E-I) se adquirieron con la cámara de un teléfono inteligente sin aumento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Preparación de retinas divididas para experimentos de inmunofluorescencia

NOTA: La retina dividida seguirá unida a la membrana de nitrocelulosa hasta el paso 5.5. Complete los pasos 5.1, 5.2, 5.3 o 5.4, no los cuatro, ya que son para diferentes experimentos.

PRECAUCIÓN: Utilice el EPP adecuado y proceda con cuidado al manipular paraformaldehído (fijador).

1. Preparación para la inmunofluorescencia de montaje plano
   1. Incubar la retina partida en paraformaldehído al 4% sobre hielo durante 30 minutos usando suficiente solución para cubrir completamente la retina.
   2. Lave las retinas divididas 3 veces en 5-10 ml de PBS a temperatura ambiente. Pausa opcional: Las retinas divididas pueden dejarse en PBS a 4 °C durante un máximo de 24 h.
2. Preparación para inmunofluorescencia con cortes verticales de retina dividida
   1. Incubar la retina partida en paraformaldehído al 4% sobre hielo durante 30 minutos usando suficiente solución para cubrir completamente la retina.
   2. Lave las retinas divididas 3 veces en 5-10 ml de PBS a temperatura ambiente. Pausa opcional: Las retinas divididas pueden dejarse en PBS a 4 °C durante un máximo de 24 h.
   3. Con la membrana aún adherida, sumerja secuencialmente la retina dividida en sacarosa al 10%, 20% y 30% a 4 °C durante 1 h cada una para crioproteger el tejido.
   4. Incrustar las retinas divididas crioprotegidas en un compuesto de temperatura óptima de corte (O.C.T.) y almacenarlas a -80 °C (hasta 6 meses) hasta la criosección.
   5. Retire las retinas divididas incrustadas a -80 °C y utilice un criostato para cortar secciones de 20 μm de grosor. Monte las secciones en portaobjetos de microscopio de vidrio cargados electrostáticamente, déjelos secar al aire y luego guárdelos a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
3. Preparación para hibridación in situ de doble fluorescencia e inmunohistoquímica
   1. Incubar la retina partida en paraformaldehído al 4% sobre hielo durante 2 h usando suficiente solución para cubrir completamente la retina.
   2. Lave las retinas divididas 3 veces en 5-10 ml de PBS a temperatura ambiente. Pausa opcional: Las retinas divididas pueden dejarse en PBS a 4 °C durante un máximo de 24 h.
4. Preparación para la electrofisiología
   1. Prepare pipetas de parche tirando de pipetas de vidrio de borosilicato de paredes gruesas con filamento utilizando un extractor de micropipetas. Utilice únicamente pipetas con una resistencia medida entre 6 y 10 MΩ.
   2. Rellene las pipetas extraídas con una solución interna que contenga (en mM): 125 K-gluconato, 8 KCl, 5 HEPES, 1 MgCl 2, 1 CaCl 2,_0,2 EGTA, 3 ATP-Mg y 0,5 GTP-Na.
5. Extirpación de la retina dividida de la membrana de nitrocelulosa
   1. Con un bolígrafo de barrera hidrofóbico, prepare pocillos circulares en un portaobjetos de microscopio (~ 1 cm de diámetro) y déjelos secar al aire durante 5-10 minutos.
   2. Coloque las retinas divididas dentro de los pocillos de la pluma de barrera hidrofóbica preparados y agregue suficiente PBS para cubrirlas por completo.
   3. Bajo un microscopio de disección, empuje las cerdas de un pincel fino debajo de los bordes del tejido y levántelo suavemente hacia arriba. De esta manera, trabaje alrededor de la retina en un círculo para levantarla de la membrana.
   4. Use fórceps para quitar la membrana de debajo de la pieza flotante de retina.
   5. Aspire con cuidado el PBS restante para que el trozo de retina se apoye en el portaobjetos del microscopio, con la célula ganglionar hacia abajo.
      NOTA: Los siguientes pasos no deben realizarse secuencialmente. Elija el protocolo adecuado para la aplicación deseada (es decir, inmunotinción o hibridación in situ de doble fluorescencia [FISH] e inmunohistoquímica [IHQ] o electrofisiología).

6. Inmunotinción

1. Si aún no está preparado, use un bolígrafo de barrera hidrofóbico para crear pocillos circulares en un portaobjetos de microscopio (~ 1 cm de diámetro) y déjelos secar al aire durante 5-10 minutos. Todos los pasos de incubación y lavado se realizarán dentro de estos pocillos.
2. Incubar las retinas divididas o las secciones verticales de retina divididas en una solución de incubación de anticuerpos (AIS: suero de caballo al 3%, Triton X-100 al 0,5%, NaN3 al 0,025% en PBS) durante 30 minutos a temperatura ambiente.
3. Incubar las retinas divididas o secciones verticales de retina divididas con anticuerpos primarios diluidos en AIS durante 1 h a temperatura ambiente.
   NOTA: El tiempo de incubación de anticuerpos primarios requerirá optimización para diferentes dianas proteicas y anticuerpos.
4. Lave el pañuelo 3 veces en PBS a temperatura ambiente.
5. Incubar el tejido con anticuerpos secundarios diluidos en AIS durante 1 h a temperatura ambiente. Lave el pañuelo 3 veces en PBS a temperatura ambiente.
6. Si se desea la tinción nuclear, incubar el tejido con DAPI diluido en PBS durante 30 s a temperatura ambiente. Lave el pañuelo 1 vez en PBS a temperatura ambiente.
7. Aplique una gota de medio de montaje de portaobjetos a cada pieza de tejido y monte un cubreobjetos de vidrio.
8. Aplique esmalte de uñas alrededor de los bordes del cubreobjetos para sellar la muestra. Guarde el portaobjetos a 4 °C.

7. Doble FISH e IHC

1. Hornee las retinas partidas a 40 °C durante 30 min en un horno de hibridación para aumentar la adherencia al portaobjetos.
2. Complete el protocolo RNAscope FISH de acuerdo con el protocolo del fabricante con las siguientes excepciones y alteraciones:
   1. No se requiere ningún paso de recuperación de antígenos. Utilizar proteasa III con un tiempo de incubación de 18 min a temperatura ambiente.
   2. Realice todos los pasos de lavado en el portaobjetos dentro de los pocillos hechos por un bolígrafo de barrera hidrofóbico.
3. Incubar las muestras en anticuerpo primario diluido (ver Tabla de Materiales) en PBS durante 30 min a 40 °C en el horno de hibridación. Lave las muestras 3 veces en PBS a temperatura ambiente.
4. Incubar las muestras en anticuerpo secundario diluido (ver Tabla de Materiales) en PBS durante 30 min a 40 °C en el horno de hibridación. Lave las muestras 3 veces en PBS a temperatura ambiente.
5. Incubar las muestras en 1x DAPI durante 30 s a temperatura ambiente. Lave las muestras 1 vez en PBS a temperatura ambiente.
6. Aplique una gota de medio de montaje antidecoloración a cada pieza de pañuelo y monte un cubreobjetos de vidrio.
7. Aplique esmalte de uñas alrededor de los bordes del cubreobjetos para sellar la muestra. Guarde el portaobjetos a 4 °C.

8. Electrofisiología

1. Después de retirar la membrana de nitrocelulosa, transfiera una retina dividida a la cámara de grabación de patch-clamp y fíjela suavemente en su lugar con un arpa de platino.
2. A lo largo del experimento, perfundir continuamente la retina dividida con una solución de Ames carbogenada con 95% de O2 y 5% de_CO2. Mantener la solución entre 32-34 °C.
   NOTA: Durante el experimento, el tejido se puede visualizar utilizando la microscopía de contraste de gradiente Dodt.
3. Debajo de la iluminación de la habitación, realice una fijación de voltaje de celda completa para registrar desde las neuronas INL.
   1. Durante la grabación, simule las respuestas a la luz utilizando una unidad de inyección microcelular para aplicar compuestos farmacéuticos, o un LED de 470 nm para estimular la canalrodopsina (ChR2).
      NOTA: La intensidad de la luz se puede medir con un medidor de potencia óptica digital.

9. Microscopía confocal

1. Para la inmunofluorescencia confocal, tome imágenes con un microscopio confocal utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 40x/1,3 o 63x/1,40. Utilice FIJI para ajustar el brillo y el contraste y para generar proyecciones Z a partir de pilas de imágenes.

  

Resultados

La división de la retina preserva los terminales de los fotorreceptores

Para confirmar que la división de la retina no daña las dendritas de las neuronas de segundo orden en la OPL, se tiñeron secciones verticales de retinas divididas con anticuerpos contra la proteína de la vesícula sináptica sinaptofisina (verde) y la proteína quinasa C alfa (PKCα; rojo). La intensa banda de marcaje de sinaptofisina en la parte superior de la retina dividida indica que los terminales sinápticos fotorreceptores están retenidos (Figura 2). Además, la tinción con PKCα revela una morfología normal de las células bipolares (RBC) de los bastones. No se ven núcleos fotorreceptores, lo que indica que la retina está dividida entre la OPL y la fila más interna de cuerpos celulares fotorreceptores (Figura 2).

Figura 2: Las retinas divididas conservan los terminales fotorreceptores. Micrografías confocales fluorescentes que muestran una sección transversal vertical de una retina de saliva criocortada (20 μm de espesor) siguiendo el procedimiento de división. Cada imagen es una proyección máxima de una pila z confocal. La sección fue inmunomarcada con anticuerpos contra PKCα (arriba en el centro) y sinaptofisina (arriba a la derecha) para visualizar los glóbulos rojos y las vesículas sinápticas, respectivamente. La imagen combinada (abajo) muestra vesículas sinápticas (verde), que residen en los terminales fotorreceptores, justo por encima de las apófisis apicales de los glóbulos rojos (rojo) en la OPL. Los núcleos celulares están marcados con DAPI (azul). No hay núcleos fotorreceptores visibles dentro de la ONL. Abreviaturas: ONL = capa nuclear externa; OPL = capa plexiforme externa; INL = capa nuclear interna; IPL = capa plexiforme interna; GC = células ganglionares. Barras de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  

La morfología de la sinapsis en la LPO se conserva después de la división de la retina

Utilizando un ratón que expresa GFP en glóbulos rojos bajo el promotor de pcp2,^se inmunomarcaron 14 proteínas pre y postsinápticas en la OPL para evaluar la integridad de esta capa sináptica después de una división¹⁴. A pesar de las fuerzas de cizallamiento que se producen a través de los axones de los fotorreceptores, la división no perturba la morfología de las sinapsis de fotorreceptores-BC en la OPL, ya que se observa el posicionamiento normal de las dendritas de los glóbulos rojos, marcadas para RGS11, y las cintas sinápticas de los fotorreceptores, marcadas para CtBP2¹⁵ (Figura 3). Para cada contacto sináptico entre los bastones y los glóbulos rojos, RGS11 se puede ver como puntos rojos que se encuentran dentro de la forma de herradura de las cintas sinápticas (verde). En un experimento posterior, se utilizó un anticuerpo anti-GPR179 16 para marcar las puntas dendríticas postsinápticas ON-BC¹⁶, y un anticuerpo anti-PSD-95 para marcar los terminales de los fotorreceptores presinápticos (Figura suplementaria 2). Estos resultados confirman una vez más la estabilidad de la OPL en la preparación de la retina dividida, ya que se ha demostrado que las dendritas de los glóbulos rojos se asocian estrechamente con su compañero presináptico, los terminales de los bastones.

Figura 3: La morfología de la sinapsis en la LPO se conserva después de la división de la retina. Imágenes de inmunofluorescencia confocal de una retina dividida de un ratón transgénico que expresa GFP en glóbulos rojos bajo el promotor de Pcp2. Los niveles de expresión de GFP (azul) varían entre los glóbulos rojos de la retina. Después de la división, la retina se fijó y luego se incubó con anticuerpos contra CtBP2 (verde) y RGS11 (rojo) para marcar las cintas sinápticas de los fotorreceptores y las puntas dendríticas ON-BC, respectivamente. Cada par rojo-verde representa un contacto sináptico entre un bastón y un ON-BC. Barras de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La división de la retina mantiene la viabilidad de los glóbulos rojos

Para evaluar la viabilidad de las neuronas retinianas internas después de una división, se utilizó un colorante nuclear de infrarrojo cercano impermeable a la membrana (MI-NIR), que permite la identificación de células muertas. Después de la incubación con MI-NIR, se fijaron las retinas divididas y luego se marcaron con anti-PKCα para identificar los glóbulos rojos. Las micrografías confocales de la retina dividida revelan la variabilidad regional en la viabilidad celular en todo el tejido, y algunas regiones experimentan tasas más altas de muerte celular que otras. Esta variabilidad puede ser el resultado del daño infligido a ciertas regiones de la retina durante los procedimientos de disección, división o manipulación (Figura 4). Dado que los cuerpos celulares de los glóbulos rojos residen en la región más externa de la INL, cerca del sitio de la división, se justificó una evaluación cuidadosa de su viabilidad. La escasa colocalización de PKCα y MI-NIR confirmó que la mayoría de los glóbulos rojos siguen siendo viables después de la división de la retina (Figura 4).

Figura 4: Las células bipolares de bastones son viables después de la división de la retina. Micrografías confocales fluorescentes que muestran una región de una retina dividida en una perspectiva de montaje plano. Después de la división, la retina viva se incubó con colorante MI-NIR (rojo) durante 30 min a 37 °C. A continuación, se fijó la retina y se le inmunizó con anticuerpos contra PKCα para visualizar los glóbulos rojos. En esta región de la retina, la colocalización de PKCα y MI-NIR es poco frecuente. MI-NIR se colocaliza con núcleos (azules) que no pertenecen a los glóbulos rojos. Abreviaturas: MI-NIR = tinción NIR viva/muerta impermeable a la membrana. Barras de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  

Las retinas divididas son susceptibles a la doble FISH y IHQ

Al extender el tiempo de fijación para la IHQ estándar, las retinas divididas pueden ser procesadas secuencialmente por FISH e IHQ para etiquetar ARNm y proteínas simultáneamente^17,18. Los experimentos confirmaron que una fijación de 2 h en paraformaldehído al 4% produce un marcado robusto del ARNm al tiempo que preserva los epítopos de las proteínas para la unión de anticuerpos. Se realizó FISH en retinas divididas seguido de IHQ para visualizar la expresión de la subunidad δ del receptor GABA_A (GABRD; sondas de ARNm antisentido) en relación con la posición de los glóbulos rojos (anticuerpo anti-PKCα) en la INL externa (Figura 5A). La expresión del ARNm de GABRD parece ser poco frecuente en los glóbulos rojos (Figura 5A); sin embargo, la transcripción se expresa abundantemente en las células amacrinas y en las células ganglionares, como lo demuestra el patrón de marcaje en secciones transversales de una retina intacta (Figura 5B). En la INL externa (Figura 5A), el ARNm de GABRD se distribuye de manera más uniforme en comparación con la INL interna (Figura 5C), donde se concentra en células distintas. Las sondas antisentido dirigidas a otras subunidades del receptor GABA producen patrones de etiquetado distintos, lo que demuestra la especificidad de las sondas (datos no mostrados).

Figura 5: FISH e IHQ duales en una retina dividida y una retina intacta. (A, C) Micrografías confocales de una retina dividida de montaje plano y (B) una sección vertical de una retina intacta. Las imágenes en (A) y (C) son proyecciones máximas de secciones ópticas en las regiones superior e inferior del INL respectivamente. Los rectángulos punteados en (B) representan los límites aproximados utilizados para crear las proyecciones que se muestran en (A) y (C). La retina dividida (A, C) se fijó durante 2 h, luego se marcó con sondas de ARNm antisentido contra GABRD (rojo). Posteriormente, la retina dividida se tiñó con anticuerpos contra PKCα para marcar los glóbulos rojos (verde). El canal PKCα se omitió de las proyecciones de la INL inferior para mayor claridad. La retina intacta en (B) se fijó durante 24 h antes de la sección. Posteriormente, la retina fija se marcó con sondas de ARNm antisentido contra GABRD (rojo). Todas las muestras se tiñeron con DAPI (azul) durante 20 s antes del montaje del cubreobjetos. Abreviaturas: INL = capa nuclear interna. Barras de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las retinas divididas son muy adecuadas para el registro electrofisiológico de pinzas de parche de BC y HC

Para parchear un soma BC o HC en una retina tradicional de montaje completo, la pipeta debe acercarse desde el lado de las células ganglionares o desde el lado del fotorreceptor. Ambos abordajes requieren atravesar varias capas de la retina para llegar a la INL, durante la cual la punta de la pipeta a menudo se obstruye con residuos. En una preparación de corte de vibratome, los somas BC y HC son fácilmente accesibles, pero sus procesos dendríticos pueden cortarse, interrumpiendo sus conexiones laterales. Sin embargo, en las retinas divididas, los cuerpos celulares de los glóbulos rojos y los HC se encuentran en la superficie del tejido, lo que proporciona un acceso muy mejorado a las pipetas de parche al tiempo que preserva los circuitos laterales de la OPL.

La Figura 6 muestra las respuestas a la luz simuladas químicamente registradas a partir de BC en una retina dividida. El medio de Ames perfundido se suplementó con L-AP4 (4 μM), un agonista mGluR del grupo III, para simular la liberación de glutamato de los fotorreceptores en la oscuridad. El antagonista de mGluR6, CPPG (600 μM, en Ames), se infló sobre las dendritas de la célula parcheada (mantenida a -60 mV) para simular un destello de luz mediante la inhibición de mGluR6. Las células respondieron a las bocanadas de CPPG con dos tipos de corrientes internas. Un tipo muestra una corriente transitoria seguida de una meseta (Figura 6A), similar a las corrientes canónicas evocadas por la luz registradas de los glóbulos rojos en cortes de retina¹⁹. El otro tipo permanece sostenido durante toda la duración de la inhalación (Figura 6B), asemejándose a las corrientes registradas por las células bipolares del cono ON (ON-CBC⁾¹⁹.

Se realizó un experimento separado para apuntar a HCs, un tipo de célula con un amplio campo dendrítico que a menudo es difícil de preservar en preparaciones de cortes. Se utilizó una línea de ratón que expresaba el canal rodopsina (ChR2) y GFP en HC para facilitar la identificación bajo un microscopio de fluorescencia. En primer lugar, se registraron las corrientes de los HC en respuesta a una serie de pasos de despolarización (-100 mV a 50 mV, tamaño del paso = 15 mV) a los que respondieron con corrientes hacia adentro seguidas de corrientes hacia afuera (Figura 6C). A continuación, estas células se estimularon con un breve pulso de luz azul (200 ms, 470 nm) que produjo grandes corrientes internas impulsadas por ChR2 en dos células (Figura 6D).

Figura 6: Registros de pinza de parche de neuronas INL en retinas divididas. (A) Un supuesto hematíbulo y (B) hemograma completo se sujetaron con voltaje a -60 mV en medios Ames perfundidos que contenían L-AP4 (4 μM). La inhalación de CPPG (600 μM) sobre las dendritas de las células pinzadas invocó una corriente hacia adentro que era transitoria en el hematíes pero sostenida en el hemograma. El registro de RBC en (A) es una sola traza, mientras que el registro de CBC en (B) representa el promedio de 3 trazas. (C) Una grabación de pinza de parche de un HC en un vGATFLPo; vGlut2Cre; Ratón Ai80d. La línea roja muestra la duración de un pulso de luz de 200 ms y 470 nm utilizado para invocar la gran corriente interna a través de ChR2. (D) Respuestas de corriente inyectadas de un HC que se fijó a -60 mV, luego se escalonó entre -70 mV y +35 mV en intervalos de 15 mV y regresó a -60 mV. El recuadro muestra las mismas trazas en una ventana de 6 ms que rodea el inicio del paso de voltaje. (E) Micrografía inmunofluorescente de una retina dividida de montaje plano que muestra células horizontales que expresan GFP en un vGATFLPo; vGlut2Cre; Ratón Ai80d. Barra de escala = 20 μm. Los datos electrofisiológicos se recogieron a una frecuencia de muestreo de 20 kHz y se filtraron con un filtro Bessel de paso bajo a 5 kHz. A continuación, se exportaron los datos y se realizó la visualización y el análisis fuera de línea con Python 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La división de la retina permite una rápida interrogación de la anatomía de INL y OPL

La membrana limitante externa (ELM) y la ONL de la retina comprenden una barrera de ~90 μm de espesor, que impide la difusión de anticuerpos en la retina interna y crea condiciones inmunológicas subóptimas^20,21,22. Por lo tanto, el inmunomarcaje de dianas en la LPO o la LIN utilizando una retina convencional de montaje plano requiere protocolos de tinción que requieren mucho tiempo y que a menudo requieren incubaciones de anticuerpos de 48 a 96 h 5,6,7,8,20,22.

La eliminación de los fotorreceptores permite una rápida penetración de anticuerpos en las neuronas internas de la retina. Como resultado, el marcaje de las dianas proteicas de la retina interna se puede lograr en tan solo 1 h con el uso de anticuerpos primarios conjugados con colorante. Se utilizaron anticuerpos contra PKCα y Calbindina-D para marcar los glóbulos rojos y las HC de la NLI respectivamente (Figura 7). A diferencia de las secciones verticales tradicionales de la retina que truncan los procesos laterales de las neuronas de campo amplio, la preparación de la retina dividida permite la visualización del árbol dendrítico completo de las células de campo amplio, como las HC (Figura 6E, Figura 7).

Figura 7: Inmunomarcaje rápido de proteínas internas de la retina en una retina dividida. Imágenes de inmunofluorescencia confocal de una retina dividida desde una perspectiva de montaje plano. La retina dividida se incubó con anticuerpos contra PKCα (amarillo) y Calbindina-D (verde) durante 1 h a temperatura ambiente para marcar ON-BC y HC respectivamente. (A) Cada imagen de un solo canal es una proyección Z promedio compuesta por cuatro secciones ópticas: DAPI, Promedio z10-13; Calbindina-D, Promedio z11-14; PKCα, Promedio z11-14. (B) En la imagen combinada, se superponen las mismas proyecciones. Barras de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Etapas clave de la disección de retina. Todas las imágenes se tomaron con la cámara de un teléfono inteligente montada en las lentes oculares de un microscopio de disección. (A) Una imagen de arriba hacia abajo de un ojo de ratón después de la extracción de la córnea. (B) Una imagen de arriba hacia abajo del ocular del ratón después de que se haya retirado la lente. (C) Se hace una pequeña incisión en la esclerótica del ocular del ratón. Las flechas indican los dos colgajos de la esclerótica que son tirados en direcciones opuestas por fórceps para comenzar a separar la retina de la esclerótica. (D) Después de que la esclerótica se ha separado parcialmente de la retina, se insertan tijeras Vannas entre la esclerótica y la retina, y se corta el nervio óptico, liberando la retina. El círculo punteado rojo muestra la cabeza del nervio óptico y las tijeras muestran la trayectoria de corte correcta (inserte las tijeras entre la esclerótica y la retina). La retina aislada después de que se arranca la esclerótica. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Caracterización de los componentes pre y postsinápticos de la OPL en la retina dividida. Imágenes de inmunofluorescencia confocal de la LPO en una retina dividida. La retina dividida se incubó con anticuerpos contra GPR179 y PSD95 durante 1 h a temperatura ambiente para marcarse en las puntas dendríticas de los ON-BC y en los terminales de los fotorreceptores de bastones, respectivamente. Las imágenes de la izquierda y del centro son proyecciones máximas de varias secciones ópticas; Las mismas proyecciones se superponen en la imagen de la derecha. Se observa que los puntos GPR179 en las puntas dendríticas ON-BC se asocian estrechamente con los terminales de los fotorreceptores de los bastones, lo que demuestra contactos sinápticos intactos dentro de la OPL. Barras de escala = 10 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Solución de problemas: evaluación de la calidad de una retina dividida. Micrografías fluorescentes de una retina dividida teñida con DAPI para visualizar núcleos celulares. Las células se pueden identificar en función del diámetro y la profundidad del tejido del núcleo. (A) Los núcleos fotorreceptores son más pequeños, más brillantes y más superficiales, mientras que (B) los núcleos BC son más grandes, más tenues y más profundos. (C) Una imagen de bajo aumento de una región donde los fotorreceptores se eliminaron de manera incompleta. Los núcleos que aparecen enfocados son de BC, que son más profundos que los núcleos fotorreceptores en los bordes de la imagen que aparecen desenfocados. Barras de escala para (A) y (B) = 20 μm. Barra de escala para (C) = 50 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Después de que los fotorreceptores transducen la absorción de fotones en liberación de neurotransmisores, las BC y HC son las primeras neuronas de la retina en procesar la señal visual²³. Si bien la importancia de estas neuronas es bien apreciada, muchas de sus funciones no se comprenden completamente o no se exploran por completo. Es probable que muchos estudios de fisiología de BC y HC se beneficien de una preparación de retina de montaje plano que mejore el acceso a las neuronas INL al tiempo que preserva la conectividad lateral. El desarrollo del método de retina dividida representa un esfuerzo por proporcionar un protocolo sencillo para adquirir registros electrofisiológicos de alta calidad y datos de microscopía de BC y HC en una orientación de montaje plano. La preparación de la retina dividida descrita aquí se puede realizar en aproximadamente 20 minutos por ratón (10 minutos por retina) después del aislamiento de la retina, sin el uso de equipos especializados. El método se inspira en los procedimientos de eliminación de fotorreceptores existentes, pero ofrece mejoras significativas en simplicidad, velocidad y versatilidad 4,10,11,12,13. A diferencia de los métodos anteriores para separar las capas de la retina, la división de la retina no requiere congelación, liofilización o aplicación repetida de adhesivos a la retina. Con la práctica, casi todos los fotorreceptores se pueden eliminar de una sola vez con la membrana de nitrocelulosa. La velocidad y facilidad de este enfoque permite minimizar el tiempo que la retina pasa fuera de Ames carbogenados, lo que permite una alta viabilidad celular durante largos períodos; Las retinas divididas se pueden mantener en medios Ames carbogenados durante varias horas después de la división. Como testimonio de la salud de las neuronas INL en esta preparación, una tinción de células vivas/muertas (Figura 4) y la electrofisiología de patch-clamp (Figura 6) confirman la viabilidad de los glóbulos rojos y los HC después de una división.

La eliminación de la capa fotorreceptora en las retinas divididas supone una ventaja significativa durante el inmunomarcaje al reducir drásticamente el tiempo de difusión de los anticuerpos en la INL. El marcaje de anticuerpos primarios y secundarios se puede completar en 2 h, una mejora sustancial con respecto a la tinción convencional de montaje plano, que puede tardar 72 h o más, dependiendo del objetivo 5,6,7,8,20,22. Como resultado, los datos de microscopía se pueden adquirir el mismo día que la preparación del tejido, lo que acelera drásticamente el ritmo de los experimentos de inmunofluorescencia. Para facilitar el recocido de la sonda de ARNm, los experimentos FISH suelen recomendar tiempos de fijación mucho más largos (~24 h) que el inmunomarcaje¹⁸. Sin embargo, los experimentos presentados aquí demuestran que una fijación de 2 h sigue produciendo un marcaje excepcional de FISH (Figura 5). A pesar de extender el tiempo de fijación de 30 min a 2 h, no fue necesario realizar pasos de recuperación de antígenos para obtener un excelente inmunomarcaje, pero esto puede variar con el anticuerpo o el antígeno. El tratamiento con proteasa en el protocolo FISH puede interferir con el marcaje de anticuerpos, probablemente debido a la destrucción de los epítopos diana. Este problema se evitó mediante el uso de anticuerpos policlonales que se dirigen a múltiples epítopos, lo que disminuye la probabilidad de que la destrucción de los epítopos dificulte el inmunomarcado. Además, se utilizó un tratamiento con proteasa moderada (ACD proteasa III) para prevenir la alteración excesiva del epítopo y, al mismo tiempo, proporcionar una penetración tisular suficiente.

En ocasiones, la retina se divide a través de la capa nuclear externa (ONL), dejando capas de somas fotorreceptores sin células INL visibles. Para evitar esto, uno debe asegurarse de que la retina quede completamente plana sobre el vidrio y que se haya eliminado cualquier líquido residual alrededor de la retina. Presionar con más firmeza sobre la nitrocelulosa con el pincel también puede ayudar a evitar que se parta a través de la ONL. Si la membrana se humedece demasiado o la retina se pliega sobre sí misma, las posibilidades de una división exitosa disminuirán considerablemente. El uso de DAPI para teñir núcleos celulares es útil para evaluar la calidad de la división y para determinar la cobertura de los fotorreceptores restantes. Los núcleos fotorreceptores son más pequeños, más brillantes y más superficiales (Figura suplementaria 3A), mientras que los núcleos BC son más grandes, más tenues y más profundos (Figura suplementaria 3B). En algunos casos, el plano del desgarro variará ligeramente a lo largo de la parte de la retina, lo que dará lugar a parches en los que los cuerpos celulares fotorreceptores no se han eliminado por completo (Figura complementaria 3C). Para aplicaciones en microscopía y electrofisiología, esto no obstaculiza la capacidad de recopilar datos de calidad de regiones donde los fotorreceptores se han eliminado correctamente; Se pueden encontrar fácilmente grandes campos de retina interna expuesta cuando se toman imágenes o se graba con una pipeta de parche. Si se desea una eliminación más completa de los fotorreceptores, se puede realizar un segundo desgarro con una pieza adicional de membrana de nitrocelulosa, aunque no se garantiza la eliminación del 100% de los fotorreceptores. Por lo tanto, se recomienda precaución al utilizar retinas divididas en estudios de expresión génica o proteómica en los que el material fotorreceptor residual podría influir en los resultados. En el caso de las aplicaciones de una sola célula, esta preocupación es injustificada, ya que los datos de los fotorreceptores pueden excluirse del análisis.

Las ventajas de la preparación de la retina dividida son quizás más destacadas en los registros electrofisiológicos de interneuronas de campo amplio. Mientras que los cortes verticales tradicionales cortan los extensos procesos de las células de campo amplio, la preparación de la retina dividida deja intactas la OPL y la IPL, lo que permite capturar la entrada de las células de campo amplio como HC 24, A17s²⁵, TH AC 26 y NOS-1 AC²⁷ que de otro modo se pasarían por alto en los cortes verticales. Por lo tanto, la interpretación de los resultados y la comparación con los datos previos recopilados de cortes de retina requiere una reflexión cuidadosa. Sin embargo, en experimentos que utilizan imitaciones farmacológicas de la estimulación lumínica, estos resultados se asemejan a los datos registrados a partir de cortes de retina¹⁹. Al expresar ChR2 bajo promotores específicos de la célula, se puede estimular una población celular deseada mientras se registran los BC en el INL para investigar el impacto de la célula deseada en la vía de información vertical. El registro directo de las neuronas INL más profundas, como las células amacrinas, también es factible en la retina dividida. Si bien en este caso el electrodo de parche debe viajar primero a través de las neuronas INL más superficiales, hay considerablemente menos tejido que obstruye su camino en comparación con una preparación tradicional de montaje completo.

Además de medir la influencia de las células de campo amplio en otras neuronas, este método permite el pinzamiento directo de parches unicelulares a partir de HC, cuyas dendritas forman una extensa red acoplada de unión gap en el OPL²⁸. Las células horizontales envían una retroalimentación crítica a los fotorreceptores, lo que da forma a la transmisión de información vertical a través de la retina. Sin embargo, dado que los campos dendríticos de los HC se truncan en cortes verticales, faltan datos de registro de una sola célula. En este trabajo se presentan HCs anatómica y fisiológicamente intactas a partir de las cuales se registran corrientes evocadas por ChR2 en una línea triple de ratones transgénicos (Figura 6 C-E). Fuera de la estimulación ChR2, la retina dividida se puede utilizar para estudiar las corrientes endógenas de HC y el acoplamiento de la unión gap²⁸. Si bien la retina dividida proporciona un modelo conveniente para estudiar la conectividad sináptica y la actividad neuronal inducida por la aplicación química o la estimulación de ChR2, la falta de fotorreceptores impide cualquier exploración directa de las respuestas naturales a la luz o los mecanismos de adaptación a la luz.

La obtención de imágenes in situ en la retina ha hecho un progreso admirable en los últimos años. Sin embargo, la mayoría de los estudios de imagen se limitan a la capa de células ganglionares en las preparaciones de retina de montaje completo²⁹. Los autores prevén que la ausencia de fotorreceptores en la retina dividida la convertirá en un modelo ideal para obtener imágenes de calcio en vivo en la OPL y la INL. Más allá de las imágenes de calcio, este modelo tiene un gran potencial para su uso con biosensores codificados genéticamente como iGluSnFR 30,31^, iGABASnFR³² y pHluorin³³. Combinadas con la preparación de la retina dividida, estas poderosas herramientas pueden ofrecer un enfoque eficiente para explorar las interacciones sinápticas y las propiedades biofísicas de los BC y HC que contribuyen al procesamiento de la luz en la retina.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cubiertas de cristal #1.5	Fisherbrand	12544E
2 pares de pinzas Dumont #5	Ted Pella	38125
Aguja calibre 25	Becton Dickenson	305122
LED de 470 nm	THORLABS	M470L2
Tijeras curvas 5-306	Miltex	5-306
Pipetas pasteur desechables de 9"	Fisherbrand	13-678-20D	para construir una pipeta de transferencia personalizada
Ratón Ai80d	Laboratorios Jackson	25109	RRID: IMSR_JAX:025109
Medio de Ames con L-Glutamato	E. UU.	A1372-25
Software de control del amplificador	Dispositivos moleculares	Software Clampex 10.3
anti-calbindina anti-D28K	Invitrogen	PA-5 85669	RRID: AB_2792808, especie hospedadora = conejo; Dilución 1:100
Anticuerpo anti-CtBP2	BD Biociencias	612044	RRID:  AB_399431, especie hospedadora = ratón; Dilución 1:5000
Anticuerpo anti-GPR179	NA	NA	regalo de Kirill Martemyanov; Instituto de Investigación Scripps, Jupiter, FL; Especie hospedadora = ovejas; Dilución 1:1000
Anticuerpo alfa anti-PKC	Sigma-Aldrich	P4334	RRID: AB_477345, especie hospedadora = conejo; Dilución 1:5000
Anticuerpo alfa anti-PKC	Santa Cruz Biotecnología	sc8393 AF594	RRID: AB_628142, especie hospedadora = ratón; Dilución 1:1000
Anticuerpo anti-PSD95	Laboratorios de Transducción BD	610495	RRID:  AB_397862, especie hospedadora = ratón; Dilución 1:1000
Anticuerpo anti-RGS11	NA	NA	regalo de Ted Wensel; Baylor College of Medicine, Houston, TX;   especie hospedadora = conejo; dilución entre 1:1000 y 1:5000
Anticuerpo antisinaptofisina P38	Sigma	S-S5768	RRID: AB_477523, especie hospedadora = ratón; Dilución 1:1000
Medios de montaje Aquamount	Epredia	13800	Medio de montaje de la corredera
Ratón C57BL/6J	Laboratorios Jackson	000664	RRID: IMSR_JAX:000664
Depósito de carbogénio	Matheson	NA	95% O2 y 5% CO2
Pipeta de transferencia personalizada	Construcción personalizada	NA	Instrucciones: usa tijeras para cortar la punta de una pipeta de transferencia plasitc en el punto en que empieza a estrecharse. Usa alicates para romper con seguridad los últimos 2-3 centímetros de una pipeta pasteur de cristal. Coloca el extremo estrecho de la pipeta pasteur de vidrio en la punta ancha de la tubería de transferencia de plástico. Envuelve parafilm alrededor de la unión de las dos piezas para mejorar el sello.
Medidor de potencia óptica digital	THORLABS	PM100D
Microscopio de disección	Zeiss	Stemi 2000
Amplificador de electrofisiología	Dispositivos moleculares	Axopatch 200B
Microscopio electrofisiológico	Olimpo	OLYMPUS, BX50WI	Microscopía de contraste por gradiente Dodt
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
HC PL APO CS2 40x/1.3	Leica	506358
HC PL APO CS2 63x/1.40	Leica	15506350
Horno de hibridación	Robbins Scientific	Modelo 1000	solo para el protocolo RNAscope
Corral barrera hidrofóbico Immedge	Laboratorios Vector	H-4000
isoflurano	Cuidados Críticos Piramal.	66794-017-25
Kimwipe (limpieza delicada para tareas delicadas)	Ciencia Kimtech	34155
Objetivo de inmersión en aceite Leica HC PL AP CS2 40x/1.3	Leica	506358
Objetivo de inmersión en aceite Leica HC PL APO CS2 63x/1.40	Leica	15506350
Microscopio confocal Leica TCS SP8 X	Leica	Descontinuado
placa de Petri media de 15 mm	Corning	25060-60	Los ojos se mantienen aquí durante la disección de retina
Tijeras de acero Merit 97-275	Mérito	97-275
Extractor de micropipetas	Instrumento Sutter	P-97
Sonda de ARNm Mm-Gabrd-C2	ACD	459481-C2
Cámara de eutanasia para ratones	NA	NA	construcción personalizada; Placa de Petri de cristal cubriendo un pequeño tarro de cristal.
Filtros de membrana de nitrocelulosa	GE Ciencias de la Vida en la Atención Sanitaria; Whatman	7184-005	0,45 & micro; m tamaño de poro
Picospritzer	General Valve Corporation	Picospritzer II	Referido en el texto como unidad de inyección microcelular
Pipetas de transferencia plásticas	Fisherbrand	13-711-7M	para construir una pipeta de transferencia personalizada
Tubo de plástico	Tygon	R-603	para la conexión al tanque de carbogen
Arpa de platino	Construcción personalizada	NA	para anclar retinas divididas dentro de la cámara de registro electrofisiológica.
Pincel tamaño 0	genérico	NA	para aplanar la retina durante la división.
Reactivo antifade SlowFade Gold	Sondas moleculares	S36937	Referido en el texto como soporte de montaje anti-fundido
Pequeña placa de Petri de 10 mm	Halcón	353001	Los ojos se colocan aquí tras la enucleación
Pequeño cristal (7,5 cm x 5 cm)	genérico	NA	Se colocan piezas aisladas de retina sobre esta para el procedimiento de división
Superfrost más portaobjetos de microscopio	Fisherbrand	12-550-15	Portaobjetos de microscopio de vidrio cargados electrostáticamente
Pipetas de vidrio borosilicato de pared gruesa con filamento y nbsp;	Instrumento Sutter	BF150-86-10HP
Vannas Tijeras; recto	Titan Medical	TMS121	no específico de la marca; Cualquier tijera comparable servirá
Ratón vGATFLPo	Laboratorios Jackson	29591	RRID: IMSR_JAX:029591
Ratón vGlut2Cre	Laboratorios Jackson	28863, 016963	RRID: IMSR_JAX:028863, RRID: IMSR_JAX:016963
Kit de Viabilidad Reparable Zombie NIR	BioLegend	423105	referido en el texto como MI-NIR