Seguimiento de la liberación de miARN en vesículas extracelulares mediante citometría de flujo

Resumen

Aquí, describimos un protocolo sencillo que permite la evaluación in vitro de la abundancia de microARN marcados con fluorescencia para estudiar la dinámica del empaquetamiento y exportación de microARN a vesículas extracelulares (EV).

Resumen

Las vesículas extracelulares (VE) son mediadores importantes de la comunicación celular que son secretadas por una variedad de células diferentes. Estos VE transportan moléculas bioactivas, incluidas proteínas, lípidos y ácidos nucleicos (ADN, ARNm, microARN y otros ARN no codificantes), de una célula a otra, lo que tiene consecuencias fenotípicas en las células receptoras. De todas las diversas cargas de VE, los microARN (miARN) han atraído una gran atención por su papel en la configuración del microambiente y en la educación de las células receptoras debido a su clara desregulación y abundancia en los VE. Los datos adicionales indican que muchos miARN se cargan activamente en los VE. A pesar de esta clara evidencia, la investigación sobre la dinámica de la exportación y los mecanismos de clasificación de miARN es limitada. Aquí, proporcionamos un protocolo que utiliza el análisis de citometría de flujo de EV-miRNA que se puede utilizar para comprender la dinámica de la carga de EV-miRNA e identificar la maquinaria involucrada en la exportación de miRNA. En este protocolo, los miARN predeterminados para enriquecerse en VE y agotarse de las células del donante se conjugan con un fluoróforo y se transfectan en las células del donante. A continuación, se verifica la carga de los miARN marcados con fluorescencia en los VE y el agotamiento de las células mediante qRT-PCR. Como control de transfección y como herramienta para controlar la población transfectada de células, se incluye un ARN celular marcado con fluorescencia (retenido por células y agotado por EV). Las células transfectadas tanto con el miARN EV como con el miARN retenido por células se evalúan en busca de señales fluorescentes en el transcurso de 72 h. La intensidad de la señal de fluorescencia específica para los miARN EV disminuye rápidamente en comparación con el miARN retenido en la célula. Utilizando este sencillo protocolo, ahora se podría evaluar la dinámica de la carga de miARN e identificar varios factores responsables de la carga de miARN en los VE.

Introducción

Los microARN (miARN) son uno de los subconjuntos mejor caracterizados de pequeños ARN no codificantes, que son conocidos por su papel fundamental en la regulación génica postranscripcional. La expresión y la biogénesis de la mayoría de los miRNAs siguen una serie coordinada de eventos que comienza con la transcripción de los miRNAs primarios (pri-miRNAs) en el núcleo. Después del procesamiento nuclear por el complejo del microprocesador en miARN precursores (pre-miARN), los pre-miARN se exportan al citoplasma, donde se someten a un procesamiento adicional por la endonucleasa ARNasa III, en dúplex de miARN maduros de 21-23 nucleótidos¹. Una de l....

Protocolo

NOTA: Como requisito previo para utilizar esta técnica, se requiere la identificación y validación de los miARN exportados selectivamente. Dado que las diferentes líneas celulares varían en función de la carga de miARN clasificada en sus EV, se recomienda que la línea celular de interés y las VE asociadas se evalúen en busca de miARN antes de su uso. Además, la transfección basada en lipofectamina es uno de los pasos críticos del protocolo; Se recomienda predeterminar la eficiencia de la transfección antes de configurar el experimento.

1. Células en cultivo y transfección de células con EV-miRNA conjugado con fluoróforos

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Resultados

Aquí, utilizamos la citometría de flujo como una herramienta poderosa para investigar la liberación de miARN de las células en las VE. Utilizando este protocolo, el análisis de citometría de flujo de células transfectadas con miRNA celular y miARN EV reveló una disminución secuencial de la señal de fluorescencia correspondiente al miARN EV, mientras que la señal correspondiente al miARN celular se retuvo en las células. Para garantizar que la conjugación de fluoróforos no interfiera con la liberación de miARN en los EV, .......

Discusión

El protocolo recientemente establecido permite capturar la cinética de liberación de miARN en los VE después de la transfección de los MIARN de EV. El enfoque permite el análisis simultáneo de múltiples EV-miRNAs y miRNAs celulares, sujeto a las capacidades del citómetro. Además, aunque el análisis de citometría de flujo puede proporcionar información valiosa sobre la biología de los miARN de los VE, no está exento de limitaciones. Sin embargo, algunas de las limitaciones pueden superarse cuando se utilizan junto con otr.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Fisher	05-408-129
Tubos Falcon de 15 mL	Placas de
de 6 pocillos	Fisher Scientific	FB012927
ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm)	Apogee Flow Systems	1527	Para configurar la compuerta y los parámetros para la detección de partículas
Attune Nxt Citómetro de flujo	ThermoFisher Scientific	N/A	Para el análisis de fluorescencia en EVs
BD Fortessa Cell Analyzer	BD Biosciences	N/A	Para el análisis de fluorescencia en células
Incubadora de cultivos celulares	N/A	N/A	Manteniendo una temperatura de 37  ° C y 5% CO2
medio de cultivo celular	N/A	N/A	específico para la línea celular de interés
Línea celular de interés	N/A	N/A	Cualquier línea celular probada y evaluada para EV y abundancia celular de miRNAs en interés.
MiRNA celular (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control)	Descubrimiento del horizonte	CP-004500-01-05	miRNAs predeterminados para ser retenidos por la línea celular de interés y no exportados selectivamente a EVs
EV-miRNAs (miRNAs conjugados con fluoróforos)	Tecnologías de ADN integradas (IDT)		miRNAs predeterminados para ser clasificados selectivamente en EVs
Microscopio de fluorescencia	N/A	N/A
Gibco Opti-MEM Medio de suero reducido	Fisher Scientific	31-985-070
Hemocitómetro Hausser Scientific	Fisher	02-671-54
Hyclone 1x PBS (para cultivo celular)	Fisher	SH30256FS
Lipofectamine RNAimax	Fisher Scientific	13-778-150
miRCURY LNA Transcriptasa inversa	Qiagen	339340
miRCURY LNA SYBR Green PCR	Qiagen
mirVana Aislamiento de ARN	Qiagen	AM1561
Agua libre de nucleasa	Fisher Scientific	4387936
Paraformaldehído, 4% en PBS	Fisher AAJ61899AK
Depósito de reactivos no estéril	VWR	89094-684
Thermo ABI QuantiStudio DX PCR en tiempo real	ThermoFisher Scientific	N/A
Tripsina 0.25%	Fisher
Ultracentrífuga	N/A	N/A