Evaluación del consumo de oxígeno mitocondrial mediante un ensayo fluorescente basado en un lector de placas

Summary

La evaluación del consumo de oxígeno proporciona información integral sobre la función mitocondrial. Utilizando una sonda fosforescente con un lector de placas fluorescentes, se pueden obtener fácilmente datos precisos y reproducibles sin necesidad de un equipo especializado. Este ensayo permite a cualquier laboratorio medir el consumo de oxígeno de las mitocondrias aisladas y calcular las proporciones de control respiratorio.

Abstract

Las mitocondrias cumplen muchas funciones importantes, como la respiración celular, la producción de ATP, el control de la apoptosis y la actuación como eje central de las vías metabólicas. Por lo tanto, la evaluación experimental de la funcionalidad mitocondrial puede proporcionar información sobre las variaciones entre diferentes poblaciones o estados de enfermedad. Además, es valioso evaluar si las mitocondrias aisladas son lo suficientemente saludables como para proceder con los experimentos. Una característica que se utiliza a menudo para comparar la función mitocondrial en diferentes muestras es la tasa de consumo de oxígeno. El consumo de oxígeno y el cálculo posterior de la tasa de control respiratorio en células intactas o mitocondrias aisladas de tejido pueden servir para los tres propósitos. Usando mitocondrias aisladas de los hígados de lagartijas de cepillo junto con una sonda fosforescente que es sensible a las fluctuaciones en la concentración de oxígeno de una solución, medimos el consumo de oxígeno utilizando un lector de placas fluorescentes. Este método no solo es rápido y eficiente, sino que también se puede realizar con una pequeña cantidad de mitocondrias y sin la necesidad de equipos especializados. El protocolo paso a paso descrito aquí aumenta la accesibilidad de la evaluación funcional mitocondrial para los investigadores.

Introduction

Las mitocondrias son orgánulos, aproximadamente del tamaño de una bacteria, que se encuentran en las células eucariotas. Son orgánulos únicos porque contienen ADN y tienen dos membranas, una externa y otra interna. Las membranas externa e interna de las mitocondrias están separadas por un espacio intermembrana, y la membrana interna se pliega en estructuras llamadas crestas alrededor del compartimento más interno, llamado matriz. Estas crestas aumentan el área de superficie de la membrana interna para que múltiples procesos que utilizan las crestas puedan ocurrir simultáneamente. Si bien las mitocondrias están involucradas en muchas funciones celulares, como el control de la apoptosis y el alojamiento de múltiples vías metabólicas, su papel vital en la producción de ATP es esencial para la supervivencia celular. De hecho, el 90% de la energía de una célula se deriva de las mitocondrias¹. La producción de ATP implica la generación de una diferencia electroquímica entre las membranas externa e interna, denominada potencial de membrana mitocondrial (Δψ), que surge cuando los iones H⁺ se bombean desde la matriz al espacio intermembrana. La producción de ATP se aprovecha en última instancia durante la oxidación de los equivalentes reductores a través del movimiento de electrones a través de la cadena respiratoria mitocondrial (ETC). El aceptor final de electrones es el oxígeno molecular (_O2). A medida que se consume oxígeno, el diferencial de concentración de H⁺ se acumula hasta su máximo, momento en el que los iones H⁺ bajan por su gradiente de concentración desde el espacio intermembrana hasta la matriz pasando a través del complejo ATP sintasa. El movimiento de los iones H⁺ provoca un cambio conformacional en la ATP sintasa, y el ADP se acerca al fosfato inorgánico para reaccionar y generar ATP. Finalmente, el ATP se transloca de la matriz mitocondrial al citosol y puede almacenarse o usarse para facilitar las reacciones debido a la gran cantidad de energía libre liberada durante la hidrólisis de sus fosfatos. Todo este proceso se denomina fosforilación oxidativa, y dado que se consume oxígeno, se dice que las mitocondrias^respiran.

La acumulación y la fuerza de Δψ, la cantidad de O₂ reducida (denominada consumo de oxígeno), así como la generación de ATP pueden utilizarse como indicadores de la salud celular. Los estudios funcionales mitocondriales, como la medición de Δψ, el contenido y la producción total de ATP y el consumo de oxígeno, se pueden cuantificar mediante métodos bioquímicos tradicionales o fluorescencia y luminiscencia en ensayos basados en placas. Por ejemplo, el potencial de membrana mitocondrial se puede comparar entre diferentes muestras utilizando colorantes fluorescentes como el éster etílico de tetrametilrodamina, que se une específicamente a las mitocondrias. La generación de ATP se puede monitorear agregando una proteína luminiscente a una reacción cuyos cambios se correlacionan con la concentración de ATP. La cuantificación de las tasas de consumo de oxígeno, o tasas absolutas de respiración, durante OXPHOS, puede ayudar a dilucidar las causas de las disparidades en la función mitocondrial y el metabolismo energético. La evaluación del consumo de oxígeno se puede utilizar para calcular las tasas de control respiratorio (RCR). Los valores de RCR describen la capacidad de las mitocondrias para producir ATP en respuesta a la afluencia de ADP, que es la función principal de las mitocondrias. Los valores de RCR indican la condición general de las mitocondrias aisladas y permiten la comparación de las respuestas a diferentes tratamientos experimentales. Las diferencias en los valores de RCR pueden representar una disfunción mitocondrial o indicar una diferencia biológica entre diferentes mitocondrias aisladas de dos o más fuentes. Otra medida importante de la función en las mitocondrias aisladas es la eficiencia mitocondrial definida como moles de ATP sintetizados por moles de_O2, o la relación P/O³.

Dada la cantidad de información que se puede recopilar a partir de la medición de los parámetros mitocondriales y los diversos casos en los que se puede utilizar esta información, la capacidad de recopilar datos funcionales de manera eficiente puede ser útil en muchas áreas de investigación diferentes. Las mediciones del consumo de oxígeno mitocondrial se han realizado durante décadas con instrumentación muy específica, utilizando un electrodo Clark, que puede estar limitado por el tamaño de la muestra necesaria para llevar a cabo las mediciones, y más recientemente, instrumentos sofisticados que pueden medir la respiración mitocondrial y muchos otros parámetros, pero pueden tener un costo prohibitivo. Este protocolo es un enfoque alternativo adaptado que utiliza una sonda fosforescente sensible al oxígeno (MitoXpress)^4,5. La señal de la sonda se detecta con un lector de placas en modo de fluorescencia resuelta en el tiempo para mediciones continuas a lo largo del tiempo. La fosforescencia tiene una mayor diferencia de energía entre el fotón absorbido y el fotón emitido en comparación con la fluorescencia y, por lo tanto, es más adecuada para monitorear continuamente los cambios en la señal. Esto permite que casi cualquier laboratorio realice estas mediciones, no solo aquellos que se centran en el metabolismo mitocondrial o que pueden permitirse equipos altamente especializados. El sistema modelo que utilizamos es mitocondrias aisladas de tres lagartos arborícolas, dos especies parentales y una introgredida (que contiene ADN nuclear de una especie parental y mitocondrias de la otra, híbridos). Estos lagartos fueron elegidos porque planteamos la hipótesis de que hay consecuencias metabólicas y energéticas para los híbridos que tienen diferentes fuentes de ADN nuclear y mitocondrial. Utilizamos un kit de ensayo disponible comercialmente con un lector de placas multimodo que puede aumentar el acceso a este tipo de ensayo a más investigadores y campos de investigación.

Protocol

Los lagartos fueron sacrificados por asfixia con CO₂ seguida de decapitación inmediata de acuerdo con las políticas descritas por la Oficina de Bienestar de Laboratorio Animal y las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Elon.

1. Aislamiento de mitocondrias⁶

NOTA: Mantenga todas las soluciones frías (Tabla 1) y las muestras en hielo durante estos pasos.

1. Retire el hígado, péselo y luego enjuáguelo con ~ 3 mL de solución salina tamponada con fosfato helada (1x, -/-).
2. Pica el hígado en 1 mL de L-MIB con una cuchilla de afeitar nueva.
3. Lleve el volumen total de tejido más L-MIB a 2 mL y altere mecánicamente las células hepáticas durante cuatro pasadas con un homogeneizador Dounce.
4. Centrifugar el homogeneizado a 300 × g (37 °C, 10 min).
5. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y colóquelo sobre hielo.
6. Vuelva a suspender el pellet en 2 mL de L-MIB, vuelva a homogeneizar y vuelva a centrifugar a 300 × g (37 °C, 10 minutos).
7. Combine los sobrenadantes de ambos centrifugados y centrifugue a 10.000 × g (37 °C, 10 min).
8. Vuelva a suspender el pellet en ~0.350 mL de L-MIB.
9. Determine la cantidad de proteína total (mg de mitocondrias/mL de L-MIB) para usar como aproximación del contenido mitocondrial ^4,5,6.

2. Consumo de oxígeno

1. Precalentar todas las soluciones utilizadas (Tabla 1) en los siguientes pasos a 30 °C en un baño de agua.
2. Diluya las mitocondrias en LEB a 6 mg/mL según los resultados del ensayo de concentración de proteínas en el paso 1.9.
3. Coloque el ensayo en una placa inferior transparente estéril de pared negra de 96 pocillos (Tabla 2).
   1. Añada 50 μL de la muestra (tampón L-EB o muestra de mitocondrias) a los pocillos adecuados.
   2. Añadir 50 μL de tratamiento (L-EB, glutamato/malato o glutamato/malato con ADP).
   3. Diluya el material de la sonda 1:10 en L-EB y luego agregue 100 μL de la sonda fluorescente a cada pocillo.
   4. Agregue suavemente 50 μL de aceite mineral pesado a cada pocillo para excluir el oxígeno ambiental.
4. Lea las mediciones fluorescentes desde la parte inferior de la placa a 380/650 nm de excitación/emisión cada 1,5 minutos durante 45 minutos. Utilice el modo cinético con un retardo de tiempo de 30.000 μs y una ventana de medición de 100 μs.

3. Análisis de datos

1. Exporte el archivo de datos sin procesar desde el equipo lector de placas como un archivo .xls.
2. Abra el archivo, copie y pegue los datos sin procesar en una nueva pestaña y etiquete las filas y columnas correctamente.
3. Represente el tampón L-EB solo en la muestra de control y L-EB + G/M como unidades fluorescentes relativas (RFU) en función del tiempo.
   NOTA: Estas líneas deben ser relativamente planas ya que no hay mitocondrias presentes y, por lo tanto, no se debe detectar ningún cambio en la concentración de oxígeno.
4. Represente los valores de muestra L-EB + G/M como RFU en función del tiempo.
5. Determine dónde las lecturas se vuelven más consistentes y se aplanan para los controles.
   NOTA: Aquí es donde debe comenzar el análisis de datos para muestras experimentales (marcado con flechas en la Figura 1A). Las reacciones pueden tardar entre 10 y 15 minutos en aplanarse y alcanzar su máximo.
6. Realice una nueva gráfica que contenga solo los datos después del punto de tiempo establecido en el paso 3.5 (llamados datos "recortados") y agregue la línea de mejor ajuste para visualizar los datos brutos a analizar.
7. Calcule el valor promedio de RFU de los datos de solo búfer de control recortados (resaltados en amarillo). Este valor se utiliza como el valor mínimo de RFU como referencia en el cálculo de oxígeno que se muestra a continuación.
8. Cálculo de la tasa de consumo de oxígeno (μM O₂/min)
   1. Copie y pegue la región lineal de los datos sin procesar del paso 3.6 (es decir, los datos recortados) para determinar la concentración de oxígeno en las muestras mitocondriales en el tratamiento G/M + ADP en cada punto^{de tiempo} 7,8,9,10.
   2. Utilice la ecuación (1)⁵ para determinar la concentración de oxígeno en cada punto de tiempo. [O₂]_a es la concentración de oxígeno en el tampón saturado de aire (235 mM a 30 °C). I(t), Ia e Io son la señal fluorescente de la muestra + sonda en el tiempo t (por ejemplo, muestra + G/M + ADP), la señal media de la sonda en tampón saturado de aire calculada en el paso 3.7 y la señal máxima en tampón desoxigenado (establecida en la señal máxima alcanzable), respectivamente.
      (1)
   3. Trace los valores [O₂]_t calculados en el paso 3.8.2 en función del tiempo y agregue una línea de tendencia lineal junto con la ecuación de la línea de mejor ajuste.
      NOTA: Utilice la pendiente de cada línea como la tasa de consumo de oxígeno. Los duplicados o triplicados de cualquier muestra pueden agregarse y utilizarse para la comparación de la tasa de consumo.
9. Calcule el RCR dividiendo la respiración mitocondrial con y sin ADP, que representan los estados 3 y 2, respectivamente.

Results

La tasa de consumo de oxígeno y el RCR mitocondrial se determinaron a partir de las mitocondrias de tres lagartos diferentes utilizando un kit de ensayo con una sonda de detección de oxígeno fosforescente y un lector de placa de fluorescencia estándar. Investigaciones previas establecieron que la sonda de este kit se correlaciona directamente con el consumo de oxígeno, donde la fosforescencia es apagada por el oxígeno molecular y la señal fluorescente aumenta a medida que disminuyen los niveles de oxígeno debido a la respiración mitocondrial ^7,11. Los valores de RFU se registran a lo largo del tiempo tanto para las muestras de control como para las experimentales y luego se analizan. Las lecturas de RFU para los pocillos de control (tampón solamente, tampón tratado con glutamato/malato y tampón tratado con glutamato/malato + ADP) se trazaron en contra del tiempo para establecer que cualquier cambio en la fluorescencia en los pocillos de muestra experimentales se debe a la presencia de mitocondrias. Además, el control de glutamato/malato + ADP permite la cantidad basal de oxígeno durante la recopilación de datos. Las muestras experimentales que contenían mitocondrias aisladas también se trazaron en el mismo gráfico que los controles.

La Figura 1A demuestra que las RFU aumentan con el tiempo a partir de una muestra de mitocondrias aisladas, en comparación con los valores relativamente planos de RFU de los controles. Dado que las reacciones tardan en equilibrarse, las primeras 10 lecturas, hasta que las lecturas de la muestra de control no sean tan ruidosas y se nivelen, se eliminan del conjunto de datos (Tabla Suplementaria S1 y Figura Suplementaria S1). A continuación, los valores restantes de la muestra de mitocondrias tratada con glutamato/malato + ADP se transforman en la concentración de oxígeno en cada punto de tiempo utilizando la ecuación (1) (véase el paso del protocolo 3.2) y luego se trazan en función del tiempo. La Figura 1B muestra el resultado de la muestra experimental observada en la Figura 1A (cruces) donde el valor de R² es muy cercano a 1 y se puede calcular la pendiente de la línea. La pendiente de la línea es negativa porque a medida que se consume oxígeno, la concentración total de oxígeno en esa muestra disminuye. Este mismo proceso se repite para las mismas muestras mitocondriales tratadas con glutamato/malato sin ADP para obtener tasas de consumo de oxígeno (Tabla Suplementaria S2 y Figura Suplementaria S2). Luego, la respiración mitocondrial con y sin ADP, que representan los estados 3 y 2, respectivamente, se puede utilizar para calcular el RCR para cada tipo de muestra (Figura suplementaria S2). Cuando se comparan uno al lado del otro, el RCR promedio entre los tres tipos diferentes de lagartos arborícolas indica que el RCR del híbrido con mitocondrias introgredidas es significativamente más bajo que el de cualquiera de los dos tipos parentales (Figura 1C). Las mitocondrias híbridas de lagarto tuvieron tasas de consumo de oxígeno intermedias a las de los dos tipos parentales (Figura 2).

Figura 1: Ejemplo de resultados del ensayo de consumo de oxígeno. (A) Datos brutos de reacciones de control solo con tampón y reacciones que incluyen mitocondrias aisladas que se trataron con glutamato y malato (G/M), con o sin la adición de ADP. La fluorescencia se controló a lo largo del tiempo. A medida que se consume oxígeno, la fluorescencia aumenta. Las reacciones de solo tampón (G/M, indicada por círculos, y G/M + ADP, indicada por triángulos) y las mitocondrias con tratamiento G/M (indicadas por cuadrados) no mostraron cambios. Las mitocondrias tratadas con G/M + ADP (indicado con signos más) consumieron oxígeno. (B) Cambios en la concentración de oxígeno a lo largo del tiempo calculados a partir de los datos brutos de las mitocondrias tratadas con G/M + ADP presentados en A. (C) Valores de RCR para mitocondrias de tres tipos diferentes de lagartos medidos a temperatura ambiente. Esta figura es una reproducción de Haenel y Del Gaizo Moore¹². El análisis estadístico se realizó mediante ANOVAs en R. Abreviaturas: G = glutamato; M = malato; RCR = cociente de control respiratorio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Tasas de consumo de oxígeno de las mitocondrias de tres tipos de lagartos. Los diagramas de caja muestran las tasas medias de consumo de oxígeno como una barra y las medias como un punto. Los tipos parentales, Urosaurus graciosus y Urosaurus ornatus, eran significativamente diferentes entre sí. La forma introgresada (Híbrido) fue intermedia a los tipos parentales y no significativamente diferente de ninguno de ellos. Esta figura es una reproducción de Haenel y Del Gaizo Moore¹². Abreviaturas: Ug= Urosaurus graciosus; Uo = Urosaurus ornatus. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Composición de las soluciones utilizadas en el protocolo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Mapa de placas para el ensayo de consumo de oxígeno. Para cada muestra, reserve al menos 6 pocillos (3 pocillos de control: L-EB solamente, L-EB con tratamiento G/M, L-EB con tratamiento G/M + ADP; 3 pocillos/muestra experimentales: mitocondrias con tratamiento L-EB, L-EB + G/M y tratamiento L-EB G/M +ADP). Cuando sea posible, ejecute cada muestra experimental por duplicado o triplicado. Abreviaturas: G = glutamato; M = malato; L-EB = tampón experimental específico de lagarto. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figura complementaria S1: Gráficos de datos. (A) Diagrama de todos los datos brutos para la comparación de muestras y controles. (B) Gráfico de los datos brutos con bordes de las columnas resaltadas en la Tabla Suplementaria S1, que demuestra que solo los pozos que contenían muestras de mitocondrias tuvieron un aumento apreciable en las RFU. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: Consumo de oxígeno y relaciones de control respiratorio. (A) Gráfico de los datos de consumo de oxígeno de la Tabla Suplementaria S1 para determinar los valores de Estado 2 y Estado 3 encontrando las ecuaciones de las líneas de mejor ajuste. (B) Cálculo de la relación RCR utilizando las pendientes de las líneas en (A), que representan el Estado 2 y el Estado 3. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria S1: Ejemplo representativo de datos brutos. Las columnas resaltadas son datos que se utilizan para figuras y cálculos (es decir, datos recortados). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria S2: Ejemplo representativo de datos recortados y cálculos posteriores de consumo de oxígeno. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

La medición de la función mitocondrial es útil cuando se comparan diferentes muestras, como estados de enfermedad frente a estados no patológicos, diferentes tipos de tejido del mismo animal o entre diferentes tipos de muestras. Utilizamos la comparación posterior para probar nuestra hipótesis de que hay una consecuencia metabólica en los lagartos arborícolas híbridos que tienen mitocondrias introgredidas. Hay una variedad de formas de determinar experimentalmente la función de las mitocondrias, incluida la cuantificación de Δψ, el contenido total de ATP, la producción de ATP y el control respiratorio y la tasa de consumo de oxígeno. Las mediciones del consumo de oxígeno de las mitocondrias aisladas se pueden llevar a cabo con equipos especializados, como un electrodo Clark o los más sofisticados Seahorse XF. Sin embargo, estos métodos pueden ser limitados por el tamaño de la muestra necesaria para llevar a cabo las mediciones o tener un costo prohibitivo. Los lectores de placas multimodo que pueden leer la fluorescencia se han convertido en un equipo estándar en los laboratorios de biología celular y bioquímica. Por lo tanto, un enfoque alternativo para analizar cuantitativamente el consumo de oxígeno mitocondrial es utilizar un kit disponible comercialmente con un lector de placas fluorescentes. Este protocolo paso a paso describe cómo medir el consumo de oxígeno, así como realizar los cálculos. y económicamente en mitocondrias aisladas. La medición precisa de la capacidad de las mitocondrias para producir ATP cuando se les suministra ADP, lo que se conoce como respiración de estado 3, permite la comparación directa de OXPHOS entre muestras y las diferencias pueden significar disparidades funcionales. Además, la respiración del estado 3 también indica la calidad de las mitocondrias que se aislaron, lo que puede determinar si un procedimiento de aislamiento ha funcionado y/o si la muestra es lo suficientemente buena para ser utilizada en otros ensayos. Los valores de RCR, que se calculan utilizando el estado 2 (glutamato y malato solamente, para construir Δψ) y los valores del estado 3 (glutamato y malato más ADP, para permitir que Δψ se utilice para la producción de ATP), proporcionan otra información para la comparación y sobre la salud de las mitocondrias aisladas. Los datos presentados demuestran que el método ofrecido en este trabajo puede ayudar a descifrar las variaciones entre diferentes tipos de muestras y medir las tasas de consumo de oxígeno y los valores de RCR sin necesidad de equipos altamente especializados, lo que hace que este tipo de mediciones sean más accesibles.

En este protocolo, aislamos mitocondrias recién aisladas de lagartijas, y el consumo de oxígeno se determinó mediante un ensayo MitoXpress Xtra Hs siguiendo el protocolo del fabricante y modificado según Hynes et ^al.4 y Will et ^al.5 Las lagartijas oscilaron entre 3,3 g y 5,1 g de masa corporal total con un promedio de 0,170 g de tejido hepático/lagarto, que produjo ~0.350 mL de mitocondrias crudas concentradas. Las mitocondrias aisladas se utilizaron en el ensayo de consumo de oxígeno a 6 mg/mL de proteína. Si la concentración de proteína mitocondrial, según se determina en el paso 1.7 del protocolo, es baja, se puede volver a centrifugar la muestra a 10.000 × g y resuspender el pellet en un volumen menor de L-MIB. También debe tenerse en cuenta que hemos utilizado con éxito tan solo 4 mg / mL para muestras pequeñas de hígado o cuando la totalidad del hígado no estaba disponible.

Para garantizar el equilibrio entre el gas y la temperatura de las muestras al comienzo del ensayo, todas las soluciones utilizadas en la sección 2 del protocolo deben precalentarse a 30 °C en un baño de agua. En la sección 3 del protocolo, las tasas de cambio del oxígeno disuelto (mM/min) se extrapolan a partir de las pendientes iniciales de los perfiles de concentración de oxígeno decrecientes para cada muestra (paso del protocolo 3.3; Tabla suplementaria S1 y figura suplementaria S1). Las tasas de tratamiento de la muestra + G/M representan la respiración mitocondrial del estado 2, mientras que la muestra con las tasas de tratamiento G/M + ADP representan la respiración mitocondrial del estado 3. Por lo tanto, los RCR se calculan para cada muestra dividiendo los valores del estado 3 por los valores del estado 2 para cada muestra (Tabla complementaria S2).

El consumo de oxígeno se puede comparar entre muestras únicas, como se muestra aquí, o entre diferentes tratamientos en una muestra. En este último caso, pueden ser necesarios controles adicionales, como el control solo en vehículo con y sin mitocondrias, para descartar la posibilidad de que el tratamiento químico en sí no interactúe con la sonda fosforescente. Además, los datos de consumo de oxígeno y RCR recopilados se pueden utilizar junto con los datos recopilados de las mismas muestras con otros ensayos. Una vez que se aíslan las mitocondrias, se pueden utilizar en múltiples ensayos para proporcionar una imagen más completa de su función^. La medición de Δψ, el contenido total de ATP y la tasa de recambio de ATP son algunos de los ensayos que se han combinado. Además, el uso de inhibidores de ETC, OXPHOS y ATP sintasa con los ensayos proporciona una comprensión aún más completa de los diferentes tipos de muestras mitocondriales, lo que refuerza las conclusiones extraídas de los datos generados.

Otro parámetro que se puede medir en mitocondrias aisladas es la eficiencia mitocondrial, que se define como la relación P/O de moles de ATP sintetizados por mol de_O2³. Las relaciones P/O podrían calcularse en una extensión de este protocolo permitiendo que las mitocondrias del estado 3 agoten el ADP suministrado en la reacción y luego agregando una alícuota de sustrato de ADP seguida de la inhibición de la ATP sintasa mediante la adición de oligomicina. Estos pasos adicionales permiten el cálculo del estado 4, que ocurre cuando las mitocondrias continúan consumiendo oxígeno y mantienen un Δψ fuerte para producir el máximo ATP, proporciona información sobre la fuga de las mitocondrias (si los iones H⁺ están cruzando de regreso a la matriz sin el uso de la ATP sintasa y, por lo tanto, disipando Δψ), lo que en última instancia indica una disfunción de las mitocondrias. Además, las mediciones del estado 4 también pueden revelar si el translocador ADP/ATP, que mueve el ATP recién formado de la matriz mientras al mismo tiempo introduce el sustrato ADP, es funcional y si se está produciendo alguna fuga de ADP y ATP a través de las membranas. La adición de oligomicina, que inhibe la ATP sintasa, es un control para determinar si las mitocondrias son permeables debido a una disfunción real. Si bien la medición del estado 4 para poder calcular la relación P/O estaba más allá del alcance de la información que buscamos para la comparación entre los tres tipos de muestras mitocondriales, es otro dato sobre la función mitocondrial y podría hacerse como una extensión de este protocolo. Finalmente, vale la pena señalar que las mitocondrias se pueden aislar de células en cultivo y diferentes tejidos de un ratón o rata (por ejemplo, hígado, corazón, médula espinal) entre otros. Puede ser necesario realizar ajustes en las formulaciones de MIB y EB, así como en los protocolos de aislamiento 4,13,14,15,16. Además, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, este ensayo podría realizarse con células enteras e intactas. Por lo tanto, el método presentado no se limita a los lagartos o las mitocondrias hepáticas, lo que le permite ser adecuado para una amplia gama de modelos experimentales en muchas subdisciplinas científicas diferentes.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placas inferiores negras/ópticas de 96 pocillos	Thermo Fisher	265301	Placas de pared negra sin tratar con fondos transparentes.
ADP	Sigma	A2754	Diluido 100 µ M stock con EB inmediatamente antes de su uso.
BSA	Thermo Fisher	BP1600-100	Prepare 2 mg/mL de caldo en agua para el ensayo de proteínas.
Dulbeccos 1x PBS (-/-)	Sigma	D8537	Asegúrese de que el PBS no tenga iones Mg2+ o Ca2+.
EGTA	Sigma	E3889
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
Ácido L-glutámico	Sigma	G1251
Ácido L-glutámico sal de potasio	Sigma	S372226
Ácido L-málico	Sigma	M8304
Ácido L-málico sal monopotásica	Sigma	49601
MitoXpress kit de consumo de oxígeno	El kit Agilent	MX-200-4	contiene material de sonda y aceite mineral HS.
MOPS	Sigma	M3183
Colorante de ensayo Protien (5x)	BioRad	500-0006	Cualquier ensayo de proteínas puede sustituir.
R versión 3.3	R Core Development Team 2016
Lector de microplacas Thermomax EnSpire Multimodo Lector de placas y software	PerkinElmer		Lector de placas fluorescente estándar
Trisma base	Sigma	T6066	Se puede utilizar cualquier versión de Tris base.