Artículo de método

Aislamiento, cultivo y caracterización de células madre de pulpa dental a partir de dientes humanos deciduos y permanentes

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DOI:

10.3791/65767

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17 de mayo de 2024

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1Department of Dentistry, Oral Health Institute, Hamad Medical Corporation, 2Pushpagiri Institute of Medical Sciences and Research Centre, 3Saveetha Dental College, Saveetha Institute of Medical and Technical Sciences, 4College of Applied Medical Sciences, King Saud University

En este artículo

Resumen

Este protocolo enfatiza la extracción, el cultivo y la preservación de células madre multipotentes de la pulpa dental a través de la digestión enzimática. Además, demuestra su potencial para diferenciarse en osteoblastos, adipocitos y condrocitos, lo que pone de manifiesto la importancia de la precisión y la consistencia en el proceso.

Resumen

En el ámbito de la medicina regenerativa y las aplicaciones terapéuticas, la investigación con células madre está ganando terreno rápidamente. Las células madre de la pulpa dental (DPSC), que están presentes tanto en los dientes deciduos como en los permanentes, se han convertido en una fuente vital de células madre debido a su accesibilidad, adaptabilidad y capacidades innatas de diferenciación. Las DPSC ofrecen un reservorio abundante y fácilmente disponible de células madre mesenquimales, que muestran una versatilidad y un potencial impresionantes, particularmente para fines regenerativos. A pesar de su promesa, el principal obstáculo radica en aislar y caracterizar eficazmente las DPSC, dada su representación como una fracción diminuta dentro de las células de la pulpa dental. Igualmente crucial es la preservación adecuada de este invaluable recurso celular. Los dos métodos predominantes para el aislamiento de DPSC son la digestión enzimática (DE) y el crecimiento a partir de explantes tisulares (OG), a menudo denominado crecimiento espontáneo. Este protocolo se concentra principalmente en el enfoque de digestión enzimática para el aislamiento de DPSC, detallando detalladamente los pasos que abarcan la extracción, el procesamiento en el laboratorio y la preservación de células. Más allá de la extracción y la preservación, el protocolo profundiza en la destreza de diferenciación de las DPSC, en concreto, describe los procedimientos empleados para inducir a estas células madre a diferenciarse en adipocitos, osteoblastos y condrocitos, mostrando sus atributos multipotentes. La utilización posterior de técnicas de tinción colorimétrica facilita la visualización precisa y la confirmación de la diferenciación exitosa, validando así el calibre y la funcionalidad de las DPSC aisladas. Este protocolo integral funciona como un modelo que abarca todo el espectro de extracción, cultivo, preservación y caracterización de células madre de pulpa dental. Subraya el potencial sustancial que albergan las DPSC, impulsando la exploración avanzada con células madre y siendo prometedor para futuros avances regenerativos y terapéuticos.

Introducción

La investigación con células madre ha florecido en la ciencia biomédica debido a sus prometedoras aplicaciones en la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos. Las células madre de la pulpa dental (CPDP), derivadas del tejido pulpar de los dientes deciduos y permanentes humanos, han atraído un interés significativo como fuente de células madre debido a su disponibilidad inmediata y capacidad multipotente 1,2. Estas células tienen el potencial de diferenciarse en varios tipos de células, incluidos los adipocitos, los osteoblastos y los condrocitos, como lo confirman numerosos estudios3.

En las últimas décadas, la investigación y las aplicaciones terapéuticas de las células madre han aumentado. El potencial expansivo de las células madre exige diversificar las fuentes de las que se obtienen. Varios factores influyen en la eficiencia, la viabilidad y la madre de las células elegidas. A pesar de la existencia de varios reservorios de células madre conocidos, como la médula ósea y los tejidos adiposos, los procedimientos invasivos, la morbilidad del sitio y las preocupaciones éticas relacionadas con estas fuentes a menudo limitan su exploración 4,5. Entre las diversas fuentes de células madre, las células madre dentales han ganado atención debido a su fácil accesibilidad, alta plasticidad y diversas aplicaciones potenciales. Las células madre de la pulpa dental humana, en particular, han sido ampliamente investigadas por sus perspectivas terapéuticas6. Los dientes, comúnmente desechados como desechos médicos, contienen una gran cantidad de células madre mesenquimales. Salvaguardar este valioso grupo de células madre requiere esfuerzos colectivos de pacientes, dentistas y médicos para garantizar que estos recursos no se desperdicien, haciendo que cada célula madre de la pulpa dental esté disponible para futuros requisitos regenerativos.

Las células madre derivadas de la pulpa dental, como las células madre de la pulpa dental adulta humana (DPSC) y las células madre de los dientes deciduos humanos exfoliados (SHED), se encuentran en el nicho perivascular de la pulpa dental. Se cree que estas células se originan a partir de células de la cresta neural craneal y exhiben marcadores tempranos tanto para las células madre mesenquimales (MSC) como para las células madre neuroectodérmicas. Las DPSC y las SHEDs han demostrado multipotencia y la capacidad de regenerar diversos tipos de tejidos8.

Las fuentes potenciales de células madre dentales abarcan dientes deciduos y permanentes sanos. Las células madre constituyen solo alrededor del 1% de la población total de células en la pulpa, lo que pone de relieve la importancia de técnicas efectivas de aislamiento y expansión9. En consecuencia, la extracción y expansión de estas células madre son pasos fundamentales en el aislamiento de DPSC10. Los dientes extraídos o exfoliados deben almacenarse en un medio de transporte rico en nutrientes, como solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina tamponada con Hanks (HBSS).

La obtención de pulpa dental se puede lograr a través de varios métodos, dependiendo del tipo de diente 7,11. En el caso de los dientes deciduos con raíces reabsorbidas, la extracción se puede realizar a través del ápice de la raíz. Del mismo modo, las brochas de púas estériles se pueden utilizar para obtener pulpa de dientes permanentes con un ápice abierto inmaduro. En los casos de dientes permanentes con raíces completamente desarrolladas, el acceso a la cámara pulpar implica separar la corona dental de la raíz. Esto se logra cortando el diente con un disco de diamante en la unión del esmalte cementado. Esta incisión expone la cámara pulpar, permitiendo la recuperación del tejido pulpar 12,13,14.

Las células madre de la pulpa dental (DPSC) se pueden aislar a través de la digestión enzimática (ED) o el crecimiento de explantes de tejido (OG), también conocido como crecimiento espontáneo. El método ED emplea enzimas, principalmente colagenasa I y dispasa, para descomponer el tejido en suspensiones unicelulares15,16. El método OG, más simple y rápido, consiste en picar los fragmentos de pulpa y colocarlos directamente en una placa de cultivo, permitiendo que las células crezcan a partir de los explantes de tejido17. Los investigadores han utilizado y comparado ambas técnicas para evaluar las tasas de proliferación celular, la preservación de las propiedades de las células madre aisladas, la diferenciación y la expresión de marcadores de superficie18. El establecimiento y la normalización de protocolos para la adquisición de CPDP con alta eficiencia y eficacia pueden allanar el camino para terapias eficaces y seguras19. Este protocolo abarca la extracción de DPSC mediante digestión enzimática, procesamiento de laboratorio, preservación y diferenciación celular con tinción colorimétrica para adipogénesis, osteogénesis y condrogénesis.

El protocolo descrito en este artículo presenta un procedimiento paso a paso, que comienza con el aislamiento inicial de la pulpa dental del diente, seguido por el cultivo y mantenimiento de las CPDP en el laboratorio, y concluye con su caracterización utilizando marcadores específicos de células madre (Figura 1). También se describen las técnicas para inducir estas células madre en diferentes linajes celulares, destacando su multipotencia.

Protocolo

El protocolo descrito en este documento se ajusta a las directrices del comité institucional de ética de la investigación en seres humanos (IRB, Centro de Investigación Pushpagiri, Kerala). El uso de los dientes extraídos se llevó a cabo siguiendo normas éticas para garantizar la integridad, la dignidad y los derechos de los participantes. Los participantes seleccionados para este estudio fueron individuos sanos menores de 30 años que requirieron extracción dental para tratamiento ortodóncico. Se excluyeron del estudio aquellos con caries dental extensa o periodontitis severa. Se recolectaron dientes deciduos de niños que requirieron la extracción de dientes retenidos. También se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los sujetos involucrados en este estudio.

1. Extracción y transporte de los dientes

  1. Colección de dientes deciduos y permanentes
    1. Explique a los participantes el propósito del procedimiento y el uso potencial de los dientes extraídos con fines de investigación.
    2. Realizar la extracción dental bajo anestesia local mediante la administración de un agente anestésico en las proximidades del diente a extraer. En concreto, se inyectaron 1,75 mL de lidocaína mezclada con epinefrina (ver Tabla de Materiales) en una proporción de 1:200.000 para este estudio. Es preferible seleccionar dientes que no presenten caries dental severa o periodontitis20,21.
  2. Transporte de los dientes extraídos
    NOTA: Se recomienda trabajar en condiciones asépticas para evitar la contaminación. Esto incluye usar equipo de protección personal, como guantes y una bata de laboratorio, y trabajar en un entorno estéril, como una capucha de flujo laminar de riesgo biológico.
    1. Después de extraer el diente, enjuáguelo con una solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) para eliminar la sangre y otros desechos. Con pinzas estériles y bisturí, retire con cuidado cualquier resto de tejido blando adherido a la superficie del diente (Figura 2A).
    2. Sumerja el diente en una solución desinfectante, como etanol al 70%, durante 10 s. Después de la desinfección, enjuague el diente con PBS estéril para eliminar cualquier residuo de desinfectante.
    3. Coloque el diente en un recipiente estéril que contenga el medio de transporte.
      NOTA: El medio de transporte consistió en Alpha-MEM, un medio de cultivo comercial suplementado con antibióticos: 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (ver Tabla de Materiales). Este medio suministraba nutrientes esenciales a las células dentro del diente extraído, asegurando su supervivencia hasta el procesamiento en el laboratorio. Los antibióticos servían para inhibir el crecimiento bacteriano.
    4. Mantener una temperatura de 4 °C durante el transporte para ralentizar las actividades metabólicas celulares y retrasar la muerte celular. Transportar el diente al laboratorio para los siguientes pasos, incluido el procesamiento y el aislamiento de las células madre de la pulpa dental.

2. Recolección de tejido pulpar

  1. Asegure el diente con pinzas dentales para asegurarse de que permanezca en su lugar durante el procedimiento. Use un disco de diamante para cortar el diente en una pieza de mano dental (consulte la Tabla de materiales) conectada a un refrigerante de agua (Figura 2B).
    NOTA: El objetivo es exponer la cámara pulpar sin causar daños innecesarios al tejido pulpar en su interior.
  2. Utilice una excavadora dental (consulte la tabla de materiales) para eliminar el tejido pulpar. Este instrumento permite la extracción de la pulpa sin causar daños, preservando así la viabilidad de las células madre de la pulpa dental (Figura 2C).
  3. Coloque el tejido obtenido en una placa de Petri de vidrio. Lave el tejido pulpar con solución salina tamponada con fosfato.

3. Digestión del tejido pulpar y aislamiento celular

  1. Picado y digestión de tejidos
    1. Con una cuchilla quirúrgica estéril, picar cuidadosamente el tejido pulpar en pequeños fragmentos (Figura 2D) y colocarlo en un mini triturador de pañuelos con PBS para obtener una mezcla finamente homogeneizada. Este proceso aumenta la superficie del tejido, facilitando una acción enzimática más eficiente durante la digestión.
    2. Transfiera los fragmentos de tejido homogéneo picados a un tubo de 15 mL y digiera enzimáticamente utilizando una mezcla de 3 mg/mL de colagenasa tipo I y 4 mg/ml de dispasa (ver Tabla de Materiales). Estas enzimas se disolvieron en la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) para lograr las concentraciones deseadas.
    3. Incubar el tejido de la pulpa en la mezcla de enzimas (paso 3.1.2) durante unas 2 h a 37 °C. Después de la incubación, neutralice las enzimas y recoja las células por centrifugación (paso 3.2.1) para su posterior cultivo.
  2. Centrifugación y resuspensión
    1. Después de la incubación, transfiera el tejido digerido a un tubo de centrífuga de 15 ml y gire a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente para granular las células. Este paso separa las células de los fragmentos de tejido y enzimas restantes no digeridos. Deseche con cuidado el medio sobrenadante, asegurándose de no alterar la pastilla celular en la parte inferior del tubo.
    2. Vuelva a suspender el pellet celular en un medio de cultivo fresco. Este medio proporciona los nutrientes y el entorno necesarios para que las células aisladas sobrevivan y proliferen.

4. Cultivo celular

  1. Siembra e incubación de células
    1. Transfiera con cuidado las células resuspendidas a un matraz de cultivo de 25 cm².
      NOTA: Todo el material de una sola pulpa se transfiere a un solo matraz de cultivo celular de25 cm2. Un volumen de medio de 5-7 ml garantiza una cobertura suficiente y disponibilidad de nutrientes para las células. Asegúrese de que el medio de cultivo para las DPSC sea el Medio de Águila Modificado (DMEM) de Dulbecco, complementado con un 10%-20% de suero fetal bovino (FBS) (ver Tabla de Materiales) para proporcionar los factores de crecimiento necesarios. Además, complemente el medio con penicilina/estreptomicina al 1% para prevenir la contaminación bacteriana. Asegúrese de que las células estén distribuidas uniformemente por todo el matraz para promover un crecimiento homogéneo.
    2. Incubar el matraz a 37 °C en una atmósfera que contenga 5% de CO2.
  2. Cambio de medio y confluencia de seguimiento
    1. Cambie el medio de cultivo cada 2-3 días para proporcionar nutrientes frescos y eliminar los desechos metabólicos. Para ello, aspire cuidadosamente el medio antiguo con una pipeta serológica estéril y sustitúyalo por un medio nuevo.
    2. Monitoree regularmente el cultivo celular bajo un microscopio para rastrear el crecimiento de las células y verificar si hay signos de contaminación.
    3. Continúe este proceso hasta que las celdas alcancen el 80%-90% de confluencia, el punto en el que las celdas cubren la mayor parte de la superficie del matraz pero no están demasiado abarrotadas.
  3. Tripsinización celular y passaging o congelación
    1. Una vez que las células alcancen el 80%-90% de confluencia, retire el medio de cultivo y lave las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar el medio residual y las células no adherentes.
    2. Añadir una solución de tripsina-EDTA al 0,25% al matraz para separar las células de la superficie del matraz. Incubar durante 2-5 min a 37 °C hasta que las células despeguen.
    3. Neutralice la tripsina agregando un volumen igual de medio de cultivo, luego pipetee suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo para asegurar el desprendimiento completo de la célula.
    4. Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente para granular las celdas.
    5. Vuelva a suspender las células en un medio de cultivo fresco y vuelva a colocarlas (paso) para un mayor crecimiento o congélelas para su uso futuro. Al congelar, use un medio de congelación que contenga un crioprotector, como DMSO, para proteger las células del daño durante la congelación.

5. Caracterización de las CPDP

  1. Análisis de citometría de flujo
    1. Para confirmar la naturaleza de las células madre mesenquimales de las células aisladas, se realizó un análisis de citometría de flujo22,23. Inicialmente, tripsinice y recoja células como se describe en el paso 4.3.
    2. Determinar la viabilidad celular mediante la técnica de exclusión de colorante tripán. Realice el análisis utilizando un analizador de viabilidad celular (ver Tabla de Materiales) durante el2º y8º pasaje. Realizar análisis fenotípicos a través de un citómetro de flujo durante el3º y7º paso.
    3. Después de la incubación, lave las células en un tampón de citometría de flujo para eliminar el exceso de anticuerpos y analice las células con un citómetro de flujo.
      NOTA: El tampón de citometría de flujo está compuesto por solución salina tamponada con fosfato (1x PBS), 1%-2% de suero fetal bovino (FBS) y 0,1% de azida de sodio (NaN3). El FBS o BSA bloquea la unión inespecífica de los anticuerpos, mientras que la azida de sodio actúa como conservante. Un alto porcentaje de células deben expresar los marcadores de células madre mesenquimales y carecer de los marcadores hematopoyéticos, lo que confirma su identidad como DPSCs24.
    4. Separe las DPSC y tíñalas con anticuerpos de inmunofluorescencia para el análisis de citometría de flujo.
      NOTA: La selección de marcadores para el análisis por citometría de flujo de células madre mesenquimales (MSC) se basa en el consenso establecido por la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT), que establece que las MSC deben expresar CD105, CD73 y CD90, y carecer de la expresión de CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79a o CD19, y HLA clase II25. Estos marcadores se utilizan comúnmente en estudios que investigan las células madre de la pulpa dental26. Las concentraciones de anticuerpos para la tinción pueden variar dependiendo del anticuerpo específico utilizado, y se recomienda seguir las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales) para diluciones de anticuerpos y condiciones de incubación25.
    5. Establecer los criterios de clasificación 27,28 para la expresión de los marcadores CD mencionados: menos del 10%, ninguna expresión; entre el 11% y el 40%, baja expresión; un rango de 41% a 70%, expresión moderada; por encima del 71%, alta expresión.
    6. Además, confirmar la ausencia de marcadores hematopoyéticos mediante la incubación de una alícuota celular separada con anticuerpos contra CD34 y CD45.

6. Diferenciación multilinaje

NOTA: Los siguientes pasos describen los protocolos para la diferenciación osteogénica, adipogénica y condrogénica de las células madre dentales. Comience sembrando cultivos a una densidad de 1 x 105 células por pocillo en una placa de cultivo de tejido recubierta de fibronectina con medio completo (CM). Monitorizar el crecimiento celular hasta alcanzar un 80%-90% de confluencia antes de iniciar el protocolo de diferenciación deseado. Para evaluar el potencial de diferenciación multilinaje de las DPSC, inicie el proceso de diferenciación hacia osteoblastos, adipocitos y condrocitos mediante la siembra de células en placas de 24 pocillos y su cultivo en medios de diferenciación adecuados.

  1. Diferenciación osteogénica
    1. Comience cultivando DPSC en un medio de crecimiento regular en condiciones estándar hasta que alcancen un 70%-80% de confluencia.
    2. Retire el medio de crecimiento de las células, luego lávelas una vez con 1x PBS. Agregue el medio de diferenciación osteogénica (ODM) a las células.
      NOTA: El ODM consiste en Medio Esencial Mínimo Alfa (α-MEM) suplementado con 10% de FBS, 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B, 50 μg/mL de ácido ascórbico, 10 mM de beta-glicerofosfato y 100 nM de dexametasona (ver Tabla de Materiales).
    3. Incubar las células en el medio osteogénico a 37 °C con 5% de CO2. Cambie el medio osteogénico cada 2-3 días.
      NOTA: Después de 14 a 21 días, las DPSC deberían haberse diferenciado en células similares a los osteoblastos. Esto puede confirmarse mediante la comprobación de un aumento en la expresión de marcadores específicos de osteoblastos, como la fosfatasa alcalina, o mediante el uso de técnicas de tinción para detectar la matriz mineralizada, como la tinción con Alizarin Red S.
    4. Fije las células incubándolas con etanol helado al 70% durante 1 h a -20 °C.
    5. Teñir las células fijas con 40 nM de solución de tinción de Alizarin Red S (pH 4,2) a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10-15 min. Visualice la tinción bajo un microscopio para confirmar la diferenciación osteogénica (Figura 3). Confirmar la diferenciación tiñendo las células con Alizarina Roja S, que identifica depósitos de calcio indicativos de mineralización29,30.
  2. Diferenciación adipogénica
    1. Como se detalló en la sección anterior, cultive DPSC en condiciones estándar en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 a 37 °C. Pasa las células cuando alcanzan alrededor del 70%-80% de confluencia.
    2. Aspire el medio y lave las células una vez con 1x PBS. Reemplace el medio lavado con medio de diferenciación adipogénico. Este medio generalmente consta de DMEM, 10% de FBS, 10 μg/mL de insulina, 1 μM de dexametasona, 200 μM de indometacina y 0,5 mM de IBMX (ver Tabla de Materiales).
    3. Cambie el medio de diferenciación cada 3-4 días. Después de aproximadamente 3 semanas, lave las DPSC adipogénicas diferenciadas con PBS y fíjelas con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 20 minutos a temperatura ambiente.
    4. Teñir las células fijas con Oil Red O (ver Tabla de Materiales) para visualizar la acumulación de gotas de lípidos (Figura 4). Para confirmar aún más la diferenciación adipogénica, se realiza un análisis de expresión génica de marcadores adipogénicos como el receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas (PPARγ) y la adiponectina31,32.
  3. Diferenciación condrogénica
    1. Los cultivos de DPSCs mantenidos en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 a 37 °C se utilizan para la diferenciación condrogénica. Pasa las células cuando alcanzan alrededor del 70%-80% de confluencia.
    2. Aspire el medio y lave las células una vez con 1x PBS. Reemplace el medio lavado con un medio de diferenciación condrogénico, que generalmente contiene medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa, 1% de ITS, 100 nM de dexametasona, 50 μg/mL de ascorbato-2-fosfato, 40 μg/mL de prolina y 10 ng/mL de factor de crecimiento transformante-beta 3 (TGF-β3) (ver Tabla de materiales).
    3. Mantener las células en el medio de diferenciación condrogénica, cambiando el medio cada 2-3 días. Después de unas tres semanas, las DPSC deberían haberse diferenciado en células similares a los condrocitos.
    4. Fije las células incubándolas con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación, tiñir las células con azul alcián (ver Tabla de Materiales) y visualizarlas bajo un microscopio para confirmar la diferenciación condrogénica (Figura 5).
    5. Confirmar la diferenciación de las DPSCs en condrocitos utilizando técnicas como la tinción con azul alcián para proteoglicanos o el análisis de expresión génica de marcadores condrogénicos como el agrecano, el SOX9 y el colágeno tipo II33,34.

Resultados

La ejecución exitosa del protocolo descrito produjo células madre de pulpa dental (DPSC) capaces de diferenciarse multilinaje, demostrando su multipotencia.

Ensayos de viabilidad
La viabilidad de las DPSC se evaluó mediante un ensayo de exclusión de azul de tripano en varios momentos. Los resultados muestran una alta viabilidad (superior al 95%) durante todo el período de cultivo, lo que demuestra la solidez de nuestro protocolo de aislamiento y cultivo.

Ensayos de unidades formadoras de colonias (UFC)
Se realizaron ensayos de UFC para evaluar la capacidad de autorrenovación de los DPSC. Una suspensión unicelular se sembró a baja densidad y se cultivó durante 14 días. Las colonias formadas se tiñeron y contaron. Los resultados muestran muchas colonias, lo que indica una alta proporción de células autorrenovadoras dentro de la población de DPSC.

Tiempo de duplicación de celdas
El tiempo de duplicación de las células se calculó en función de la curva de crecimiento de las DPSC, sembrando células a una densidad específica y contándolas regularmente para construir una curva de crecimiento. A continuación, se calculó el tiempo de duplicación utilizando la fase de crecimiento exponencial de la curva. Los resultados muestran un tiempo de duplicación consistente con el reportado para las MSCs, lo que sugiere una población celular sana y proliferativa (Figura 6).

Análisis de citometría de flujo
El análisis de citometría de flujo mostró que una gran mayoría de las DPSC (p. ej., >95%) fueron positivas para CD90, CD73 y CD105, lo que confirma su identidad como MSC (Figura 7). Además, menos del 2% de las células fueron positivas para CD45, CD34 y HLA-DR, lo que confirma la ausencia de contaminación significativa de células hematopoyéticas o endoteliales.

Diferenciación osteogénica
Al finalizar la diferenciación osteogénica, las células exhibieron una matriz mineralizada, que se visualiza mediante la tinción con rojo de alizarina S (Figura 3). La presencia de coloración roja en las células teñidas indica la deposición exitosa de una matriz mineralizada, una característica esencial de la diferenciación osteogénica. La incapacidad de lograr con éxito la tinción de diferenciación podría estar relacionada con los desafíos enfrentados durante el procedimiento de recolección de muestras.

Diferenciación adipogénica
Durante la diferenciación adipogénica, las DPSCs acumularon gotas de lípidos, indicativas de adipogénesis. Las gotas de lípidos se pueden observar con tinción de Oil Red O (Figura 4). Una diferenciación exitosa dio como resultado gotas de lípidos teñidas de rojo anaranjado dentro de las células.

Diferenciación condrogénica
Por último, después de la diferenciación condrogénica, las DPSC produjeron glicosaminoglicanos, un componente crítico del cartílago confirmado por la tinción con azul alcián, que se une a estos glicosaminoglicanos. Las células que se sometieron con éxito a la condrogénesis exhibieron una coloración azul al tingir (Figura 5).

Las células que no mostraron los respectivos cambios de color en los procedimientos de tinción podrían deberse a una diferenciación subóptima, posiblemente debido a problemas con los medios de diferenciación o la calidad inicial de las DPSC. Es importante garantizar la calidad de los medios y suplementos y la salud y el número de DPSC utilizados. La diferenciación exitosa de las DPSC en osteoblastos, adipocitos y condrocitos valida la naturaleza multipotente de estas células y subraya su potencial en medicina regenerativa y aplicaciones terapéuticas.

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Figura 1: Descripción general del aislamiento, caracterización y diferenciación de células madre de la pulpa dental. Esta figura proporciona una representación esquemática del flujo de trabajo para aislar, caracterizar y diferenciar las células madre de la pulpa dental (DPSC). El proceso comienza con la extracción del diente (o dientes), seguido del aislamiento del tejido pulpar, del que se derivan las DPSC. Después del aislamiento, las DPSC se someten a varias pruebas de caracterización para confirmar su identidad de células madre y evaluar su viabilidad, tasa de proliferación y otros atributos clave. La etapa final representada en este diagrama implica la inducción de la diferenciación, donde las DPSC se tratan con factores específicos para guiar su transformación en tipos de células especializadas, como osteoblastos, adipocitos o condrocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Recuperación de pulpa de dientes extraídos. (A) Un diente extraído preparado para la extracción de tejido pulpar. (B) Corte del diente extraído usando una fresa de diamante. (C) Extracción del tejido pulpar de la cámara pulpar. (D) Fragmentación del tejido pulpar usando una cuchilla quirúrgica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Diferenciación osteogénica de las células madre de la pulpa dental (DPSC) evidenciada por la tinción de Alizarin Red S (40x). La tinción de color rojo brillante revela la deposición de la matriz mineralizada, un rasgo característico de los osteoblastos, que confirma una diferenciación osteogénica exitosa. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Diferenciación adipogénica de las células madre de la pulpa dental (DPSC) demostrada por tinción con Oil Red O. La presencia de gotas de color rojo brillante representa la acumulación de lípidos, un sello distintivo de los adipocitos, lo que confirma el éxito de la diferenciación adipogénica. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Diferenciación condrogénica de las células madre de la pulpa dental (DPSC) demostrada por tinción con azul alcián (40x). El color azul intenso indica la presencia de una matriz extracelular rica en proteoglicanos, una característica de los condrocitos, que confirma la diferenciación condrogénica exitosa. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Tiempo de duplicación celular para las células madre de la pulpa dental (DPSC). Esta figura ilustra la curva de crecimiento de los DPSC a lo largo del tiempo. Las células se sembraron inicialmente a una densidad específica, y los recuentos de células se tomaron a intervalos regulares (representados en el eje x) para monitorear la tasa de proliferación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Expresión de marcadores de superficie de células madre en cultivo de DPSC. Esta figura muestra la expresión de marcadores de superficie específicos en DPSC. Los marcadores de células madre mesenquimales CD44, CD90 y CD105 muestran altos niveles de expresión, lo que indica la presencia de rasgos mesenquimales en estas células. Por el contrario, la expresión de marcadores hematopoyéticos (CD34 y CD45) y de la molécula principal del complejo de histocompatibilidad de clase II (HLA-DR) es casi insignificante, lo que confirma la ausencia de células de linaje hematopoyético en el cultivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El protocolo describe el aislamiento, cultivo y caracterización de células madre de pulpa dental (DPSC) a partir de dientes deciduos y permanentes humanos. Incluye una descripción del almacenamiento y proliferación de estas células, así como la evaluación de su potencial de diferenciación in vitro en osteoblastos, adipocitos y condrocitos35.

Chen et al.36 demostraron que las células madre de la pulpa dental (DPSC) podían obtenerse de diversas fuentes, incluyendo dientes humanos vitales infectados afectados por afecciones como periodontitis, reabsorción radicular, pericoronitis y fracturas dentales, así como dientes supernumerarios y desalineados. Este hallazgo fue corroborado por estudios posteriores que identificaron dientes vitales infectados como fuentes potenciales de DPSCs 37,38,39,40. Sin embargo, Bernardi et al.10 señalaron que el aumento de la reabsorción radicular podría afectar negativamente a la viabilidad de estas células madre. Un obstáculo importante en el proceso es preservar las células y evitar su degradación, que comienza inmediatamente después de la extracción o exfoliación del diente. Además, es importante tener en cuenta que los dientes afectados por condiciones severas como abscesos periapicales, tumores o quistes no deben utilizarse para extraer células madre40,41.

Las CPDP pueden obtenerse mediante la técnica de digestión enzimática (DE) o el método de excrecencia a partir de explantes tisulares (OG), también conocido como técnica de crecimiento espontáneo14,15. Los investigadores utilizan estas estrategias para investigar la eficiencia de la proliferación celular o el mantenimiento de los atributos morfológicos y fenotípicos de las células madre aisladas17. Los estudios han encontrado que las células madre aisladas a través del método OG muestran una tasa de proliferación más lenta y una expresión más débil de los marcadores de células madre18. Por el contrario, las DPSC aisladas mediante el método ED demostraron una proliferación y diferenciación más rápidas y una mayor expresión de marcadores de superficie adicionales que las aisladas mediante el método OG. Curiosamente, las células madre inmaduras de la pulpa dental (IDPSC) extraídas de dientes deciduos mediante la técnica OG mostraron que el cultivo celular fomentaba la proliferación selectiva de IDPSC, evitando así la diferenciación precoz42.

La purificación de las DPSC es crucial para la obtención de células altamente regenerativas y requiere marcadores celulares específicos. La selección de células se realiza mediante métodos de clasificación de células fluorescentes o activados magnéticamente. Además de los marcadores mencionados, también se utilizan muchos otros antígenos de superficie debido a la naturaleza heterogénea de las DSC43. Sin embargo, no se ha identificado un marcador único para segregar las subpoblaciones.

En comparación con las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, las DPSC han sido reconocidas como una fuente prometedora de células multipotentes debido a su potencial multilinaje44. Es probable que este tallo sea el resultado de la relativa inmadurez de los tejidos de origen, ya que las muelas del juicio, a menudo la fuente de la extracción de DPSC, son los últimos dientes permanentes en desarrollarse y, por lo tanto, son menos maduros quela médulaósea. Este protocolo explora con éxito la naturaleza multipotente de las células madre de la pulpa dental al inducir a estas células a sufrir adipogénesis, osteogénesis y condrogénesis. En particular, las DPSC son el único tipo de célula que regula al alza la expresión de DSPP cuando se cultivan en condiciones osteogénicas, lo que indica su futura diferenciación en odontoblastos46.

Las células madre dentales, aisladas de diversas fuentes, muestran muchos potenciales de proliferación y diferenciación47. Los importantes avances logrados en los sistemas in vitro han tenido un profundo impacto en la biología y la terapéutica de las células madre. A pesar de estos avances, siguen existiendo desafíos a la hora de trasladar las terapias con células madre del laboratorio a la cabecera del paciente. Se debe prestar especial atención a la supervivencia y estabilidad de las células madre para garantizar que las técnicas de conservación no comprometan la viabilidad de estas células. Si bien la investigación con células madre dentales ha arrojado resultados prometedores en modelos animales, existe una necesidad apremiante de extender estos hallazgos a los ensayos en humanos. Al continuar impulsando la investigación y el desarrollo rigurosos, las células madre dentales están preparadas para desempeñar un papel sustancial en el avance del campo de los bancos de células madre.

Aunque se utiliza ampliamente, el enfoque de digestión enzimática para aislar las células madre de la pulpa dental (DPSC) presenta varias limitaciones. En primer lugar, el proceso puede comprometer la viabilidad celular, ya que enzimas como la colagenasa y la dispasa pueden dañar inadvertidamente las membranas celulares, produciendomenos células madre vivas. Además, este método a menudo resulta en la degradación de la matriz extracelular vital (MEC), que es crucial para preservar las propiedades inherentes de las células madre48. El procedimiento también puede alterar los marcadores de la superficie celular, dificultando la identificación y caracterización precisas de las DPSCs43. Más allá de estas limitaciones biológicas, el enfoque requiere mucho tiempo, lo que eleva los riesgos de contaminación microbiana debido a incubaciones prolongadas a 37 °C. Además, la inconsistencia entre los lotes de enzimas puede dar lugar a resultados variables, lo que dificulta la reproducibilidad del procedimiento de aislamiento. No se puede pasar por alto la carga financiera, ya que las enzimas de alto grado adecuadas para la digestión de tejidos son costosas49. Además, las secuelas de la digestión podrían ver actividad enzimática residual que podría afectar negativamente a los cultivos celulares, influyendo en su salud, proliferación y diferenciación. Por último, el potencial de la digestión enzimática para aislar preferentemente ciertas subpoblaciones de DPSC sobre otras podría sesgar inadvertidamente el acervo celular resultante, influyendo en su potencial terapéutico50.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Dr. Mathew Mazhavancheril, Director y Jefe del Centro de Investigación Pushpagiri en Thiruvalla, por su apoyo en la documentación de los procedimientos en el Centro de Investigación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
3-isobuty-l-metil-xantina Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI5879
Ácido acético Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAAS001
Alcian Blue Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USARM471
Solución de tinción Alizarin Red SSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAGRM894
Fosfatasa alcalina -Kit de tinciónThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific, MA 02451, EE. UU.Gibco
Alpha Medio esencial mínimo (α-MEM) Thermo Fisher Scientific, MA 02451, EE. UU.Gibco
Alpha-MEM, o Medio esencial mínimo alfaThermo Fisher Scientific, MA 02451, EE. UUGibco
Alpha-MEM, o Medio esencial mínimo alfaThermo Fisher Scientific, MA 02451, EE. UUGibco
Antibiótico/AntimicóticoSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.EE. UUP4333
Ascorbato-2-fosfatoSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA012-04802
Beta-glicerofosfato Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAG9422-10G
Gabinete de bioseguridad-Campana de flujo laminarLabconco Corporation, MO 64132-2696, EE. UU
CD90, CD105, CD73, CD34, CD45 y HLA-DRBioLegend, Inc.CA 92121, EE. UU
Filtro de células (70 y micro; m )Laboratorios HiMedia  Ltd.Mumbai, IndiaTCP025Centrífuga de filtro de celdas
REMI Elektrotechnik Limited (REMI)
CentrífugaHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai, India1101 | 1102
CO2 IncubadoraThermo Fisher Scientific, MA 02451, EE. UU
Colagenasa tipo IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, EE. UU
Colagenasa tipo IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, EE. UU
Medio de crecimiento completoHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai, IndiaAT006DMEM
Tubos cónicos (15 o 50Thermo Fisher Scientific, MA, EE. UU.546021P / 546041P15 mL y 50 mL
Contenedor de congelación criogénicaThermo Fisher Scientific, MA 02451, EE. UU15-350-50
Etiquetas criogénicasEtiqueta India:
Cajas de almacenamiento criovial de almacenamiento Cryostore
Cryovials ThermoFisher Scientific ,MA 02451,USA
Cryovials (1.8 mL)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAPW1282Matraz de cultivo autoportante
(25 cm²)Corning Inc.NY 14831,EE. UU.
Matraces de cultivoHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai, IndiaTCG4 / TCG6T25 / T75
Placas de cultivo HiMediaLaboratories   Ltd.Mumbai, IndiaTCP129/TCP00860 mm/100 mm
Discos de diamante dental KometSC 29730, EE. UU. Komet 
Excavadora de cuchara dentalBrasseler, GA 31419, EE. UU5023591U0
DexametasonaSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
Dimethyl Sulfóxido (DMSO)Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATC185
DispaseRoche Diagnostics,Mannheim,Alemania.
DispasaRoche Diagnostics GmbH, Mannheim,Alemania
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, EE. UU.
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,EE. UU.
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,EE. UU.
Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)Thermo Fisher Scientific,MA 02451,EE. UU
. Etanol (70%)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai, IndiaMB106
Etanol -70%Thermo Fisher Scientific, MA 02451, EE. UUPinzas de extracción Fisher Scientific
 Dentsply Sirona, EE. UU
. Suero fetal bovino (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,EE. UUF2442-500ML
Suero fetal bovino (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,EE. UUF2442-500ML
Suero fetal bovino (FBS)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaRM9954
Suero fetal bovino (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Suero fetal bovino (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Placa de cultivo de tejidos recubierta de fibronectinaCorning Inc.Corning, NY 14831,USA
Citómetro de flujoBD Biosciences,CA 95131,USA
Tampón de citometría de flujoBD Biosciences,CA 95131,USA
Cubreobjetos de vidrio 22 x 22 mmHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai, IndiaTCP017
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Lonza Group Ltd,4002 Basilea, Suiza
Pieza de mano dental de alta velocidad NSK Ltd, Tokio 8216, JapónTi-Max Z series
Horse SerumThermo Fisher Scientific, MA 02451, EE. UU
IBMX, o 3-isobutil-1-metilxantinaSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.EE. UU
IndometacinaPfizer Inc. NY 10017, EE. UU
Insulina-transferrina-selenio (ITS)Thermo Fisher Scientific, MA 02451, EE. UUI5523
Insulina-Transferrina-Selenio (ITS)Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USAI5523
Premezcla de Insulina-Transferrina-Selenio (ITS)Corning Incorporated,MA 01876,USA
Microscopio invertidoOlympus Corp.,Tokio 163-0914,Japón
Isopropanol (60%)Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI9516
Alcohol isopropílico Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAMB063
Campana de flujo laminarThermo Fisher Scientific,MA 02451,USA
Lidocaína mezclada con epinefrinaDENTSPLY,NC 28277,USACitanest
Liquid NitrogenAir Liquide,75007 París,Francia
Tanque de almacenamiento de nitrógeno líquidoCryo Scientific Systems Pvt. Ltd.
MicropipetasEppendorf AG,22339 Hamburgo,Alemania30020Accupipet-2-20 µ L
Mini molinillo de papel tisúBio-Rad Lab, Inc. CA 94547,EE. UUMini molinillos ReadyPrep
Menos 80 congeladorBlue Star Limited
Cámara de conteo NeubauerMarienfeld Superior,arktheidenfeld,Alemania
Aceite rojo O tinteSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.EE. UU1024190250
Medio de diferenciación osteogénico (ODM) STEMCELL Technologies Inc.Vancouver, BC, V5Z 1B3,Canadá
Paraformaldehído (PFA) Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.EE. UUTCL119
Penicilina-EstreptomicinaGibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,EE. UU
. Solución tamponada de fosfato (PBS) sin Ca++ y Mg++HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTS1101
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Thermo Fisher ScientificGibco
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Thermo Fisher Scientific,MA, EE. UUGibco
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, EE. UU
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, EE. UU.P3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
Proline Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Hoja de bisturí tamaño 15 Swann-Morton Ltd, Sheffield, S6 2BJ, REINO UNIDOBDF-6955C
Hipoclorito de sodioHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai, IndiaAS1024% w/v solución
Tubos de centrífuga estérilesTarsons Products Pvt. Ltd.
Contenedor estéril -20 mL3M Center, MN 55144-1000,EE. UU3 M
Solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS)Sigma Aldrich, EE. UUP3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
Pipetas estériles (2, 5 y 10 mL)Eppendorf AG,22339 Hamburgo,Alemania
Pipetas y puntas estérilesEppendorf India
Surgical Blade MangoBecton, Dickinson and Co.,NJ,USA371030BP Mango 3
Factor de crecimiento transformante-beta 3 (TGF-β 3)R& D Systems, Inc.MN 55413, EE. UU.
Factor de crecimiento transformante-beta 3 (TGF-β 3)R& D Systems, Inc.MN 55413, EE. UU.
Azul Trypan 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Azul Trypan 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypsin-EDTA Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,EE. UU.
Tripsina-EDTA 0.25%Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,EE. UU.
Baño de aguaThermo Fisher Scientific,MA 02451,EE. UU.BSW-01D
. . . . . . . .) . Cajas . . . . .... . . . . . . . Limited

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