Metodología para la inactivación metabólica de bacterias para la investigación de Caenorhabditis elegans

Resumen

La fuente de alimento para Caenorhabditis elegans en el laboratorio es Escherichia coli viva. Dado que las bacterias son metabólicamente activas, presentan una variable de confusión en los estudios metabólicos y farmacológicos en C. elegans. Aquí se describe un protocolo detallado para inactivar metabólicamente las bacterias utilizando paraformaldehído.

Resumen

Caenorhabditis elegans es un organismo modelo común para la investigación en genética, desarrollo, envejecimiento, metabolismo y comportamiento. Debido a que C. elegans consume una dieta de bacterias vivas, la actividad metabólica de su fuente de alimento puede confundir los experimentos que buscan los efectos directos de diversas intervenciones en el gusano. Para evitar los efectos de confusión del metabolismo bacteriano, los investigadores de C. elegans han utilizado múltiples métodos para inactivar metabólicamente las bacterias, incluida la irradiación ultravioleta (UV), la eliminación del calor y los antibióticos. El tratamiento UV tiene un rendimiento relativamente bajo y no se puede utilizar en cultivos líquidos porque cada placa debe examinarse para detectar una eliminación bacteriana exitosa. Un segundo método de tratamiento, la eliminación por calor, afecta negativamente la textura y la calidad nutricional de las bacterias, lo que lleva a la detención del desarrollo de C. elegans. Por último, el tratamiento con antibióticos puede alterar directamente la fisiología de C. elegans , además de prevenir el crecimiento bacteriano. Este manuscrito describe un método alternativo para inactivar metabólicamente bacterias utilizando paraformaldehído (PFA). El tratamiento con PFA retila las proteínas dentro de las células bacterianas para prevenir la actividad metabólica al tiempo que preserva la estructura celular y el contenido nutricional. Este método es de alto rendimiento y se puede utilizar en cultivos líquidos o placas sólidas, ya que la prueba de crecimiento de una placa de bacterias tratadas con PFA valida todo el lote. La inactivación metabólica a través del tratamiento con PFA se puede utilizar para eliminar los efectos de confusión del metabolismo bacteriano en los estudios de suplementación con fármacos o metabolitos, resistencia al estrés, metabolómica y comportamiento en C. elegans.

Introducción

Caenorhabditis elegans fue propuesto originalmente como un organismo modelo en 1965¹ y desde entonces ha sido ampliamente adoptado en estudios de genética, desarrollo, comportamiento, envejecimiento y metabolismo². Debido a su gran tamaño de cría y a su cutícula transparente, C. elegans es especialmente adecuado para el cribado de alto rendimiento con reporteros fluorescentes³. Su corto ciclo de vida, su reproducción hermafrodita y su homología genética con los humanos también hacen de C. elegans un valioso sistema modelo para estudios sobre el desarrollo

Protocolo

1. Inoculación de bacterias

1. Preparar caldo de Luria (LB) disolviendo 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 10 g de cloruro de sodio (NaCl) en 950 mL de agua destilada.
2. Ajuste el pH del LB a 7.0 agregando hidróxido de sodio (NaOH) 5M. Esto solo debería requerir alrededor de 0.2 mL de NaOH.
3. Autoclave el medio LB ajustado por pH en un ciclo de líquido durante 45 minutos a 15 psi. Deje que la solución se enfríe y guárdela a temperatura ambiente.
4. Inocular una sola colonia de bacterias en 100 mL de LB en un matraz Erlenmeyer de 500 mL. Cultive las bacterias durante la noche en una incubadora agitadora a 37 °....

Resultados

En la Figura 1 se muestra un flujo de trabajo detallado del protocolo. Se desarrolló y optimizó un método de alto rendimiento para inactivar consistentemente la replicación bacteriana (Figura 2A) y el metabolismo (Figura 2B) para estudios metabólicos y de fármacos en la investigación de C. elegans utilizando paraformaldehído¹⁶. El objetivo era determinar la concentración más baja de PFA necesaria y l.......

Discusión

Beneficios de la eliminación de PFA en relación con otros métodos de eliminación de bacterias
El tratamiento con PFA es un método de alto rendimiento para prevenir el metabolismo bacteriano mientras se mantiene una fuente de alimento nutritivo para C. elegans. La eliminación de bacterias mediante el tratamiento con PFA tiene múltiples ventajas sobre otros métodos. A diferencia del tratamiento UV, en el que cada placa debe probarse para comprobar si se ha eliminado con éxito, se puede analizar.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Grapas de papel de	aluminio	2549291
mechero Bunsen	VWR	470121-700
Densímetro de celda	Denville	80-3000-45
Centrífuga	Eppendorg	5430
Campana de gases químicos	Labcono	975050411384RG
Tubos conincales (50 mL)
Fisher	Fisher	14-955-127
E. coli OP50	CGC	OP50
Matraces Erlenmyer	Fisher	250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000
Asa de inoculación	Fisher	22-363-605
LB Agar	Fisher	BP1425500
Botella de recolección de desechos líquidos	Thomas Scientific	1230G50
Sulfato de magnesio (MgSO4)	Sigma	M7506
Paraformaldehído (32%)	Ciencias de la Microscopía Electrónica	15714-S	Paraformaldehído – solución sin metanol
Pipeta	Eppendorf	Eppendorf Easypet 3
Platos de plástico (100 mm)	Fisher	FB0875712
Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)	Fisher	P2853
Seahorse XF Calibrant	Agilent	100840-000
Seahorse XFe96 Kit de ensayo de flujo extracelular y microplaca de cultivo celular	Agilent	101085-004
Pipetas serológicas (50 mL)	Incubadora agitadora Genesee Scientific	12-107
	Thermo	11 676 083
Cloruro de sodio (NaCl)	Fisher	S640-3
Hidróxido de sodio (NaOH)	Fisher	S318500
Fosfato de sodio dibásico anhidro (Na2HPO4)	Sigma	S374-500
Cuchara de recogida de residuos sólidos	M& M Industrias	5.0 Galón M1 Cubo
Triptona	Genesee Scientific	20-251
Vortex	Thermo	11676331
Balanza de pesaje	C Goldenwall	HZ10K6B
Extracto de levadura	Genesee Scientific	20-255

Cubetas 339652 Tradicional