Aplicación de la tinción de mitocondrias vivas en la clasificación celular para purificar hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas

Resumen

Los hepatocitos derivados de células madre pluripotentes se pueden purificar a través de la clasificación celular, utilizando una combinación de tinción de moléculas de adhesión de células leucocitarias mitocondriales y activadas (ALCAM, también conocida como CD166).

Resumen

Las células madre embrionarias humanas (ES) y las células madre pluripotentes inducidas (iPS) tienen aplicaciones potenciales en la medicina regenerativa basada en células para el tratamiento de órganos gravemente enfermos debido a su proliferación ilimitada y propiedades pluripotentes. Sin embargo, diferenciar las células ES/iPS humanas en tipos de células diana 100% puras es un reto debido a su alta sensibilidad al medio ambiente. La tumorigénesis después del trasplante es causada por células contaminadas, proliferantes e indiferenciadas, lo que hace que la tecnología de alta purificación sea esencial para la realización segura de la medicina regenerativa. Para mitigar el riesgo de tumorigénesis, se ha desarrollado una tecnología de alta purificación para hepatocitos derivados de células iPS humanas. El método emplea FACS (clasificación celular activada por fluorescencia) utilizando una combinación de alto contenido mitocondrial y el marcador de superficie celular ALCAM (molécula de adhesión celular leucocitaria activada) sin modificación genética. El 97% ± 0,38% (n = 5) de los hepatocitos purificados mediante este método mostraron expresión de la proteína albúmina. Este artículo tiene como objetivo proporcionar procedimientos detallados para este método, aplicados al método de diferenciación bidimensional más actual para células iPS humanas en hepatocitos.

Introducción

Las células madre pluripotentes embrionarias e inducidas (ES e iPS, respectivamente) se consideran fuentes celulares prometedoras para terapias regenerativas. Sin embargo, la eficiencia de diferenciar estas células en tipos específicos de células objetivo puede variar, incluso cuando se utiliza la misma línea celular, protocolo y experimentador 1,2,3,4. Esta variabilidad puede atribuirse a la alta sensibilidad de las células ES/iPS humanas a su entorno. Por lo tanto, actualmente es difícil obtener de manera consistente células diana puras. Para lograr una medicina regenerativa altamente segura, es crucial eliminar las células proliferativas y las células madre indiferenciadas en las células terapéuticas, y la tecnología avanzada de purificación para las células diana es esencial ^5,6,7.

Un clasificador de células es un dispositivo que analiza instantáneamente las células individuales y clasifica las células vivas de interés en función de la intensidad de la señal fluorescente, lo que ofrece una solución prometedora. Esto se puede lograr mediante la tinción de anticuerpos de marcadores de superficie específicos del tipo celular o mediante la utilización de expresiones de genes reporteros específicos del tipo celular. Utilizando esta técnica, existen varios reportes sobre métodos para purificar cardiomiocitos^derivados de células madre pluripotentes ^8,9,10 y hepatocitos ^11,12. Hattori et al. desarrollaron un innovador método de purificación mitocondrial utilizando un clasificador de células¹³. Aprovechando el hecho de que los cardiomiocitos tienen altas demandas de energía a través de la actividad mitocondrial, la tinción de las células con el colorante indicativo de mitocondrias vivas TMRM (éster metílico de tetrametilrodamina) se puede utilizar para marcar y purificar altamente cardiomiocitos por FACS a partir de cuerpos embrioides derivados de células madre embrionarias humanas que contienen varios tipos de células. La ausencia de tumorigénesis se confirmó mediante ensayos de formación de teratomas con los cardiomiocitos purificados. Además, Yamashita et al. descubrieron inesperadamente un método para purificar hepatocitos de cuerpos embrioides derivados de células madre embrionarias humanas mediante el aislamiento de fracciones con alta actividad mitocondrial y expresión positiva de ALCAM¹⁴. La justificación de este método es que los hepatocitos también tienen un número relativamente alto de mitocondrias debido a su alto consumo de ATP para el metabolismo de nutrientes y la desintoxicación¹⁵, y los hepatocitos expresan ALCAM, un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas, que desempeña un papel en la adhesión y migración celular¹⁶.

Los métodos previos de alta purificación para hepatocitos derivados de células madre pluripotentes requerían modificaciones genéticas, y los métodos de purificación no genética tenían baja eficiencia¹⁷. El método mitocondrial no genético tiene mérito para lograr una alta pureza. Cuando se necesitan células progenitoras hepáticas, se pueden elegir los métodos basados en CD133 y CD13 o Dlk1^18,19. Aunque la precisión de la tecnología de edición del genoma ha avanzado, el riesgo potencial de cambios genómicos imprevistos (por ejemplo, carcinogénesis) no se puede eliminar por completo. Los métodos basados en la actividad mitocondrial, sin implicar modificación genética, pueden estar libres de tales riesgos.

Como resultado del examen de varios indicadores mitocondriales en cardiomiocitos de ratas neonatales, se observó que la TMRM desapareció completamente en 24 h, mientras que otros colorantes permanecieron durante al menos 5 días¹³. Además, es importante señalar que TMRM y JC-1 no afectaron la viabilidad celular cuando se evaluaron con el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), mientras que otros colorantes demostraron efectos variables sobre la viabilidad celular¹³. TMRM demuestra una mayor seguridad.

Hasta la fecha, se han desarrollado varios métodos de diferenciación bidimensional (2D) como enfoques más eficientes para inducir la diferenciación en comparación con la formación de cuerpos embrioides tridimensionales (3D). Esto se debe a que los compuestos o citocinas inductoras de diferenciación escalonada se pueden administrar uniformemente a las células en un plano 2D, en lugar de en un espacio 3D. En este estudio, el método²⁰ previamente reportado fue modificado para inducir la diferenciación en hepatocitos derivados de células iPS humanas. Aquí, se describen los detalles de los procedimientos para la diferenciación y purificación 2D actualizada de hepatocitos derivados de células iPS humanas.

Protocolo

En este estudio se utilizaron células iPS humanas obtenidas comercialmente (cepa 253G1) (véase la Tabla de Materiales).

1. Mantenimiento de las células iPS humanas

1. Mantener las células iPS humanas en condiciones libres de alimentador en medio AK02 en placas de cultivo recubiertas con iMatrix-511 de 0,25 μg/^cm2 (ver Tabla de Materiales).

2. Diferenciación hepática de células iPS humanas en cultivos 2D

NOTA: Consulte la Figura 1A para ver el programa diario de diferenciación hepática. A lo largo del proceso, use placas de cultivo de 6 pocillos y agregue 2 mL del medio de lavado o cultivo designado a cada pocillo. Mantener la condición de cultivo celular al 100% de humedad, 5% de CO₂ y 20% de_O2 a 37 °C.

1. Cubra cada pocillo de una placa de 6 pocillos con 1 mL de matriz de membrana basal (diluida 1/25 en PBS (-)), e incube a 37 °C durante 1 h.
2. Pase las células iPS humanas a la placa recubierta a una densidad de 20.000-30.000 células/cm² utilizando el medio AK02N suplementado con 10 μM de inhibidor de ROCK (Y-27632) (ver Tabla de Materiales). Reemplace el medio sin Y-27632 al día siguiente y cultive durante 2 días adicionales.
3. Lave las celdas una vez con el medio RPMI-1640. Iniciar la diferenciación del endodermo sustituyendo el medio por RPMI-B27-Glu (RPMI-1640 + 2% de insulina B27 + 1% de dipéptido L-Alanil-L-glutamina) suplementado con 3-6 μM de CHIR-99021 y 100 ng/mL de activina A durante 24 h (ver Tabla de Materiales).
4. Sustituya el medio por RPMI-B27-Glu suplementado con 50 ng/mL de Activina A durante 24 h.
5. Para inducir la diferenciación de los progenitores hepáticos, reemplace el medio con RPMI-B27-Glu suplementado con dimetilsulfóxido (DMSO) al 1% durante 5 días.
6. Para promover la maduración de los hepatocitos, cambie a un medio de maduración de hepatocitos: medio L-15 de Leibovitz que contiene 10 μM de hidrocortisona 21-hemisuccinato, 8,3% de caldo de fosfato de triptosa, 100 nM de dexametasona (DEX), 50 μg/mL de sodio-L-ascorbato, 0,58% de insulina-transferrina-selenio (ITS), 8,3% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de dipéptido L-Alanil-L-glutamina y 100 nM N-Hexanoico-Try-Ile-(6)-amino amida hexanoica (Dihexa) (ver Tabla de Materiales).
7. Cambie el medio cada 2 días durante 20 días. Ordene las celdas aproximadamente 27 días después de iniciar la diferenciación.

3. Preparación celular para la purificación de hepatocitos derivados de células iPS humanas

1. Lave las células hepáticas diferenciadas con 2 mL de PBS (-) por pocillo.
2. Agregue 1 mL de solución enzimática por pocillo, que incluye 0.1% de colagenasa, 0.083% de tripsina, 10 μM de inhibidor de ROCK (Y-27632), 20 nM de ciclosporina A y 50 μg/mL de sodio-L-ascorbato en tampón Ads (116 mM de NaCl, 12.5 mM de NaH₂PO₄, 20 mM de HEPES, 5.4 mM de KCl, 5.6 mM de glucosa y 0.8 mM de MgSO4; pH 7.35) (ver Tabla de Materiales). Separe las células de las placas girando horizontalmente a 37 °C durante aproximadamente 2 h.
3. Después de confirmar que las células se han desprendido y redondeado bajo un microscopio, disperse en células individuales mediante un pipeteo suave y recójalas en un tubo de 50 ml.
4. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a 18 °C para peletizarlas. Retire el sobrenadante con un aspirador.
5. Teñir las mitocondrias de las células dispersándolas en 5 mL de medio de maduración de hepatocitos que contenga 100 nM de TMRM (tetrametilrodamina, éster de metl) (ver Tabla de Materiales). Incubar durante 30 minutos a 37 °C mientras se protege de la luz envolviéndolo en papel de aluminio.
6. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a 18 °C para granularlas. Retire el sobrenadante.
7. Vuelva a suspender las células con 1-5 mL de tampón Ads frío que contenga un 2% de FBS.
8. Cuente el número de células con una solución de azul de tripano al 0,4% y una placa de recuento de células.
9. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a 4 °C para granularlas. Retire el sobrenadante.
10. Diluir un anticuerpo anti-ALCAM (anticuerpo primario, ver Tabla de Materiales) en una proporción de 1:50 en tampón Ads y añadir 100 μL del anticuerpo diluido por cada 10⁶ células. Tiñe las células durante 50 minutos con hielo. Prepare las células que no están teñidas con el anticuerpo primario como control negativo.
11. Lave las celdas con tampón frío Ads que contiene 2% de FBS dos veces.
12. Diluir una Alexa Fluor 488 donkey anti-cabra IgG (anticuerpo secundario, ver Tabla de Materiales) en una proporción de 1:100 en tampón Ads, y añadir 100 μL del anticuerpo diluido por cada 10⁶ células. Tiñe las células durante 30 minutos con hielo. Tinte las células que no se tiñeron con el anticuerpo primario utilizando el anticuerpo secundario.
13. Lave las celdas con tampón frío Ads que contiene 2% de FBS dos veces.
14. Vuelva a suspender las celdas en el búfer de anuncios y fíltrelas a través de un filtro de celdas de tapa a presión (malla de 35 μm) justo antes de clasificarlas por FACS para eliminar los grupos de celdas grandes y los desechos.

4. Análisis FACS y clasificación de hepatocitos derivados de células iPS humanas

1. Configure la máquina FACS para la clasificación de celdas siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Utilice un tamaño de boquilla de 85 μm o 100 μm y un filtro ND de 2.0 para los hepatocitos. Utilice el canal FITC para detectar Alexa Flour 488 para ALCAM y el canal PE para detectar la fluorescencia de TMRM para las mitocondrias.
2. Ajuste los voltajes FSC (dispersión directa) y SSC (dispersión lateral) para visualizar correctamente la población de celdas.
3. Ajuste los voltajes de los canales fluorescentes FITC y PE. Comience con celdas sin etiquetar y centre la población de celdas en la parte inferior de cada gráfico de canal. Asegúrese de que las celdas etiquetadas estén colocadas correctamente dentro de la gráfica.
4. Utilice una estrategia de compuerta común para eliminar los dobletes: Puerta el FSC-A principal vs. Población SSC-A (Figura 2A), seguida de FSC-H vs. -W, y luego SSC-H vs. -W (Figura 2B,C).
5. Controlar la población de TMRM^hi y ALCAM⁺ (P2 en la Figura 2E) para clasificar los hepatocitos. Controlar ^{la población} de TMRM^hi y ALCAM- (P1 en la Figura 2E) para clasificar los no hepatocitos. Recoja hepatocitos clasificados y no hepatocitos en tubos de recolección de 15 mL que contengan medio de maduración de hepatocitos.
6. Centrifugar el tubo de recogida que contiene las células clasificadas a 200 x g durante 5 min a 18 °C.
7. Retirar el sobrenadante y resuspender las células en medio de maduración de hepatocitos.
8. Siembre las células en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) tratados con mitomicina C o en una matriz de membrana basal gelatinosa con medio de maduración de hepatocitos suplementado con 10 μM de Y-27632 y 20 nM de ciclosporina A. Cultive las células en una incubadora de CO₂ a 37 °C durante 5 días.

5. Inmunocitoquímica para la detección de hepatocitos derivados de células iPS humanas

1. Lavar las células cultivadas durante 5 días después de la clasificación con PBS (-).
2. Fije las celdas con paraformaldehído al 4% durante 5 minutos a temperatura ambiente.
3. Lave las células con tampón TBS-T (1x TBS con 1% Tween 20) dos veces para eliminar el paraformaldehído.
4. Incubar las células con tampón TBS-T diluido Triton X-100 al 0,1% durante 5 min a temperatura ambiente.
5. Lave las celdas con tampón TBS-T dos veces para eliminar Triton X-100.
6. Agregue la solución de bloqueo disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales) a las celdas durante 30 minutos a temperatura ambiente.
7. Añadir anticuerpos primarios contra la albúmina (marcador de hepatocitos) y el antígeno nuclear humano (hNA, ver Tabla de Materiales), diluidos 1:50 en solución de bloqueo.
8. Incubar las células a 4 °C durante la noche. Lave las células con tampón TBS-T dos veces.
9. Añadir anticuerpos secundarios: Alexa Fluor 488 burro anti-conejo IgG y Alexa Fluor 546 burro anti-ratón IgG, diluidos 1:100 en solución de bloqueo (ver Tabla de Materiales).
10. Incuba las células a temperatura ambiente durante 30 min. Lave las células con tampón TBS-T dos veces.
11. Evalúe la pureza de los hepatocitos mediante el recuento de células positivas para albúmina y hNA positivas bajo un microscopio de fluorescencia. Calcule el porcentaje de células positivas para albúmina por célula hNA positiva para las poblaciones P1 y P2.

Resultados

Se muestra la cronología de los procesos que inducen a las células iPS humanas a diferenciarse en hepatocitos a través de cultivo 2D (Figura 1A) y las características celulares representativas (Figura 1B). Aproximadamente en el día 12 de diferenciación, las células comenzaron a exhibir formas celulares poligonales y núcleos redondos, característicos de los hepatocitos. Algunos hepatocitos también mostraron multinucleación.

El análisis...

Discusión

Debido a sus funciones en el metabolismo de nutrientes y la desintoxicación, los hepatocitos poseen un número relativamente grande de mitocondrias en comparación con otros tipos de células¹⁵. ALCAM es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas y desempeña un papel en la adhesión y migración celular. Se expresa en varios tipos de células, incluyendo células hepáticas, epiteliales, linfocíticas, mieloides, fibroblastos y neuronales¹⁶. Mediante la utilización de una...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
253G1 línea celular iPS humana	Centro de Investigación de Recursos Biológicos RIKEN	HPS0002
4% de paraformaldehído	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	163-20145
Activina Una Solución, Humana, Recombinante	NACALAI TESQUE, INC.	18585
Anticuerpo anti-núcleos, clon 235-1	Chemicon	MAB1281	Anticuerpo contra el antígeno nuclear humano
B-27 Suplemento (50x), sin suero	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSAria III	BD Biosciences Clasificador de		células
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182
Ciclosporina A	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	035-18961
Colagenasa	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	034-22363
Corning Matrigel Factor de crecimiento reducido (GFR) Matriz de membrana basal	Corning	354230	Matriz de membrana basal gelatinosa
CultureSure Y-27632	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-24023	Inhibidor de ROCK
Dexametasona	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-18863
Dimetilsulfóxido (DMSO)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-29353
Burro anti-Cabra IgG (H+L) Anticuerpo secundario de adsorción cruzada, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Anticuerpo secundario anti-ratón Donkey IgG (H+L) altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10036
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Falcon 5 mL Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo, con filtro de células Tapón a presión	Suero
	Biowest	51820-500
GlutaMAX Suplemento	Thermo Fisher Scientific	35050061	Dipéptido L-Alanil-L-Glutamina
Humano/Ratón/Rata/Canino ALCAM/CD166 Anticuerpo	R& D Systems	AF1172
Hidrocortisona 21-hemisuccinato sal sódica	Sigma-Aldrich	H2270
iMatrix-511	seda Nippi	892021
ImmunoBlock	KAC CTKN001		solución de bloqueo
ITS-G Suplemento(× 100)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	090-06741
Medio L-15 de Leibovitz	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	128-06075
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Amida hexanoica (Dihexa)	Toronto Research Chemicals	H293745
Conejo policlonal Albúmina antihumana	Dako	A0001
Polioxietileno Sorbitán Monolaurato (preadolescente 20)	NACALAI TESQUE, INC.	28353-85
RPMI-1640	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	189-02025
L-ascorbato de sodio	NACALAI TESQUE, INC.	03422-32
StemFit AK02N	REPROCELL	RCAK02N
TBS (10x)	NACALAI TESQUE, INC.	12748-31
Tetrametilrodamina, éster metílico (TMRM)	Thermo Fisher Scientific	T668
Triton X-100	NACALAI TESQUE, INC.	28229-25
Solución de Azul de Tripán	NACALAI TESQUE, INC.	20577-34
TRIPSINA 250	Difco	215240
Solución de caldo de fosfato de triptosa	Sigma-Aldrich	T8159