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Artículo de método

Aislamiento, identificación conductual y evaluación de la patogenicidad de hongos entomopatógenos de un barrenador forestal

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DOI:

10.3791/65782

29 de septiembre de 2023

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

En este trabajo se presenta un protocolo para la obtención de hongos entomopatógenos a partir de un barrenador forestal de la madera y una forma sustitutiva de evaluar sus actividades entomopatógenas utilizando un insecto modelo de coleóptero. Este método es eficiente y conveniente para explorar recursos fúngicos entomopatógenos de plagas de insectos perforadores de madera en bosques naturales.

Resumen

Los barrenadores forestales de la madera causan graves daños a los árboles y pérdidas económicas en todo el mundo. La liberación de hongos entomopatógenos (EPF) durante el período de emergencia de FWB se considera una alternativa aceptable al control químico. Sin embargo, los recursos de EPF se han explorado significativamente menos para los FWB, en contraste con las plagas de insectos agrícolas. Este artículo presenta un protocolo para explorar los recursos de EPF de los FWB utilizando como ejemplo las poblaciones silvestres de Monochamus alternatus . En este protocolo, la asignación de trampas cebadas con M. Los atrayentes alternados a diferentes poblaciones garantizaron la recolección de muestras adecuadas con síntomas de infección natural, durante los períodos de emergencia del escarabajo. Después de una disección fina de tegumentos y su colocación en un medio selectivo, se aislaron especies fúngicas de cada parte de los cuerpos de los escarabajos y se identificaron en función de los rasgos moleculares y morfológicos.

Varias especies de hongos fueron certificadas como EPF parásitas a través de la reinfección de M. alternatus sano con suspensiones de esporas. Sus fenotipos de comportamiento en M. alternatus se observaron mediante microscopía electrónica de barrido y se compararon con los del insecto modelo de coleóptero Tribolium castaneum. Para los EPFs que presentan fenotipos de parasitismo consistentes en ambas especies de escarabajos, la evaluación de sus actividades sobre T. castaneum proporcionó información valiosa sobre la letalidad para futuros estudios sobre M. alternatus. Este protocolo ayudó al descubrimiento de EPF recientemente reportado sobre poblaciones de M. alternatus en China, que podría aplicarse como un enfoque eficiente para explorar más recursos de EPF de otros FWB.

Introducción

La devastación causada por las plagas de insectos ha provocado grandes pérdidas ecológicas y económicas tanto en los ecosistemas forestales como en los agrícolas. La mayoría de las plagas agrícolas se exponen a enemigos naturales o agentes de control artificiales mientras dañan las plantas hospederas. En cambio, los barrenadores de la madera forestal (FWB, por sus siglas en inglés) casi completan todos sus ciclos de desarrollo dentro de los troncos de los árboles huéspedes1, lo que plantea grandes desafíos para explorar organismos de control biológico eficientes de FWB en el campo silvestre. Lo que es aún peor ....

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Protocolo

1. Aislamiento de hongos de M. alternatus (Figura 1)

  1. Recoge la muestra del escarabajo
    1. Recoge los pinos escarabajos aserradores M. alternatus utilizando trampas comerciales (ver Tabla de Materiales) cebadas con atrayentes antes de los períodos de emergencia previstos de las poblaciones de escarabajos en bosques de pinos naturalmente infectados.
      NOTA: En este estudio, se recolectaron escarabajos de cinco regiones geográficas del sur de China (Huzhou / Zhejiang, Liangshan / Sichuan, Xiamen / Fujian, Shaogan / G....

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Resultados

Aislamiento e identificación de aislados fúngicos de M. Alternatus
Con la ayuda de trampas atrayentes, un gran número (aproximadamente 500 escarabajos en total) de M. Se recolectaron alternatus en cinco regiones geográficas. Se recogieron cadáveres de escarabajos con síntomas típicos de infección por hongos entomopatógenos; Luego, los tegumentos corporales de cada escarabajo se diseccionaron en varias posiciones, como se describe en el paso 1.3 del protocolo. Como .......

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Discusión

Diferentes poblaciones geográficas de FWB pueden desarrollar interacciones variadas con los hongos entomopatógenos naturales, debido a la adaptación ambiental a largo plazo de las especies de EPF a los factores climáticos locales y a la población genotípica específica del insecto huésped44,45. La expansión de los sitios de muestreo a múltiples regiones de presencia de insectos ayuda a aumentar la posibilidad de adquirir diversas .......

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Esta investigación contó con el apoyo del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2021YFC2600100) y la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Zhejiang (LY21C040001).

....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de centrífuga de 1,5 mL, 2 mL BiosharpBS-15-M
10 y micro; L puntas de pipetaSangon BiotechF601216
10 µ L, 20 y micro; L, 100 y micro; L, 200 y micro; L, 1.000 y micro; L pipetasRainin
1.000 y micro; Puntas de pipetaL Sangon BiotechF630102
viales criogénicos de 2 mLCorning430659
20x tampón PBSSangon BiotechB548117-0500
200 µ Puntas de pipetaL Sangon BiotechF601227
fabricante de 2.000 bpTaKaRarSD0531
Tubos de 50 mLNest602052
solución de glutaraldehído al 50%Sangon BiotechG916054
50x Tampón TAESangon BiotechB548101
6x tampón de cargaTaKaRarSD0503
AgarosaSangon BiotechA610013
etanol anhidroJkchemicalLB10V37
Bioquímica Gabinete de cultivoShanghaiyihengLRH-250F
CloroformoJuhua61553
Trampas comerciales para escarabajosFEIMENGDIBF-8 www.yinyouji.com
Generador de imágenes en gelBio-RadGelDoc XR+
GlicerolSangon BiotechA600232
Centrífuga refrigerada de alta velocidadSigmaD-37520
Olla de esterilización por vapor a alta presiónMettler ToledoJA5003
Alcohol isopropílicoReactivo generalG75885B
Colorante de ácido nucleicoSangon BiotechA616696
Microscopio óptico, OMLeicaDM2000
ParafilmParafilmPM996
Medidor de PCRFuerza de curaciónTrident960
Penicilina GMarklinGB15743
Agar patata dextrosa, PDAOxoidCM0139
Caldo de patata dextrosa, PDBSolarbioP9240
ImprimacionesSangon Biotech/
PrimersTaq TaKaRarRR902A
Kit de aislamiento de ADN genómico rápido de hongosSangon Biotech Microscopio
, SEMHitachiS-3400N
EstreptomicinaMarklinS6153
TetraciclinaMarklinT829835
Tween-80MarklinT6336
Liofilizador al vacíoYamatoDC801
Agitador de vórticeHLDWH-861
β-MercaptoetanolMarklinM6230
electrónico de barrido B518229

Referencias

  1. Hajek, A. E., Bauer, L. S. Microbial control of wood-boring insects attacking forest and shade trees. Field Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. 10, 505-525 (2007).
  2. Linnakoski, R., Forbes, K. M. Pathogens-t....

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