Method Article

Aislamiento, identificación conductual y evaluación de la patogenicidad de hongos entomopatógenos de un barrenador forestal

DOI:

10.3791/65782

⸱

September 29th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang A&F University, 2Key Laboratory of Vector Biology and Pathogen Control of Zhejiang Province, Huzhou University, 3Department of Biology, Lund University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este trabajo se presenta un protocolo para la obtención de hongos entomopatógenos a partir de un barrenador forestal de la madera y una forma sustitutiva de evaluar sus actividades entomopatógenas utilizando un insecto modelo de coleóptero. Este método es eficiente y conveniente para explorar recursos fúngicos entomopatógenos de plagas de insectos perforadores de madera en bosques naturales.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los barrenadores forestales de la madera causan graves daños a los árboles y pérdidas económicas en todo el mundo. La liberación de hongos entomopatógenos (EPF) durante el período de emergencia de FWB se considera una alternativa aceptable al control químico. Sin embargo, los recursos de EPF se han explorado significativamente menos para los FWB, en contraste con las plagas de insectos agrícolas. Este artículo presenta un protocolo para explorar los recursos de EPF de los FWB utilizando como ejemplo las poblaciones silvestres de Monochamus alternatus . En este protocolo, la asignación de trampas cebadas con M. Los atrayentes alternados a diferentes poblaciones garantizaron la recolección de muestras adecuadas con síntomas de infección natural, durante los períodos de emergencia del escarabajo. Después de una disección fina de tegumentos y su colocación en un medio selectivo, se aislaron especies fúngicas de cada parte de los cuerpos de los escarabajos y se identificaron en función de los rasgos moleculares y morfológicos.

Varias especies de hongos fueron certificadas como EPF parásitas a través de la reinfección de M. alternatus sano con suspensiones de esporas. Sus fenotipos de comportamiento en M. alternatus se observaron mediante microscopía electrónica de barrido y se compararon con los del insecto modelo de coleóptero Tribolium castaneum. Para los EPFs que presentan fenotipos de parasitismo consistentes en ambas especies de escarabajos, la evaluación de sus actividades sobre T. castaneum proporcionó información valiosa sobre la letalidad para futuros estudios sobre M. alternatus. Este protocolo ayudó al descubrimiento de EPF recientemente reportado sobre poblaciones de M. alternatus en China, que podría aplicarse como un enfoque eficiente para explorar más recursos de EPF de otros FWB.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La devastación causada por las plagas de insectos ha provocado grandes pérdidas ecológicas y económicas tanto en los ecosistemas forestales como en los agrícolas. La mayoría de las plagas agrícolas se exponen a enemigos naturales o agentes de control artificiales mientras dañan las plantas hospederas. En cambio, los barrenadores de la madera forestal (FWB, por sus siglas en inglés) casi completan todos sus ciclos de desarrollo dentro de los troncos de los árboles huéspedes1, lo que plantea grandes desafíos para explorar organismos de control biológico eficientes de FWB en el campo silvestre. Lo que es aún peor es que los FWB transportan un gran número de fitopatógenos2 o tienen una relación íntima con estos patógenos como sus vectores potenciales 3,4, lo que amplifica drásticamente los efectos negativos de los FWB en la salud de los bosques. El uso excesivo de insecticidas químicos puede aliviar la gravedad de la FWB, pero la aparición de resistencia a los insecticidas 5,6 limita su aplicación en el medio ambiente. En ciertos casos, insectos parasitoides, artrópodos depredadores y microbios entomopatógenos fueron liberados como agentes de biocontrol en las áreas de distribución de FWB7 y se demostró que eran alternativas eficientes y económicamente aceptables al control químico 8,9,10.

Se considera que los hongos entomopatógenos (EPF) tienen la ventaja en el control de FWB sobre la mayoría de los otros grupos microbianos. Sus esporas pueden ser transportadas por insectos hospedadores y fijadas de manera estable en las superficies corporales a través de la penetración en la cutícula o el tegumento 8,11. Los EPF también presentan una excelente adaptabilidad a los estreses ambientales y algunas especies colonizan bien en el tejido de los árboles como endófitos12,13, facilitando su crecimiento, supervivencia y transmisión. Sin embargo, en comparación con la de las industrias agrícolas, la diversidad de especies de EPF utilizada en los ecosistemas forestales naturales es notablemente restringida 14,15,16. Beauveria bassiana (cepa PPRI 5339) se evidenció como la cepa más prometedora para promover un programa de MIP para gorgojos de Eucalyptus en Sudáfrica17 y la combinación de dos aislados prometedores de B. bassiana brindó una oportunidad para el control microbiano práctico del picudo rojo de las palmeras, Rhynchophorus ferrugineus, en diferentes etapas de vida en campos de palmeras18. Además de Beauveria y el conocido Metarhizium, otros géneros de EPF del orden Hypocreales, especialmente especies de Lecanicillium (muchas de las cuales ahora se clasifican en el género Akanthomyces19,20), mostraron una fuerte patogenicidad y un alto potencial en el manejo de plagas forestales, como el pulgón ciprés en Chile21.

El escarabajo aserrador del pino Monochamus alternatus es una plaga notoria de los bosques de pinos en China y los países vecinos, que se entierra en las ramas y troncos de los pinos para impedir el transporte de nutrientes y agua 22,23,24. Por otra parte, M. alternatus también promueve la invasión del nematodo fitoparásito de la madera del pino (Bursaphelenchus xylophilus, PWN) como su principal escarabajo vector. Otra especie congénere del escarabajo, M. galloprovincialis, se ha propagado en varios países de Europa en los últimos años25. Investigaciones previas informaron de varios géneros de EPFs naturales de Monochamus spp., como Beauveria, Metarhizium y Lecanicillium (Verticillium, un nombre aún más antiguo de Lecanicillium), en España, Japón y las provincias de Anhui/Zhejiang de China 26,27,28,29. Sin embargo, estas colecciones de EPF parecen estar comúnmente restringidas en un lugar determinado, en comparación con la amplia presencia de escarabajos Monochamus en campos naturales. Dado que el escarabajo M. alternatus tiene una amplia distribución geográfica en China, podría considerarse como un barrenador de la madera representativo para explorar más posibles EPF en diferentes poblaciones.

En el presente protocolo, introducimos un procedimiento específico que explora las EPFs de varias poblaciones geográficas de M. alternatus en el sur de China. Este protocolo utiliza un modelo de escarabajo coleóptero como sustituto para realizar ensayos de entomopatogenicidad, bajo la condición de que la especie fúngica analizada tenga un fenotipo de comportamiento consistente en ambas especies de escarabajos. Este protocolo también puede proporcionar información sobre la exploración de EPF en busca de otros barrenadores de la madera forestal, en los que la diversidad de sus especies fúngicas entomopatógenas está subestimada o menos investigada.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Aislamiento de hongos de M. alternatus (Figura 1)

  1. Recoge la muestra del escarabajo
    1. Recoge los pinos escarabajos aserradores M. alternatus utilizando trampas comerciales (ver Tabla de Materiales) cebadas con atrayentes antes de los períodos de emergencia previstos de las poblaciones de escarabajos en bosques de pinos naturalmente infectados.
      NOTA: En este estudio, se recolectaron escarabajos de cinco regiones geográficas del sur de China (Huzhou / Zhejiang, Liangshan / Sichuan, Xiamen / Fujian, Shaogan / Guangdong, Yulin / Guangxi). La configuración de la trampa de arriba a abajo es la siguiente: una tapa redonda (50 cm de diámetro), un panel en forma de cruz (35 cm de ancho y 66 cm de largo), un embudo (35,5 cm de diámetro redondo superior y 5,5 cm de diámetro redondo inferior), una taza de recolección (10,5 cm de diámetro y 26,5 cm de largo). Los volátiles del huésped (por ejemplo, etanol y α-pineno) y la feromona de agregación (2-undeciloxi-1-etanol) se utilizan como cebo30.
    2. Etiquete el espécimen antes de transferirlo al laboratorio. Coloque cada escarabajo en tubos esterilizados individuales con ramitas frescas. Reemplace las ramitas por otras frescas cada 2 días.
    3. Cría los escarabajos vivos a 25 ± 1 °C en una incubadora no humidificada (ciclos de 16-8 L/D) y obsérvalos diariamente.
    4. Registre las muestras que muestren una disminución de la alimentación y la movilidad. Traslado muerto M. alternatus que se endurecen y endurecen a cámaras húmedas para observar el crecimiento de micelios y conidios fúngicos.
      NOTA: Una vez infectados por hongos entomopatógenos, los escarabajos mostraron una disminución en la alimentación y movilidad en la etapa inicial de la infección31,32. Después de la muerte, sus cuerpos se endurecieron y se volvieron rígidos, con micelios y conidios que aparecieron varios días después del almacenamiento en una cámara húmeda33.
    5. Almacene los cadáveres de escarabajos con infecciones fúngicas a 4 °C para su uso futuro. Para seguir este protocolo, procese las muestras inmediatamente en unas pocas horas para evitar la contaminación con hongos más saprótrofos.
  2. Preparación del medio de crecimiento
    1. Añadir 39 g de agar patata dextrosa (PDA) en polvo en 1 litro de agua pura y esterilizarlo en autoclave durante 30 min a 121 °C.
    2. Enfriar hasta una temperatura operable (~50 °C), añadir 0,05 g de estreptomicina, 0,05 g de penicilina G y 0,05 g de tetraciclina, y agitar para distribuir el medio.
    3. Coloque el medio en placas de Petri debajo de un banco limpio y úselo después de la solidificación.
      NOTA: El medio PDA con antibióticos se utiliza para el aislamiento de escarabajos, lo que evita el crecimiento de bacterias sin afectar el crecimiento de hongos durante el aislamiento. Sin embargo, el medio PDA sin antibióticos se utiliza para el cultivo diario y la conservación.
    4. Poner 35 g de caldo de patata dextrosa (PDB) en polvo en 1 L de ddH2O y esterilizarlo en autoclave durante 30 min a 121 °C. Enfríelo para usarlo.
  3. Disección de la muestra de escarabajo con síntomas de infección fúngica
    1. Prepare tijeras, bisturíes y alfileres de insectos esterilizados; Luego, trabaje debajo de un banco limpio con un quemador de alcohol.
      NOTA: El uso de las herramientas de disección se puede ajustar según las preferencias personales. Los alfileres de insectos son más afilados que las agujas de disección estándar, y diferentes especificaciones pueden satisfacer la necesidad de disección.
    2. Disecciona los tegumentos del cuerpo del escarabajo con herramientas en placas de Petri estériles y de un solo uso. Tenga cuidado de evitar posibles daños en los tejidos del intestino medio y posterior que puedan exudar contenidos internos.
    3. Divida los cuerpos de los escarabajos en las posiciones principales de la siguiente manera: antenas, cabeza, tórax, abdomen, alas (cada par) y patas.
  4. Purificación de hongos
    1. Corta los tegumentos de cada posición en trozos pequeños con unas tijeras. Presione suavemente la superficie exterior sobre la superficie de las placas de PDA con antibióticos.
      NOTA: Asegúrese de que los micelios fúngicos de los tegumentos se hayan inoculado a la placa.
    2. Sellar cuidadosamente con parafilm y cultivar en una incubadora a 25 ± 1 °C hasta que los tejidos estén completamente cubiertos por micelio.
    3. Transferir colonias individuales de acuerdo con las propiedades fenotípicas (color, forma) a un nuevo PDA con antibióticos para cultivo a 25 ± 1 °C.
    4. Repita el paso 1.4.3 dos o tres veces en PDA con antibióticos hasta que las colonias puras se aíslen por separado.
      NOTA: Si crecen varias cepas de hongos en las placas originales, elija el micelio con precisión para facilitar la clasificación de más especies de hongos.
  5. Almacenamiento de los aislados fúngicos
    1. Transfiera bloques de agar (~5 mm de diámetro) de las colonias a nuevas placas de PDA.
    2. Cultivo en incubadora a 25 ± 1 °C durante 1-2 semanas.
    3. Coloque en un refrigerador a 4 ° C para almacenamiento diario para uso posterior.
    4. Inocular cepas fúngicas en 50 mL de PDB estéril en un matraz de 250 mL, agitando a 180 rpm/min a 25 °C durante 5-7 días.
    5. Coseche 1 mL del micelio fúngico recién cultivado y suspenda en 1 mL de glicerol esterilizado al 20% en tubos de congelación estériles de 2 mL (la concentración final de glicerol es del 10%).
    6. Selle los tubos con parafilm y preenfríelos a -20 °C y -40 °C. A continuación, mantenga los tubos a -80 °C como culatas.

2. Identificación molecular y morfológica de aislados fúngicos

  1. Extracción de ADN genómico fúngico
    1. Cultivo de hongos en PDB como se describe en el paso 1.5.4.
    2. Recoja el micelio y fíltralo para separarlo de la PDB. Homogeneizar en nitrógeno líquido mediante un mortero preenfriado.
    3. Extraiga el ADN genómico utilizando el kit de aislamiento de ADN genómico de hongos de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales).
  2. Amplificación por PCR y secuenciación de ADN
    1. Prepare la mezcla de reacción de PCR de la siguiente manera: 25 μL de ADN polimerasa Taq, 1 μL de plantilla, 2 μL de cebadores directos e inversos y ddH2O a un volumen total de 50 μL.
    2. Amplificar la región ADNr-ITS de la muestra de ADN utilizando los pares de cebadores ITS1 e ITS434 (véase el cuadro 1) con el siguiente procedimiento: desnaturalización inicial a 95 °C durante 4 min, seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 60 s, recocido a 58 °C durante 60 s, elongación a 72 °C durante 2 min, y una elongación final a 72 °C durante 10 min.
    3. Electroforesis de productos amplificados utilizando gel de agarosa al 1,5% a 100 V, 100 mA.
    4. Secuenciar la PCR.
    5. Alinee la secuencia con Clustal X2.0 y MEGA 6.0.
      NOTA: Durante la alineación de secuencia, se excluyen los sitios con alineación ambigua y los huecos se tratan como datos faltantes.
    6. Compare la secuencia obtenida con las de la base de datos de secuencias ITS en GenBank utilizando BLAST en el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Identificar la información preliminar de la especie de cepa fúngica.
  3. Identificación morfológica
    1. Utilice una cámara para capturar la morfología pura de la colonia de hongos maduros tanto en el anverso como en el reverso de las placas PDA.
    2. Arrancar conidios de las colonias fúngicas de cultivo puro con una aguja de inoculación y transferirlos a un portaobjetos de vidrio con una gota de agua estéril.
    3. Sostenga el cubreobjetos y colóquelo lentamente en un ángulo de ~ 45 °, de modo que el cubreobjetos pueda cubrir el espécimen sin burbujas.
    4. Corte un bloque de agar de 5 mm2 con un bisturí de las colonias en el borde de la colonia de hongos y transfiéralo a un portaobjetos de vidrio limpio con una gota de agua estéril. Separe cuidadosamente los hongos con una aguja fina para ver estructuras específicas.
    5. Repita el paso 2.3.3.
    6. Observe el morfología asexual de los hongos bajo un microscopio óptico (OM), incluida la forma, la transparencia y la postura de las hifas, los conidióforos, los fiálidos y los conidios. Registre y mida la forma y el tamaño de las características asexuales para distinguir los diferentes aislados de hongos entre sí.
      NOTA: Para maximizar la capacidad de observar estructuras fúngicas, use tinciones y medio de montaje35.

3. Inducción de los síntomas de infección fúngica en M. alternatus para observar sus fenotipos de comportamiento

  1. Preparación de la suspensión de conidios
    1. Preparar 0,01% Tween-80 con agua pura y esterilizarlo en autoclave durante 25 min a 121 °C. Úselo después de enfriar.
    2. Agregue una cantidad adecuada de perlas de vidrio pequeñas estériles y una solución de Tween-80 al 0,01% en un tubo de centrífuga de 2 ml.
    3. Raspe las colonias de hongos en el tubo y agítelo lo suficiente con un agitador de vórtice hasta que la colonia se rompa. Filtrar a través de dos capas de gasa para eliminar el micelio.
      NOTA: La agitación se realiza para asegurar la suspensión de la conidiospora en la solución de Tween-80 al 0,01%.
    4. Cuente el número de esporas bajo la MO con un hemocitómetro, ajuste a 1 × 108 conidial/mL con Tween-80 estéril al 0,01% y manténgalo a 4 °C para su uso.
  2. Preparación de escarabajos
    1. Esterilizar las ramitas de pino en autoclave (aproximadamente del mismo tamaño) y secarlas en el horno (~ 60 °C).
    2. Mantener la M. recolectada en el campo. alternatus adultos con ramitas de pino en incubadora a 25 ± 1 °C.
    3. Prive a los escarabajos de su presencia durante 24 horas y esterilice la superficie de los escarabajos con lejía, etanol y agua destilada [10:10:80 (v:v)] antes de usarlos.
  3. Inducción de la infección fúngica
    1. Trabaje debajo de un banco limpio, sumerja las ramitas de pino en la suspensión conidial durante 10 s y séquelas al aire.
    2. Sumerja los escarabajos en suspensión conidial durante 10 s, luego transfiéralos a tubos estériles de 50 ml (un escarabajo y una ramita por tubo). Reemplace las ramitas por otras nuevas cada 2 días.
    3. Para el control negativo, cambie la suspensión conidial por una solución estéril de Tween-80 al 0,01%. Haga cinco réplicas para cada cepa de hongo y grupo de control.
    4. Evalúe la actividad de los escarabajos en función de la cantidad de excremento producido en las ramitas de pino. Cuando deje de alimentarse, considérelos muertos.
    5. Transfiera los escarabajos muertos a nuevos tubos estériles de 50 ml y coloque un trozo de algodón húmedo estéril. Incubar a 25 ± 1 °C.
      NOTA: El algodón húmedo se utiliza para mantener la humedad, ya que el crecimiento de hongos requiere una humedad adecuada, pero no demasiada.
    6. Observe y fotografíe el cambio de la superficie del escarabajo a la misma hora todos los días.
  4. Reaislamiento y confirmación de especies fúngicas
    1. Hasta que aparezcan fenotipos claros de infección fúngica en la superficie de los escarabajos, recoja el micelio de diferentes tejidos individualmente en nuevas placas de PDA.
    2. Cultivar a 25 ± 1 °C y observar para asegurar que la morfología es consistente con la de los hongos inoculados.
  5. Tratamiento del escarabajo modelo
    1. Repita los pasos 3.2.1-3.3.6 en el escarabajo modelo Tribolium castaneum, utilizando salvado de trigo como alimento, y esterilice el salvado de trigo con luz ultravioleta.
    2. Toque ligeramente los escarabajos con pinzas estériles. Asume que están muertos si no hay respuesta.

4. Confirmar los fenotipos de infección de hongos en M. alternatus y escarabajo modelo

  1. Preparación de la muestra para la observación
    1. Diseccionar el M infectado. alterna los cadáveres cuidadosamente como en el paso 1.3.
    2. Escoge T. Cuerpos de castaneum con síntomas evidentes de infección fúngica.
    3. Corte tapones de disco de 5 mm de cuatro colonias de hongos maduros que crecen en PDA.
  2. Pretratamiento de la muestra
    1. Coloque los tapones, los tejidos de escarabajos infectados y los cuerpos en glutaraldehído preenfriado al 2,5% a 4 °C durante 2 días.
    2. Lave las muestras tres veces en tampón de fosfato al 0,1% (pH 7,2-7,4) durante 5 minutos y deshidrate en etanol al 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% durante 10 minutos.
    3. Seque las muestras en un liofilizador al vacío.
      NOTA: Todo el proceso de pretratamiento debe ser cuidadoso, incluido el corte, el remojo, la deshidratación, el lavado y el secado, para evitar daños en la muestra.
  3. Observación con microscopía electrónica de barrido (SEM)
    1. Cubra las muestras pretratadas con platino utilizando un recubridor de pulverización catódica y observe bajo un microscopio electrónico de barrido36.
    2. Registrar las características morfológicas de las hifas y conidios que crecen en PDA, M. tejidos alternatus y cuerpos de escarabajos modelo.
    3. Compare si los resultados son coherentes con los de OM en el paso 2.3.

5. Evaluación de la actividad entomopatogénica

  1. Preparación de la suspensión de conidios
    1. La preparación de la suspensión conidial es la misma que en los pasos 3.1.1-3.1.4.
  2. Pretratamiento del escarabajo modelo
    1. Cultiva, alimenta, esteriliza y mata de hambre a T. castaneum como en el paso 3.5.1.
    2. Esterilice el salvado de trigo por UV y coloque el mismo peso en las placas de Petri estériles.
  3. Prueba de actividad entomopatogénica
    1. Trate el salvado de trigo con la suspensión de conidiales y séquelo al aire bajo un banco limpio a temperatura ambiente.
    2. Sumergir T. Escarabajos castaneum en la suspensión conidial durante 10 s y transfiéralos a una placa de Petri (n = 20 en cada placa de Petri). Reemplace el salvado de trigo nuevo con el mismo tratamiento conidial cada 4 días.
    3. Para el control negativo, aplique solo una solución estéril de Tween-80 al 0,01%.
      NOTA: Reserve al menos tres réplicas para cada grupo de tratamiento y el grupo de control.
    4. Cuenta los escarabajos muertos a diario.
      NOTA: Toque ligeramente los escarabajos con pinzas estériles. Asuma que están muertos si hay una falta de respuesta.
  4. Análisis filogenético multigénico
    1. Extraiga el ADN genómico de hongos entomopatógenos como se describe en el paso 2.1.
      NOTA: Se lleva a cabo la identificación multigénica de los EPF parásitos que muestran fenotipos de infección significativos y fuertes actividades entomopatogénicas contra el escarabajo modelo.
    2. Amplificar los siguientes genes, incluida una región que abarca el gen SSU34 ribosómico nuclear, un segmento del gen de ARNr de subunidad grande (LSU37,38), parte del gen del factor de elongación 1-alfa (tef-1α39), las secuencias de la segunda subunidad más grande de la ARN polimerasa ІІ (rpb240) y parte de la β-tubulina41 utilizando los pares de cebadores NS1/NS4, LR7/LROR, EF-983F/EF-2218R, RPB2-5'F/RPB2-5'R y TUB1/TUB22 (ver Tabla 1), respectivamente.
      1. Prepare la mezcla de reacción PCR como en el paso 2.2.1.
      2. Llevar a cabo la amplificación de la siguiente manera: desnaturalización inicial a 95 °C durante 4 min, seguida de 35 ciclos (tef-1α, rpb2, SSU), 38 ciclos (LSU) o 39 ciclos (β-tubulina) de desnaturalización a 94 °C durante 60 s, recocido a 47 °C durante 60 s (LSU), 55 °C durante 60 s (tef-1α), 54 °C durante 40 s (β-tubulina) y 50 °C durante 30 s (rpb2, SSU), elongación a 72 °C durante 1 min, y una elongación final a 72 °C durante 10 min.
    3. Secuenciar y alinear siguiendo los mismos pasos que se muestran en los pasos 2.2.4-2.2.5.
    4. Realizar el análisis filogenético por MEGA 6.0 basado en el método de Máxima Verosimilitud (ML)42.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aislamiento e identificación de aislados fúngicos de M. Alternatus
Con la ayuda de trampas atrayentes, un gran número (aproximadamente 500 escarabajos en total) de M. Se recolectaron alternatus en cinco regiones geográficas. Se recogieron cadáveres de escarabajos con síntomas típicos de infección por hongos entomopatógenos; Luego, los tegumentos corporales de cada escarabajo se diseccionaron en varias posiciones, como se describe en el paso 1.3 del protocolo. Como ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diferentes poblaciones geográficas de FWB pueden desarrollar interacciones variadas con los hongos entomopatógenos naturales, debido a la adaptación ambiental a largo plazo de las especies de EPF a los factores climáticos locales y a la población genotípica específica del insecto huésped44,45. La expansión de los sitios de muestreo a múltiples regiones de presencia de insectos ayuda a aumentar la posibilidad de adquirir diversas ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta investigación contó con el apoyo del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2021YFC2600100) y la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Zhejiang (LY21C040001).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubos de centrífuga de 1,5 mL, 2 mL BiosharpBS-15-M
10 y micro; L puntas de pipetaSangon BiotechF601216
10 µ L, 20 y micro; L, 100 y micro; L, 200 y micro; L, 1.000 y micro; L pipetasRainin
1.000 y micro; Puntas de pipetaL Sangon BiotechF630102
viales criogénicos de 2 mLCorning430659
20x tampón PBSSangon BiotechB548117-0500
200 µ Puntas de pipetaL Sangon BiotechF601227
fabricante de 2.000 bpTaKaRarSD0531
Tubos de 50 mLNest602052
solución de glutaraldehído al 50%Sangon BiotechG916054
50x Tampón TAESangon BiotechB548101
6x tampón de cargaTaKaRarSD0503
AgarosaSangon BiotechA610013
etanol anhidroJkchemicalLB10V37
Bioquímica Gabinete de cultivoShanghaiyihengLRH-250F
CloroformoJuhua61553
Trampas comerciales para escarabajosFEIMENGDIBF-8 www.yinyouji.com
Generador de imágenes en gelBio-RadGelDoc XR+
GlicerolSangon BiotechA600232
Centrífuga refrigerada de alta velocidadSigmaD-37520
Olla de esterilización por vapor a alta presiónMettler ToledoJA5003
Alcohol isopropílicoReactivo generalG75885B
Colorante de ácido nucleicoSangon BiotechA616696
Microscopio óptico, OMLeicaDM2000
ParafilmParafilmPM996
Medidor de PCRFuerza de curaciónTrident960
Penicilina GMarklinGB15743
Agar patata dextrosa, PDAOxoidCM0139
Caldo de patata dextrosa, PDBSolarbioP9240
ImprimacionesSangon Biotech/
PrimersTaq TaKaRarRR902A
Kit de aislamiento de ADN genómico rápido de hongosSangon Biotech Microscopio
, SEMHitachiS-3400N
EstreptomicinaMarklinS6153
TetraciclinaMarklinT829835
Tween-80MarklinT6336
Liofilizador al vacíoYamatoDC801
Agitador de vórticeHLDWH-861
β-MercaptoetanolMarklinM6230
electrónico de barrido B518229

References

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  1. Hajek, A. E., Bauer, L. S. Microbial control of wood-boring insects attacking forest and shade trees. Field Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. 10, 505-525 (2007).
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