Aislamiento, identificación conductual y evaluación de la patogenicidad de hongos entomopatógenos de un barrenador forestal

Summary

En este trabajo se presenta un protocolo para la obtención de hongos entomopatógenos a partir de un barrenador forestal de la madera y una forma sustitutiva de evaluar sus actividades entomopatógenas utilizando un insecto modelo de coleóptero. Este método es eficiente y conveniente para explorar recursos fúngicos entomopatógenos de plagas de insectos perforadores de madera en bosques naturales.

Abstract

Los barrenadores forestales de la madera causan graves daños a los árboles y pérdidas económicas en todo el mundo. La liberación de hongos entomopatógenos (EPF) durante el período de emergencia de FWB se considera una alternativa aceptable al control químico. Sin embargo, los recursos de EPF se han explorado significativamente menos para los FWB, en contraste con las plagas de insectos agrícolas. Este artículo presenta un protocolo para explorar los recursos de EPF de los FWB utilizando como ejemplo las poblaciones silvestres de Monochamus alternatus . En este protocolo, la asignación de trampas cebadas con M. Los atrayentes alternados a diferentes poblaciones garantizaron la recolección de muestras adecuadas con síntomas de infección natural, durante los períodos de emergencia del escarabajo. Después de una disección fina de tegumentos y su colocación en un medio selectivo, se aislaron especies fúngicas de cada parte de los cuerpos de los escarabajos y se identificaron en función de los rasgos moleculares y morfológicos.

Varias especies de hongos fueron certificadas como EPF parásitas a través de la reinfección de M. alternatus sano con suspensiones de esporas. Sus fenotipos de comportamiento en M. alternatus se observaron mediante microscopía electrónica de barrido y se compararon con los del insecto modelo de coleóptero Tribolium castaneum. Para los EPFs que presentan fenotipos de parasitismo consistentes en ambas especies de escarabajos, la evaluación de sus actividades sobre T. castaneum proporcionó información valiosa sobre la letalidad para futuros estudios sobre M. alternatus. Este protocolo ayudó al descubrimiento de EPF recientemente reportado sobre poblaciones de M. alternatus en China, que podría aplicarse como un enfoque eficiente para explorar más recursos de EPF de otros FWB.

Introduction

La devastación causada por las plagas de insectos ha provocado grandes pérdidas ecológicas y económicas tanto en los ecosistemas forestales como en los agrícolas. La mayoría de las plagas agrícolas se exponen a enemigos naturales o agentes de control artificiales mientras dañan las plantas hospederas. En cambio, los barrenadores de la madera forestal (FWB, por sus siglas en inglés) casi completan todos sus ciclos de desarrollo dentro de los troncos de los árboles huéspedes¹, lo que plantea grandes desafíos para explorar organismos de control biológico eficientes de FWB en el campo silvestre. Lo que es aún peor ....

Protocol

1. Aislamiento de hongos de M. alternatus (Figura 1)

1. Recoge la muestra del escarabajo
   1. Recoge los pinos escarabajos aserradores M. alternatus utilizando trampas comerciales (ver Tabla de Materiales) cebadas con atrayentes antes de los períodos de emergencia previstos de las poblaciones de escarabajos en bosques de pinos naturalmente infectados.
      NOTA: En este estudio, se recolectaron escarabajos de cinco regiones geográficas del sur de China (Huzhou / Zhejiang, Liangshan / Sichuan, Xiamen / Fujian, Shaogan / G....

Results

Aislamiento e identificación de aislados fúngicos de M. Alternatus
Con la ayuda de trampas atrayentes, un gran número (aproximadamente 500 escarabajos en total) de M. Se recolectaron alternatus en cinco regiones geográficas. Se recogieron cadáveres de escarabajos con síntomas típicos de infección por hongos entomopatógenos; Luego, los tegumentos corporales de cada escarabajo se diseccionaron en varias posiciones, como se describe en el paso 1.3 del protocolo. Como .......

Discussion

Diferentes poblaciones geográficas de FWB pueden desarrollar interacciones variadas con los hongos entomopatógenos naturales, debido a la adaptación ambiental a largo plazo de las especies de EPF a los factores climáticos locales y a la población genotípica específica del insecto huésped^44,45. La expansión de los sitios de muestreo a múltiples regiones de presencia de insectos ayuda a aumentar la posibilidad de adquirir diversas .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de centrífuga de 1,5 mL, 2 mL Biosharp		BS-15-M
10 y micro; L puntas de pipeta	Sangon Biotech	F601216
10 µ L, 20 y micro; L, 100 y micro; L, 200 y micro; L, 1.000 y micro; L pipetas	Rainin
1.000 y micro; Puntas de pipeta	L Sangon Biotech	F630102
viales criogénicos de 2 mL	Corning	430659
20x tampón PBS	Sangon Biotech	B548117-0500
200 µ Puntas de pipeta	L Sangon Biotech	F601227
fabricante de 2.000 bp	TaKaRar	SD0531
Tubos de 50 mL	Nest	602052
solución de glutaraldehído al 50%	Sangon Biotech	G916054
50x Tampón TAE	Sangon Biotech	B548101
6x tampón de carga	TaKaRar	SD0503
Agarosa	Sangon Biotech	A610013
etanol anhidro	Jkchemical	LB10V37
Bioquímica Gabinete de cultivo	Shanghaiyiheng	LRH-250F
Cloroformo	Juhua	61553
Trampas comerciales para escarabajos	FEIMENGDI	BF-8 www.yinyouji.com
Generador de imágenes en gel	Bio-Rad	GelDoc XR+
Glicerol	Sangon Biotech	A600232
Centrífuga refrigerada de alta velocidad	Sigma	D-37520
Olla de esterilización por vapor a alta presión	Mettler Toledo	JA5003
Alcohol isopropílico	Reactivo general	G75885B
Colorante de ácido nucleico	Sangon Biotech	A616696
Microscopio óptico, OM	Leica	DM2000
Parafilm	Parafilm	PM996
Medidor de PCR	Fuerza de curación	Trident960
Penicilina G	Marklin	GB15743
Agar patata dextrosa, PDA	Oxoid	CM0139
Caldo de patata dextrosa, PDB	Solarbio	P9240
Imprimaciones	Sangon Biotech	/
Primers	Taq TaKaRar	RR902A
Kit de aislamiento de ADN genómico rápido de hongos	Sangon Biotech Microscopio
, SEM	Hitachi	S-3400N
Estreptomicina	Marklin	S6153
Tetraciclina	Marklin	T829835
Tween-80	Marklin	T6336
Liofilizador al vacío	Yamato	DC801
Agitador de vórtice	HLD	WH-861
β-Mercaptoetanol	Marklin	M6230