Citometría de flujo por imágenes para estudiar la autoagregación microbiana

Summary

Este protocolo describe un enfoque cuantitativo para medir la autoagregación microbiana mediante citometría de flujo por imágenes.

Abstract

Las bacterias beneficiosas y probióticas desempeñan un papel esencial en sus huéspedes, proporcionando diversos beneficios para la salud, incluida la inmunidad a las enfermedades infecciosas. La familia Lactobacillaceae está formada por bacterias grampositivas con propiedades probióticas confirmadas. Este estudio utiliza especies de Lactobacillaceae como modelo para demostrar la efectividad del análisis de alto rendimiento de una sola célula en el estudio de la agregación celular. El objetivo es analizar la respuesta de estas especies beneficiosas a los hidratos de carbono simples de la dieta.

El estudio muestra cómo la citometría de flujo por imágenes (IFC) puede superar las diferencias fundamentales en el ensamblaje de bacterias probióticas en presencia y ausencia de carbohidratos. IFC combina la potencia y la velocidad de la citometría de flujo convencional con la resolución espacial de la microscopía, lo que permite mediciones morfométricas complejas de alta velocidad de una manera fenotípicamente definida en una biblioteca de cepas y condiciones bacterianas beneficiosas. Este protocolo proporciona información sobre la autoagregación de las especies de Lactobacillaceae y arroja luz sobre su respuesta a los carbohidratos de la dieta, lo que contribuye a comprender los mecanismos detrás de los efectos beneficiosos de estas bacterias probióticas.

Introduction

La autoagregación bacteriana se considera un paso primordial en la formación de biopelículas. En este proceso (a veces también llamado autoaglutinación o floculación), las bacterias del mismo tipo forman grupos multicelulares que eventualmente se asientan en el fondo de los tubos de cultivo o se adhieren a su tejido^{o superficie objetivo}.

La autoagregación es un fenómeno ampliamente observado y se ha demostrado hasta ahora en patógenos gramnegativos como el patógeno oportunista Acinetobacter baumannii², el patógeno dental Aggregobacter actinomycetemcomitans^3<....

Protocol

El archivo .ast, con la plantilla para Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) como ejemplo, se proporciona en el Archivo de codificación suplementaria 1.

1. Preparación de los medios

1. Prepare el caldo Lactobacili MRS siguiendo las instrucciones del fabricante (55 g en 1 L de agua desionizada) y las placas de agar Lactobacilli MRS con agar al 1,5% (p/v) (ver Tabla de Materiales). Después de la esterilización en autoclave, el medio está listo para usar directamente o se puede almacenar a 4 °C.
2. Preparar caldo de soja tríptico al 50% (15 g en 1 L de agua desionizada) ....

Results

Los resultados demuestran que este método puede medir fácilmente las diferencias en la autoagregación en respuesta a los azúcares de la dieta en las bacterias BAL. Al separar los individuos de los agregados, el método permite calcular el porcentaje de la población de los eventos de agregación de todos los eventos en respuesta a azúcares fermentables o no fermentables de la dieta. Además, fue posible medir si existen diferencias en el tamaño medio de la población agregada entre tratamientos.

La.......

Discussion

La citometría de flujo es un método ampliamente utilizado para cuantificar las intensidades de fluorescencia en las células eucariotas, pero es posible que no proporcione mediciones precisas para las células bacterianas debido a su mayor tamaño o pequeños agregados. Estos factores pueden tener un impacto significativo en la cuantificación precisa de la autoagregación y el nivel basal de formación de agregados en diferentes condiciones. Para abordar esto, se empleó la citometría de flujo por imágenes (IFC) para obtener un.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de cultivo de 14 mL Falcon		352051
tubo de centrífuga de 15 mL	Falcon	352096
Bacto Agar	Baeton,Dickinson and Company	214010
Bacto Typtic Caldo de soja	Baeton,Dickinson and Company	211825
D-(+)-Glucosa	Sigma	G7021-1KG
D-(+)-Rafinosa pentahidrato	Sigma	83400-25G
Difco Lactobacilos MRS caldo	Baeton,Dickinson and Company	288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)	FL medical	23053
IDEAS Software	Amnis/EMD Millipore	N/A	Detalles disponibles en: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/A	Detalles disponibles en:
https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F MOPS, ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico	Biorreactivos Fisher	BP308-500
Fosfato de potasio dibásico	Fisher Scientific, 174,18 g/mol	BP363-1
Fosfato de potasio monobásico	Sigma, 136,09 g/mol	P0662-500G