Artículo de método

Una herramienta para crear automáticamente espacios libres de células estables y reproducibles para mejorar la fiabilidad del ensayo de cicatrización de heridas celulares

DOI:

10.3791/65794

⸱

4 de octubre de 2024

 ,  ,  , 
1Faculty of Art and Communication, Kunming University of Science and Technology, 2The School of Integrated Chinese and Western Clinical Medicine, Anhui University of Chinese Medicine, 3School of Industrial Design, Hubei University of Technology

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A través de la incorporación del diseño de la experiencia de interacción y el análisis de los requisitos del usuario, presentamos un innovador raspador celular que mejora los ensayos de curación de heridas celulares en términos de reproducibilidad, confiabilidad, practicidad, integridad celular y experiencia del usuario.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fiabilidad de la medición de la migración celular en los ensayos de cicatrización de heridas se ve frecuentemente socavada por la inestabilidad metodológica prevalente, es decir, el método basado en puntas. Presentamos un instrumento innovador diseñado para abordar estas limitaciones. Nuestro novedoso raspador de células supera el enfoque actual, generando un espacio libre de células más consistente y estable. Experimentos biológicos repetidos revelan que el espacio libre de células producido por el raspador de células exhibe bordes más rectos y tamaño y forma uniformes en comparación con la técnica basada en la punta (p < 0.05). En cuanto al diseño del producto, el rascador de células cuenta con una combinación de colores refinada adecuada para entornos de laboratorio, lo que mejora el seguimiento de los resultados experimentales y permite la esterilización mediante autoclave para su reutilización. En particular, después del tratamiento, el raspador celular demuestra un efecto insignificante sobre la viabilidad y proliferación celular (97,31% y 24,41%, respectivamente). Por el contrario, el método basado en puntas produce una menor viabilidad celular (91,37%) y proliferación (18,79%). Esta investigación presenta el raspador celular como un dispositivo novedoso y reutilizable capaz de generar brechas libres de células reproducibles al tiempo que preserva la viabilidad celular, aumentando así la fiabilidad de los ensayos de cicatrización de heridas en comparación con las técnicas existentes.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los tumores se caracterizan por características distintivas, como las ventajas de crecimiento selectivo, el recableado metabólico y la modulación inmunitaria, todo lo cual contribuye intrigantemente a mejorar la migración celular, un comportamiento maligno crítico de las células tumorales. Esta característica afecta directamente a la metástasis a distancia del tumor primario, comprometiendo la supervivencia a largo plazo de los pacientes 1,2,3. Las ventajas del crecimiento selectivo permiten que las células cancerosas superen a las células normales, mientras que el recableado metabólico apoya esta rápida proliferación al alterar las vías de energía. Al mismo tiempo, la modulación inmunitaria permite a los tumores evadir las defensas del organismo. Los estudios subrayan la gravedad de este problema, mostrando que la metástasis pulmonar, a menudo como resultado de una mayor migración celular, es un evento terminal que conduce a la muerte de pacientes con varios cánceres4. Por ejemplo, los cánceres de mama5, carcinoma de cuello uterino4 y osteosarcoma6 representan el 20%, 9% y 30% de estos casos, respectivamente. Por lo tanto, la evaluación de la migración de células tumorales se ha convertido en una parte integral de la investigación oncológica actual, lo que destaca aún más la naturaleza multifacética de la progresión tumoral.

El ensayo de cicatrización de heridas celulares es un método fácil de usar para medir la migración celular in vitro , a menudo empleado en estudios oncológicos7. La mayoría de los experimentadores utilizan puntas de pipeta para crear heridas celulares manualmente8. Aunque este método podría formar heridas celulares de forma rápida y cómoda, todavía tiene muchas limitaciones que afectan a la reproducibilidad y la precisión para evaluar la migración celular. En primer lugar, el uso manual de puntas de pipeta para crear arañazos está muy influenciado por el ángulo de operación, la fuerza y la velocidad del operador, lo que afecta la repetibilidad del método8. En segundo lugar, los defectos celulares generados por la punta suelen tener bordes dentados en lugar de bordes rectos porque las puntas de pipeta son productos de plástico con cierta elasticidad9. Algunos estudios generan heridas colocando insertos de cultivo prefabricados directamente en la placa de cultivo celular para restringir el rango de proliferación celular10. Este enfoque elude las limitaciones del método basado en puntas, como los bordes irregulares y la reproducibilidad. Sin embargo, incluso con materiales biocompatibles, la coexistencia a largo plazo de la incrustación con las células sigue afectando el crecimiento celular11. Además, la inclusión también puede causar cambios epigenéticos celulares en la zona marginal debido a la restricción de contacto12. Además, los insertos de contacto producidos a partir de materiales biocompatibles son caros y difíciles de reutilizar, lo que limita su viabilidad13. Por lo tanto, se necesita una herramienta novedosa, reproducible y práctica para cuantificar fácilmente la migración celular in vitro .

El objetivo principal de este método es introducir una herramienta innovadora para cuantificar la migración celular in vitro en estudios oncológicos, abordando las limitaciones de las técnicas existentes y mejorando la reproducibilidad y la precisión en la evaluación de la migración celular.

La razón detrás del desarrollo de esta técnica radica en la importancia crítica de evaluar la migración de células tumorales en oncología. Los tumores exhiben características distintivas, que incluyen ventajas de crecimiento selectivo, recableado metabólico y modulación inmunitaria, todo lo cual contribuye a mejorar la migración celular, un aspecto fundamental de la malignidad del cáncer. Este método tiene como objetivo proporcionar un medio más confiable para estudiar la migración celular, contribuyendo a una comprensión más profunda del comportamiento tumoral.

Este método ofrece ventajas sustanciales sobre las técnicas existentes. Los ensayos de rascado manual pueden sufrir interferencias dependientes del operador, mientras que los insertos de cultivo pueden afectar el crecimiento celular y la expresión génica. Por el contrario, este método ofrece una repetibilidad, precisión y practicidad mejoradas, lo que representa una solución rentable para medir la migración celular in vitro en la investigación oncológica. Aborda la necesidad crucial de contar con una herramienta fiable y accesible para estudiar la migración celular en varios tipos de cáncer, lo que la convierte en una valiosa adición al campo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los participantes dieron su consentimiento informado completo y por escrito. La aprobación ética no fue aplicable ya que no se incluyeron muestras de tejido animal o humano en el presente estudio.

1. Investigar los requisitos de la comunidad de usuarios

  1. Entregar cuestionarios a los biólogos/experimentadores que trabajan en ensayos de cicatrización de heridas celulares. Recoja los cuestionarios completados y utilícelos para el estudio. Para este estudio, del 12 de octubre de 2021 al 3 de febrero de 2022, se entregaron 100 cuestionarios a 100 biólogos. El porcentaje de respuesta fue del 97%.
  2. Pida a los encuestados que respondan a preguntas como: ¿cuál de los experimentos de rascado de células le molestó más? ¿Y qué herramienta se utilizó para realizar el rascado de la celda? Siga estas preguntas con subpreguntas para rastrear las causas.
  3. Investigar las percepciones de los experimentalistas sobre herramientas como las puntas de pipeta y los insertos de cultivo celular en experimentos de cicatrización de heridas celulares. Comprender y recoger sus razones para seleccionar una herramienta en lugar de otra, utilizando la teoría de la cadena medios-fin basada en técnicas de escalonamiento en la sección14,15 de los cuestionarios.
    NOTA: El método de escalera se divide en dos tipos: el método de escalera blanda con entrevistas en profundidad y el método de escalera dura con cuestionarios o cuestionarios de papel y lápiz16. El método de escalonamiento duro fue la técnica principal utilizada en este estudio. La teoría de la cadena medios-fin sugiere que el conocimiento explícito que poseen los usuarios objetivo es superficial y concreto, mientras que el conocimiento tácito es profundo y abstracto 17,18,19.

2. Diseño y modelado tridimensional

  1. Dibuje un boceto a partir de las ideas recopiladas en la encuesta del cuestionario anterior e inicie el proceso de diseño. Utilice este boceto preliminar como plano fundamental.
    1. Explique las dimensiones y el diseño de cada componente aplicando las funciones Dim, DimRadius y DimDiameter en el software de modelado.
    2. Realice mediciones con el calibrador vernier con una precisión de 0,02 mm en placas reales de 6 pocillos para determinar las dimensiones finales del raspador de celdas. Confirme que tienen 42,1 mm de largo, 42,1 mm de ancho y 18,5 mm de alto. Preste atención a los detalles en la fase de diseño, especialmente la altura del producto y la aptitud en el pozo, para facilitar un montaje más suave.
  2. Construya un modelo tridimensional y renderícelo.
    1. Comience el diseño 3D en un software mediante la creación de un modelo básico. Haga clic en botones como ExtrudeCrv para estirar y Loft para dar forma al diseño. Defina el modelo y, a continuación, haga clic en FilletEdge para suavizar los bordes.
      NOTA: Otros botones de función utilizados incluyen, Líneas - Para dibujar segmentos de línea recta, Polilíneas - Para crear líneas continuas compuestas por múltiples segmentos, Rectángulos - Para dibujar formas rectangulares, Círculos - Para dibujar formas circulares, Arcos - Para dibujar formas de arco o elípticas, Puntos - Para colocar marcadores de un solo punto, Texto - Para agregar etiquetas de texto, Dimensiones - Para agregar dimensiones medidas a modelos, Array - Para crear patrones copiados de objetos, Rotar - Para rotar objetos a los ángulos deseados, Mover - Para mover objetos a nuevas ubicaciones, Escala - Para cambiar el tamaño de objetos más grandes o más pequeños, Recortar/Extender - Para recortar o extender objetos para que se encuentren con otra geometría, Unión/Diferencia/Intersección booleana - Para combinar, restar o encontrar la intersección de objetos, Capas - Para organizar objetos en diferentes capas, Renderizar: para generar vistas renderizadas con materiales e iluminación, y Exportar: para exportar la geometría del modelo a otros formatos de archivo.
    2. Importe el modelo en un software de renderizado 3D. Aplica materiales como plástico, esponja y acero, y luego ajusta la iluminación para obtener una representación realista.
      NOTA: Una lista generalizada de botones de función incluye: Arrastrar y soltar : para aplicar materiales directamente a piezas o modelos arrastrando un material de la biblioteca y soltándolo en el componente deseado en la vista en tiempo real, Clic derecho : al hacer clic con el botón derecho en un material de la biblioteca, normalmente verá opciones para: Aplicar a la selección : aplicar el material a una pieza seleccionada en la vista en tiempo real. Editar material : ajuste las propiedades del material. Propiedades del material (después de seleccionar un material): para acceder y modificar propiedades específicas del material, como el color, la rugosidad, el índice de refracción y otros atributos. Barra de búsqueda: para encontrar rápidamente un material en la biblioteca escribiendo su nombre o palabras clave asociadas. Categorías/Carpetas : para navegar a través de diferentes categorías o carpetas de materiales como metales, plásticos, vidrio, etc. Agregar a favoritos : para marcar ciertos materiales como favoritos para facilitar el acceso durante sesiones futuras. Teclas de acceso rápido : se puede acceder a algunas operaciones a través de teclas de acceso rápido. Por ejemplo, M suele ser la tecla de acceso rápido para mostrar rápidamente las propiedades del material de una pieza seleccionada.
    3. Por último, mejore el contraste (+56) y la saturación de la imagen (Intensidad +19, Saturación +7) en el software de fotografía y diseño, y añada elementos de fondo (información de texto y color de blanco a gris claro) para el contexto y garantizar una representación del producto realista y de alta calidad.
      1. Utilice Ajustes de > de imagen, Brillo/Contraste para ajustar el contraste de una imagen. Utilice Imagen > Tono/Saturación para modificar el nivel de saturación de la imagen. Utilice la herramienta Texto (icono T) para agregar información de texto a la imagen.
        NOTA: Una lista generalizada de botones de función incluye la herramienta Elipse (U) - Para dibujar puntos/círculos. Configure la herramienta para dibujar una forma, elija el color de relleno que desee y, a continuación, haga clic y arrastre (manteniendo pulsada la tecla Mayús para mantener un círculo perfecto) para crear un punto. Herramienta Línea (U) - Para dibujar líneas rectas en la imagen. Seleccione la herramienta, establezca el ancho de línea deseado y, a continuación, haga clic y arrastre para dibujar una línea. Herramienta Pincel (B) - Una forma alternativa de dibujar puntos y líneas. Selecciona el tamaño y la forma del pincel y, a continuación, haz clic (para puntos) o haz clic y arrastra (para líneas).
  3. Después de completar el modelo tridimensional, proceda a producir el raspador de celdas mediante el método de molienda y ensamblaje 20,21,22.

3. Producción

  1. Emplear la teoría de color, materiales y acabado (CMF) en el presente estudio para diseñar los prototipos del raspador de celdas. La teoría CMF sirve como metodología de diseño en la investigación científica. Mejora la usabilidad del producto, moldea la percepción del usuario y dirige la selección de materiales 23,24,25.
    1. Seleccione los colores que se utilizarán en el raspador de celdas del sistema de color estándar, incluidos Negro 6 C, Gris frío 6 C y 11-0601TPG26,27.
    2. Para construir el raspador de celdas que cumpla con los estándares de laboratorio, elija los materiales adecuados, incluidos el polipropileno (PP), la esponja y el acero con alto contenido de carbono. Para la fabricación de prototipos físicos, comience empleando una impresora 3D para producir el marco estructural. Posteriormente, utilice conectores o agentes adhesivos para completar el ensamblaje del raspador.
      NOTA: Para preparar el producto físico del raspador de celdas, muela y ensamble los materiales necesarios. Se deben seguir los protocolos de seguridad a lo largo de todo el proceso para garantizar un producto final seguro y eficaz.
    3. Continúe con el proceso de acabado, que puede implicar corte, esmerilado, pulido, estampado u otras técnicas. Comience lijando el modelo con un papel de lija de grano medio de 120 para eliminar los bordes ásperos.
    4. Siga esto con un papel de lija de grano fino de 220 para lograr una superficie lisa.
    5. Lijado posterior para alisar las superficies, asegurando que los conectores enchufables o incorporados coincidan correctamente.
    6. Únase la corredera I y II de forma segura utilizando los conectores (varillas fijas) para garantizar un montaje robusto y duradero del rascador de celdas. Logre la forma fija final del raspador de celdas a través de una combinación de fijación mecánica y unión adhesiva. Utilice sujetadores, específicamente una estructura de mortaja y espiga, para asegurar las piezas juntas a través de la fuerza mecánica. Además, para mejorar la resistencia del ensamblaje, aplique adhesivo (pegamento) para unir aún más los componentes.
    7. Esteriliza el rascador en autoclave a 121,3 °C durante 30 minutos para garantizar que conserva su forma y propiedades físicas originales.

4. Cultivo celular

  1. Cultive células HOS en un medio esencial mínimo suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina. Cultivarlos a 37 °C con 5% de CO2.
  2. Cambie el medio de cultivo cada 2 días.
  3. Cuando el crecimiento celular supere el 80% de confluencia, añadir 1 mL de tripsina con 0,25% de EDTA y digerir durante 60 s. A continuación, centrifugar las células a 300 x g durante 5 min para el subcultivo. Retire el sobrenadante y agregue el medio de cultivo para obtener una concentración final de 5 x 104 células por pocillo. Utilice un contador de celdas automatizado para contar celdas.

5. Evaluación del potencial de herida celular del raspador celular y método basado en puntas

  1. Prepare todos los materiales para herir y esterilícelos con radiación ultravioleta exponiéndolos durante 30 min.
  2. Después de la esterilización, enrolle el 100% de las células HOS confluentes en placas de 6 pocillos a una concentración de 5 x 104 células por pocillo utilizando el método de raspado de células o el método basado en puntas.
    1. Para el método basado en puntas, use una punta de 100 μL y arrástrela a través de la celda que contiene el medio con 1 trazo en la dirección horizontal y el otro en la dirección vertical.
    2. Para el método de raspador de celdas, coloque el prototipo de raspador en uno de los pocillos y con la ayuda de la pinza presione suavemente una vez. Las células están heridas. Lleva a cabo cada experimento de herida por triplicado.
  3. Analice todas las heridas celulares utilizando un sistema de microscopio digital y un software de imágenes.

6. Medición de la viabilidad celular y la proliferación celular

  1. Realice todos los ensayos de viabilidad celular siguiendo el protocolo proporcionado en el kit CCK-8.
  2. Incubar las células con solución de CCK-8 durante 2 h a 37 °C, luego medir su absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas para cuantificar la viabilidad de las células.
  3. Diseñe el ensayo de incorporación de 5-etinil-20-desoxiuridina (EdU) para cuantificar con precisión la duplicación del ADN y cuantificar directamente la relación de proliferación celular. Determinar la influencia de diferentes métodos para generar heridas celulares sobre la proliferación celular mediante el ensayo EdU, siguiendo el protocolo descrito en la publicación anterior28.
  4. Tiña las células y toma imágenes de ellas con un sistema de microscopio digital. Asegúrese de que cada experimento se lleve a cabo por triplicado.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Disección de las demandas de los usuarios de herramientas para generar heridas celulares
El método experimental actual para generar heridas celulares exige una mayor mejora para abordar muchos problemas que comprometen la reproducibilidad biológica, la robustez, el consumo económico y la experiencia del usuario del ensayo de curación de heridas celulares. Utilizamos el método de escalonamiento duro para analizar los requisitos de los usuarios involucrados en experimentos biológicos a través de cuestionarios29 (Figura 1A). La información involucrada en el cuestionario, como los nombres, se anonimizó para proteger su privacidad. Los detalles del cuestionario se muestran en la Tabla 1. Durante 6 semanas de encuesta para 100 individuos, se recibieron 97 cuestionarios completamente completados, se excluyeron 3 cuestionarios sospechosos e inválidos; La tasa de respuesta fue del 97,00%.

Los resultados demuestran que los problemas más preocupantes en el ensayo de cicatrización de heridas celulares fueron el borde dentado (no recto) y la anchura o áreas inestables de las heridas, que representaron el 55,67% y el 29,90%, respectivamente. Estos fueron significativamente más altos que los de menor tasa de crecimiento celular, contaminación celular y otras opciones con 3.09%, 5.15% y 6.19%, respectivamente (p < 0.001, Figura 1B). En cuanto a la selección de herramientas para crear heridas, el uso de puntas de pipeta fue mucho más prevalente que el de insertos de cultivo celular (Figura 1C). Se atribuyó principalmente al hecho de que los insertos de cultivo celular son bastante caros y no reutilizables (Figura 1D), mientras que las puntas de pipeta son baratas, muestran reproducibilidad experimental (6,59%) y viabilidad celular (20,88%, Figura 1E). Es importante destacar que hasta el 69,23% de los usuarios argumentaron que el precio de los insertos de cultivo celular estaba por encima de su presupuesto (Figura 1D). En contraste, solo 6 sujetos eligieron insertos de cultivo celular, en los que solo el 16,67% consideró que su precio era aceptable (Figura 1F). Por último, en cuanto a la innovadora herramienta para generar heridas celulares, el 86,60% de ellos se mostró optimista, mientras que solo menos usuarios se mostraron reacios (4,12%, Figura 1G).

Posteriormente, se diseccionaron las características del producto que los usuarios necesitaban con urgencia 30,31,32. Estas características incluían heridas rectas, ancho y área de heridas estables, alta reproducibilidad y precio aceptable. En consecuencia, se llevaron a cabo actividades de diseño posteriores.

Decisión de diseñar los elementos y materiales utilizados en el desarrollo del raspador de células
Los datos anteriores muestran que los suministros de laboratorio implementados en la investigación biológica de rutina deben ser estrictamente estériles para evitar la contaminación celular33. Por lo tanto, el raspador de células propuesto debe ser estéril. Aunque las herramientas desechables podrían ser esterilizadas con óxido de etileno, el costo experimental aumentará inevitablemente 34,35,36. Por lo tanto, en lugar de materiales desechables, proponemos diseñar el raspador de celdas con un material reutilizable con gran tolerancia a la esterilización por vapor a alta presión (121,3 °C), para reducir el costo y aumentar la flexibilidad cuando se aplica en diferentes casos37. Para cumplir con estos requisitos, el material utilizado para construir el raspador de celdas debe tener ciertas características físicas y químicas, incluida la resistencia al calor, la alta presión y la corrosión por vapor de agua.

Para el uso previsto del raspador de células, además de cumplir con las funciones básicas, como hacer las heridas rectas del borde, también debe tener un diseño y un color atractivos. En términos de modelado, teniendo en cuenta los campos objetivo y de aplicación, el estilo general debe ser agradable para los laboratorios. La apariencia no debe ser demasiado ostentosa para impedir que el personal observe la progresión experimental. Además, su tamaño debe ser adecuado para placas de seis pocillos, y la superficie debe tener una protuberancia para que las pinzas la recojan de manera estable.

El CMF en el diseño es un aspecto crítico del diseño de productos que influye en la estética y la experiencia del usuario. La elección del color influye en la respuesta emocional, la selección del material afecta a la funcionalidad y la sostenibilidad, y el acabado determina la sensación táctil y el atractivo visual. Los diseñadores de CMF armonizan estos elementos, teniendo en cuenta las tendencias del mercado y la identidad de marca, para crear productos que resuenen con los usuarios.

De acuerdo con la teoría CMF, se consideraron tres factores críticos, incluyendo el color, el material y el proceso de acabado, para determinar sus impactos en la función y el efecto visual24. Primero se llevó a cabo la selección del color. En este contexto, el color se refiere al color intrínseco, que es el color inherente de un objeto o sustancia en condiciones de iluminación estándar, desprovisto de la influencia de fuentes de luz externas o reflejos. Dado que la placa de seis pocillos está hecha de PP con una superficie transparente, se eligió el gris oscuro como color intrínseco. Esta elección se hizo para facilitar la identificación y el funcionamiento, ya que el gris oscuro proporciona un contraste y una visibilidad óptimos cuando se superpone con otros colores. Además, es menos probable que el gris oscuro cause distorsión del color cuando se combina con otros colores, lo que también es crucial para la observación. Los componentes funcionales esenciales se distinguieron aún más por el negro (Figura 2A).

El sistema comercial de coincidencia de colores fue seleccionado como el estándar para la selección de colores debido a su amplia aceptación y uso en diversas industrias. Basándose en la capacidad de la empresa para reproducir colores consistentes en diferentes medios, se eligió para el estudio, ya que es crucial para garantizar una representación de color precisa y consistente.

La selección del material se realizó con base en los resultados de los cuestionarios antes mencionados. La carcasa y los componentes del raspador se fabricaron con un plástico resistente al calor, el polipropileno (PP), para cumplir con los requisitos de esterilización mediante autoclave, como se muestra en la Figura 2B. El acero con alto contenido de carbono es adecuado para resortes, ya que es estable contra entornos de laboratorio resistentes a la corrosión y altas y bajas temperaturas. Se utilizaron esponjas de alta densidad para amortiguar y se colocaron al final del portaobjetos.

Finalmente, se desarrolló el proceso de acabado. Dado que el raspador de células se utiliza con frecuencia y se contamina fácilmente y la calidad de la superficie afecta a la esterilización, es preferible una superficie lisa y brillante para el raspador de células, ya que ayuda al usuario a identificar rápidamente la fuente de contaminación y a tratarla, dando una sensación de limpieza. Las puntas se lijan parcialmente para evitar daños en el fondo de la placa de cultivo, lo que puede afectar al entorno de cultivo y dar lugar a una restricción de la proliferación celular38.

Diseño y prototipo del rascador de células
A partir de los resultados mencionados anteriormente, se diseñaron tres prototipos de raspador celular (Figura 3A). Los estudios muestran que las heridas celulares más utilizadas dentro de las placas de cultivo celular tenían forma de cruz39, que es bastante diferente del prototipo I que empleaba heridas rectangulares; por lo tanto, el prototipo I había sido eximido (Figura 3A). Aunque los prototipos II y III podían crear áreas libres de células en forma de cruz, el riel deslizante del prototipo II era difícil de fijar en discos de cultivo celular y su infraestructura era bastante complicada (Figura 3A). Después de prudentes discusiones, el prototipo III fue distinguido como el modelo final para producir un raspador de celdas.

En particular, dado que la forma de las puntas podría afectar directamente el área libre de celdas en términos de bordes y tamaños, se diseñaron tres bocetos para la selección. El boceto tenía una parte superior afilada, que podía proporcionar bordes muy rectos; sin embargo, la interfaz de cultivo que permite la proliferación celular podría verse afectada si las puntas son demasiado afiladas (Figura 3B). El boceto II ofrecía una parte superior cuadrada, lo que podría evitar el deterioro de las placas de cultivo celular. Sin embargo, como la superficie de contacto entre la punta y la parte inferior de la placa de cultivo es cuadrada, es inestable cuando se usa (Figura 3B). El boceto III proporcionó una punta redondeada roma, evitando efectivamente los problemas anteriores (Figura 3C). Por lo tanto, se seleccionó como diseño final.

El diseño se optimizó en tres aspectos: el método de fijación del fijador, la esponja de cojín incorporada y la facilidad de agarre, respectivamente. En primer lugar, los métodos de fijación del producto esperados incluían pandeo40, mortaja y espiga41 y pivote42. Teniendo en cuenta el costo real de producción y la operatividad, se diseñó una garra debajo del fijador en forma de cruz para facilitar la sujeción del borde del pozo. Además, en la prueba de cicatrización de arañazos celulares, observamos que las puntas rebotaban después de tocar la pared cerca del final debido a la longitud fija y la dureza de las correderas, lo que afectaba al estado de arañazos. Por lo tanto, añadimos una esponja acolchadora al final de la corredera para estabilizar el movimiento de las puntas. (Figura 3A,C). Por último, se añadió una depresión superficial a la protuberancia para facilitar el agarre de la pinza.

Se construyó un modelo tridimensional utilizando el software de diseño 3D. Su representación se muestra en la Figura 4A. El diagrama explosivo elabora las estructuras internas detalladas del raspador de celdas, que muestra sus características necesarias discutidas anteriormente (Figura 4B). Además, para lograr el objetivo de deslizamiento suave de las puntas y los bordes rectos, se adopta la estructura de transmisión de potencia mecánica interna. Toda la unidad funcional del raspador de células está compuesta por la parte de control. En el trabajo real, la palanca de enlace dentro del raspador de celdas está conectada con el botón superior y el extremo se mueve hacia abajo después de aplicar presión para hacer que el extremo se doble. El resorte dentro de la corredera se libera para empujar las puntas para que se muevan. Finalmente, se detiene en la esponja con una hendidura estrecha para terminar el raspado y luego cambia a reiniciar cuando se usa nuevamente (Figura 5A). Además, la facilidad de aprendizaje y la operación conveniente son los criterios para que un biólogo mida la calidad del producto. Por lo tanto, para el diseño de apariencia del producto, el diseño de la superficie siguió el principio de simetría y pulcritud 43,44, distinguiendo y resaltando diferentes componentes a través de diferentes tonos de colores negro, blanco y gris (Figura 5A).

El raspador de celdas es superior al método de rascado de puntas en uso práctico
El producto físico del raspador de celdas se preparó utilizando el método de molienda y ensamblaje (Figura 5B). Como era de esperar, el raspador de celdas se integró de manera excelente con la placa de seis pocillos, con el soporte superior en forma de cruz encajando estrechamente en el borde de la placa, proporcionando una fuerte fijación (Figura 5C). Además, las puntas se ajustaban con precisión a la parte inferior de la placa de seis pocillos, lo que facilitaba la generación suave de áreas libres de células. Finalmente, el raspador de células se esterilizó en autoclave para probar si podía ser reutilizable. Como se muestra en los resultados de la Figura 5D, el raspador de celdas actual mantuvo la forma y el rendimiento físico originales incluso después de la esterilización en autoclave a menos de 121,3 °C durante 30 minutos.

El raspador de células superó al método de creación de heridas celulares existente en la prueba de referencia. Después de repetidas pruebas, el rascador de células mostró una alta estabilidad y reproducibilidad en la preparación de la herida, presentó una baja fluctuación en el área de cada herida y bordes casi rectos, con una desviación estándar del área libre de células de 483,73 y una desviación a borde recto de 5041,33 ± 2420,00. Por el contrario, el área de cada herida preparada por las puntas de pipeta mostró una mayor fluctuación, con una desviación estándar del área libre de células de 3905,80 y una desviación hacia el borde recto de 19562,33 ± 1068,39 (Figura 6A-C).

Finalmente, se evaluó el efecto sobre la viabilidad celular después de las heridas celulares (Figura 6D). Los resultados demostraron que 12 h después de la finalización de la herida celular, la viabilidad celular fue leve pero significativamente mayor en el grupo de raspadores celulares que en el grupo de puntas. Se llevó a cabo un ensayo EdU para confirmar aún más estos resultados y aclarar el impacto de diferentes métodos de preparación de heridas celulares en la proliferación celular, es decir, la replicación del ADN. Los resultados del ensayo EdU mostraron que el porcentaje de células proliferantes en el grupo raspador de células (24,41% ± 0,48) fue significativamente mayor que en el método de puntas (18,79% ± 1,46) después de 12 h (Figura 6E,F).

Estos datos atestiguan fuertemente que el actual generador de heridas celulares superó al método actual para crear heridas celulares en términos de estabilidad y reproducibilidad biológica. Tuvo un bajo impacto en la viabilidad y proliferación celular. Todas estas notables ventajas del generador de bobinado celular confirmaron su potencial para mejorar los ensayos actuales de wound celular al garantizar la fiabilidad y repetibilidad de los datos resultantes.

figure-results-1
Figura 1: Análisis de las demandas de los usuarios. (A) El diagrama de Sankey presenta el flujo de trabajo de la investigación basada en cuestionarios para los experimentadores. (B) a (G) exhibir los resultados de los cuestionarios, incluidas las preguntas 1 a 6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Diseño del producto con colores y materiales utilizados. (A) Selección de colores. (B) Autoclave utilizado en experimentos biológicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Diseño de producto de estructuras detalladas. (A) Tres candidatos a prototipos de raspador de células. (B) Tres bocetos del diseño de la punta. (C) Plano de tres vistas del prototipo III seleccionado que presente su diseño general y los parámetros físicos y espaciales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-4
Figura 4: Modelo tridimensional renderizado y visualización de estructuras internas. (A) Renderizado del modelo tridimensional. (B) Diagrama explosivo que demuestre las estructuras internas del raspador de células propuesto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-5
Figura 5: Mecanismos de funcionamiento del raspador de células. (A) Los bocetos muestran cómo funciona el raspador de células. (B) Producto físico del raspador de células. (C) El raspador de celdas encaja en una placa de 6 pocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-6
Figura 6: Validación experimental del raspador celular. (A) Las heridas celulares generadas por diferentes métodos y sus resultados de comparación agrupados se mostraron en (B) y (C), la barra de escala es de 100 μm. (D) Resultados de viabilidad celular. (E) y (F) Edu, la barra de escala es de 50 μm. Para la evaluación estadística se realizó la prueba t para la comparación agrupada, y el valor p original se ajustó mediante la prueba de Holm-Bonferroni para evitar resultados falsos positivos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

I) ¿Cuál de los siguientes es el problema más preocupante para usted en el experimento de rascado de celdas?
A) Sin bordes rectos
B) Anchura inestable
C) Proliferación lenta
D) Contaminación celular
E) Otros
II) ¿Qué herramientas utiliza para generar heridas celulares?
A) Puntas de pipeta (pase a la pregunta III)
B) Insertos de cultivo celular (pase a la pregunta IV-V)
III) ¿Por qué no eliges insertos de cultivo celular?
A) Viabilidad celular
B) No reutilizable
C) Costo
D) Otros
IV) ¿Por qué elegiste los insertos de cultivo celular?
A) Costo
B) Repetibilidad
C) Otros
V) ¿Cuáles cree que son los problemas más graves con los insertos de cultivo celular?
A) Estado de la célula
B) No reutilizable
C) Caro
D) Otros
E) Satisfecho
VI) Si existiera una herramienta de rascado barata, reutilizable (esterilizable en autoclave) y altamente reproducible, ¿qué tan dispuesto estaría a comprarla y usarla?
A) Muy dispuesto
B) Dispuesto
C) No estoy seguro
D) Renuente

Tabla 1: El cuestionario utilizado en este estudio consta de seis preguntas destinadas a comprender las situaciones que los biólogos encuentran durante los ensayos de cicatrización de heridas celulares.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El presente estudio tuvo como objetivo desarrollar una herramienta mecanizada automática para el ensayo de cicatrización de heridas celulares. Hasta donde sabemos, representa el primer intento de aplicar una estructura mecanizada para crear heridas celulares de forma automática con un solo clic. Con esto, nuestro objetivo es abordar las deficiencias del método tradicional basado en puntas, como la baja reproducibilidad y el estado de rayado inestable. Beneficiándose de los resultados positivos y de los comentarios alentadores de la comunidad de usuarios, se espera que el raspador de células proporcione a los experimentadores una alternativa eficiente y estable para crear heridas celulares, mejorando así significativamente el nivel de confianza de los resultados del análisis experimental.

Para el uso del raspador de células presente, el usuario debe 1) preparar las celdas pendientes para crear un espacio libre de celdas similar a los métodos tradicionales como el método basado en puntas, es decir, sembrar celdas en una placa de seis pocillos a una densidad dada; 2) esperar a que la tasa de convergencia celular alcance > 90%; 3) coloque el raspador de células estériles en un pocillo de placa, haga clic en el botón como se ilustra en la Figura 5, y el espacio libre de células se creará automáticamente dentro de 1-2 s.

El ensayo de cicatrización de heridas celulares se ha empleado ampliamente para medir la capacidad de migración celular. Normalmente, los experimentadores utilizan puntas de pipeta para crear heridas celulares. Por ejemplo, Tariq et al. utilizaron una punta de pipeta para crear heridas celulares para evaluar la capacidad de migración celular45; no es casualidad que Rahimi et al. utilizaran una punta de pipeta en un ensayo para observar la capacidad migratoria de las células PC346; en el ensayo de migración de células mesenquimales en ratones, Cormier et al. también utilizaron una pistola de pipetas47; para demostrar el efecto del arsénico en la migración de las células de la piel, Pinto et al. utilizaron una punta de pipeta para el raspado vertical48, entre otros.

Sin embargo, como se mencionó anteriormente, el uso de una punta para crear heridas celulares tiene varios problemas, como el área libre de células variable, los bordes dentados y la dependencia de la fuerza del operador y el ángulo de rascado, lo que resulta en una baja reproducibilidad49. Los resultados actuales de los cuestionarios también demostraron que el método basado en puntas tiene ventajas más evidentes sobre los insertos de cultivo celular, específicamente en términos de precio, tasa de supervivencia celular y reutilización de la herramienta. Alternativamente, los insertos de celda son demasiado costosos y difíciles de reutilizar, mientras que cualquiera de las herramientas tiene defectos. Por lo tanto, la comunidad de usuarios es generalmente optimista y está dispuesta a probar herramientas innovadoras. Este estudio diseñó y desarrolló una nueva herramienta de preparación de áreas libres de células para facilitar y estabilizar la creación de heridas celulares.

La contribución más importante del presente estudio radica en el desarrollo y validación experimental de raspadores celulares. En comparación con los estudios anteriores, las mejoras del actual raspador de células incluyen los siguientes tres puntos principales. 1) Fabricación estable y conveniente de heridas celulares. Este estudio demostró que, en comparación con el método tradicional basado en puntas, las heridas celulares fabricadas por el actual raspador celular tenían bordes rectos y podían crear heridas similares en experimentos repetidos, lo que mejoró en gran medida la reproducibilidad y la fiabilidad de los experimentos de curación de heridas celulares. 2) El raspador celular actual tuvo menos efecto sobre el estado de la célula. No afectó a la viabilidad y proliferación celular (amplificación del ADN), que fue significativamente mejor que el método basado en puntas. Por lo tanto, se espera que este raspador celular reduzca aún más la influencia de factores externos en el ensayo de cicatrización de heridas celulares en experimentos de rutina. 3) Este raspador de células está de acuerdo con las demandas de la comunidad de usuarios. Los resultados de la encuesta del cuestionario anterior mostraron que los requisitos de los usuarios para la nueva herramienta de heridas celulares incluyen principalmente un ancho de carrera uniforme, alta reproducibilidad, procedimiento de operación simple y precio moderado, que se han logrado en el actual raspador de celdas. Además, el rascador de celdas está diseñado en colores neutros para transmitir el concepto de diseño simple y práctico de este producto. Al mismo tiempo, el fuerte contraste entre blanco y negro resalta eficazmente sus áreas funcionales. El estilo general es una forma de cruz formada por la articulación redondeada de la superficie curva, que hace referencia a la forma convencional de la herida y sugiere el papel del producto. La dificultad de la operación se reduce simplificando la operación y la función de reinicio manual. En resumen, los resultados indican una herramienta alternativa prometedora para que los experimentadores preparen arañazos celulares de manera robusta, automatizada y con un solo clic, mejorando así la reproducibilidad de los resultados científicos.

Hay que reconocer las limitaciones de este estudio. El tamaño de la muestra de los entrevistados limita la generalización de este estudio; Por lo tanto, ampliaremos aún más el tamaño de la muestra en un estudio de seguimiento para mejorar el raspador de células. En segundo lugar, el rascador de células debe incluirse en un estudio bien planificado con una población más grande de usuarios para que el rendimiento de este raspador de células pueda evaluarse de manera más completa.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Sociales (22FYSB023), la Fundación de Investigación del Centro de Diseño Industrial de Hubei (08hqt201412046) y la Fundación de Humanidades y Ciencias Sociales del Departamento de Educación Provincial de Hubei (15Y054).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CCK-8 KitBeyotime Company, ChinaC0037
sistema de microscopio digitalOlympusIX81
suero fetal bovinoGibco, EE. UU16000044
HOS Procell Ciencias de la Vida & Tecnología Co., LtdCL-0360
Image-Pro PlusMedia Cyberneticsversión 6.0
KeyShotLuxionversión 11.0software de renderizado 3D
microplacasBioTek, alemánELX808
Minimum Essential MediumGibco, EE. UU.11095080
Sistema de coincidencia PantoneCombinación de colores comerciales
penicilina-estreptomicinaBeyotime Company, ChinaST488
PhotoshopAdobesoftware de fotografía y diseño
Rhinoceros 3DRobert McNeel & Asociadosversión 7.0software de diseño 3D
TC20 Contador de células automatizadoBio-RadTC20
TripsinaCytiva  HyClone, Estados UnidosSH30042.01
. lector de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Compr Physiol. 2 (4), 2369-2392 (2012).
  2. Moncharmont, C., et al. Radiation-enhanced cell migration/invasion process: a review. Crit Rev Oncol Hematol. 92 (2), 133-142 (2014).
  3. Verbeek, B. S., Adriaansen-Slot, S. S., Vroom, T. M., Beckers, T., Rijksen, G. J. F. I. Overexpression of EGFR and c-erbB2 causes enhanced cell migration in human breast cancer cells and NIH3T3 fibroblasts. FEBS Lett. 425 (1), 145-150 (1998).
  4. Vaideeswar, P., Aswani, Y., Damani, S., Singaravel, S. Pulmonary microvascular metastases in cervical carcinoma: A case series. J Postgrad Med. 66 (3), 155-158 (2020).
  5. Liang, Y., Zhang, H., Song, X., Yang, Q. Metastatic heterogeneity of breast cancer: Molecular mechanism and potential therapeutic targets. Semin Cancer Biol. 60, 14-27 (2020).
  6. Sasaki, R., Osaki, M., Okada, F. MicroRNA-based diagnosis and treatment of metastatic human osteosarcoma. Cancers (Basel). 11 (4), 553(2019).
  7. Spaeth, E., Klopp, A., Dembinski, J., Andreeff, M., Marini, F. Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells. Gene Ther. 15 (10), 730-738 (2008).
  8. Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
  9. Yue, P. Y., Leung, E. P., Mak, N., Wong, R. N. A simplified method for quantifying cell migration/wound healing in 96-well plates. J Biomol Screen. 15 (4), 427-433 (2010).
  10. Roch, T., et al. Immunological evaluation of polystyrene and poly (ether imide) cell culture inserts with different roughness. Clin Hemorheol Microcirc. 52 (2-4), 375-389 (2012).
  11. Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
  12. Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , John Wiley & Sons, Inc. (2015).
  13. Kato, T., et al. Reuse of cell culture inserts for in vitro human primary airway epithelial cell studies. Am J Respir Cell. 64 (6), 760-764 (2021).
  14. Veludo-de-Oliveira, T. M., Ikeda, A. A., Campomar, M. C. Discussing laddering application by the means-end chain theory. Qualit Rep. 11 (4), 626-642 (2006).
  15. Yang, T., Yang, F., Men, J. Recommendation content matters! Exploring the impact of the recommendation content on consumer decisions from the means-end chain perspective. Int J Info Manage. 68, 102589(2023).
  16. Sadeghlou, S., Emami, A. Residential preferences and satisfaction: a qualitative study using means-end chain theory. J Housing Built Env. 38, 1711-1734 (2023).
  17. Pieters, R., Baumgartner, H., Allen, D. A means-end chain approach to consumer goal structures. Int J Res Market. 12 (3), 227-244 (1995).
  18. Valette-Florence, P., Rapacchi, B. J. J. Improvements in means-end chain analysis: using graph theory and correspondence analysis. J Advert Res. 31, 30-45 (1991).
  19. Nunkoo, R., Ramkissoon, H. Applying the means-end chain theory and the laddering technique to the study of host attitudes to tourism. J Sustain Tourism. 17 (3), 337-355 (2009).
  20. Development of an automatic mold polishing system. Tsai, M. J., Chang, J. L., Haung, J. F. IEEE Int Conf Robot Auto, 3, 3517-3522 (2005).
  21. Altan, T., et al. Advanced techniques for die and mold manufacturing. CIRP Annals. 42 (2), 707-716 (1993).
  22. Kalt, E., Monfared, R., Jackson, M. Towards an automated polishing system: Capturing manual polishing operations. Int J Res Eng Tech. 5 (7), 182-192 (2016).
  23. Becerra, L. CMF design: the fundamental principles of colour, material and finish design. , Frame Publishers, UK. (2016).
  24. Pan, C., et al. Next-generation immuno-oncology agents: current momentum shifts in cancer immunotherapy. J Hematol Oncol. 13 (1), 29(2020).
  25. Kim, S., Nah, K. The development direction of emotional materials by increasing sensorial experiences-Focusing on the case study of CMF design. Arch Des Res. 27 (2), 121-135 (2014).
  26. Eiseman, L. The complete color harmony, pantone edition: expert color information for professional results. , Rockport Publishers. (2017).
  27. Eiseman, L., Recker, K. Pantone: The twentieth century in color:(coffee table books, design books, best books about color). , Chronicle Books. (2011).
  28. Deng, P., Jin, W., Liu, Z., Gao, M., Zhou, J. Novel multifunctional adenine-modified chitosan dressings for promoting wound healing. Carbohydr Polym. 260, 117767(2021).
  29. Ares, G., Giménez, A., Gámbaro, A. Understanding consumers' perception of conventional and functional yogurts using word association and hard laddering. Food Quality Prefer. 19 (7), 636-643 (2008).
  30. Lee, W. J. A study on word cloud techniques for analysis of unstructured text data. J Converg Culture Tech. 6 (4), 715-720 (2020).
  31. Word Cloud Explorer: Text Analytics Based on Word Clouds. Heimerl, F., Lohmann, S., Lange, S., Ertl, T. 47th Hawaii international conference on system sciences, , IEEE. (2014).
  32. Kulevicz, R. A., et al. Influence of sustainability reports on social and environmental issues: bibliometric analysis and the word cloud approach. Env Rev. 28 (4), 380-386 (2020).
  33. Rubbo, S. D., Gardner, J. F. A review of sterilization and disinfection. Lloyd-Luke. , (1965).
  34. Kelsey, J. C. Sterilization by ethylene oxide. J Clin Pathol. 14 (1), 59-61 (1961).
  35. Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Sci. 22 (1), 1-16 (2017).
  36. Rutala, W. A., Gergen, M. F., Weber, D. J. Comparative evaluation of the sporicidal activity of new low-temperature sterilization technologies: ethylene oxide, 2 plasma sterilization systems, and liquid peracetic acid. Am J Infect Control. 26 (4), 393-398 (1998).
  37. Dion, M., Parker, W. Steam sterilization principles. Pharm Eng. 33 (6), 1-8 (2013).
  38. Környei, Z., et al. Cell sorting in a Petri dish controlled by computer vision. Sci Rep. 3, 1088(2013).
  39. Hsu, J. T., et al. Chronic wound assessment and infection detection method. BMC Med Inform Decis Mak. 19 (1), 99(2019).
  40. Katoh, M. Test-retest reliability of isometric ankle plantar flexion strength measurement performed by a hand-held dynamometer considering fixation: examination of healthy young participants. J Phys Ther Sci. 34 (6), 463-466 (2022).
  41. Li, X., Zhao, J., Ma, G., Huang, S. Experimental study on the traditional timber mortise-tenon joints. Adv Str Eng. 18 (12), 2089-2102 (2016).
  42. Cottle, R. W. The principal pivoting method revisited. Mathematical Prog. 48, 369-385 (1990).
  43. Cross, N. Engineering design methods: strategies for product design. , John Wiley & Sons. (2021).
  44. Otto, K., Wood, K. Product design: techniques in reverse engineering and new product development. , Pearson. (2001).
  45. Tariq, M., et al. Gefitinib inhibits M2-like polarization of tumor-associated macrophages in Lewis lung cancer by targeting the STAT6 signaling pathway. Acta Pharmacol Sin. 38 (11), 1501-1511 (2017).
  46. Rahimi, S., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of Lcn2 effectively enhanced CDDP-induced apoptosis and reduced cell migration capacity of PC3 cells. Life Sci. 231, 116586(2019).
  47. Cormier, N., Yeo, A., Fiorentino, E., Paxson, J. Optimization of the wound scratch assay to detect changes in murine mesenchymal stromal cell migration after damage by soluble cigarette smoke extract. J Vis Exp. (106), e53414(2015).
  48. Pinto, B. I., Cruz, N. D., Lujan, O. R., Propper, C. R., Kellar, R. S. In vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration. J Vis Exp. (144), e58838(2019).
  49. Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. Wound healing assay. Methods Mol Biol. 294, 23-29 (2005).

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Raspador de c lulasespacio libre de c lulasmigraci n celularviabilidad celularproliferaci n celularensayo reproduciblem todo basado en puntasensayo de EdU

Artículos relacionados