Artículo de método

Cuantificación de la calosa en tejidos vegetales mediante ensayo inmunoenzimático enlazado / espectrofotometría de inmunofluorescencia

DOI:

10.3791/65833

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22 de mayo de 2026

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1Department of Plant Sciences, Microbiology, and Biotechnology, College of Natural Sciences, Makerere University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3The Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 4International Potato Center (CIP)

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo cuantifica la calosa en tejidos vegetales utilizando el método específico de callosa, espectrofotometría de inmunofluorescencia/ELISA, que se basa en la unión de la calosa en las muestras vegetales a anticuerpos específicos de callosa, seguida de la cuantificación de la calosa unida mediante anticuerpos de detección marcados por enzimas, midiendo la actividad enzimática resultante.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los métodos existentes de cuantificación de calosas a partir de tejidos vegetales incluyen microscopía de epifluorescencia, espectrofotometría de fluorescencia, microscopía de inmunofluorescencia y evaluación indirecta tanto de las actividades de calosa sintasa como de β-(1,3)-glucanasa. Sin embargo, algunos de estos métodos presentan limitaciones significativas, que incluyen ser costosos en tiempo, no específicos de la callosidad, laboriosos, subjetivos, alta autofluorescencia, baja sensibilidad, ser más cualitativos que cuantitativos y requerir la adquisición de recursos de software y habilidades técnicas. Por ello, existe una necesidad urgente de explorar métodos alternativos para la cuantificación de calosas en tejidos vegetales. Se planteó la hipótesis de que la espectrofotometría de inmunofluorescencia o el ensayo inmunoabsorbente enzimático (ELISA) que utiliza anticuerpos específicos de callosa podrían superar algunas de las limitaciones de los métodos actuales de cuantificación de calosa. El estrés biótico se administró inoculando plantitas de plátano derivadas de cultivos tisulares con Xanthomonas vasicola pv. bacterias musacearum (Xvm) que inducían la producción de calosa. Se recogieron muestras de tejido de corma de plátano a los 14 días posteriores a la inoculación (dpi) para cuantificación de calosas utilizando el nuevo método de espectrofotometría de inmunofluorescencia. La producción de calosas en los cormos de los grupos inoculados con Xvm y de control varió significativamente en ambos genotipos de plátano (prueba t de muestra independiente, p < 0,05). El método de espectrofotometría de inmunofluorescencia descrito aquí podría aplicarse para la cuantificación de calosas en diferentes tejidos vegetales con alta especificidad a callosa, sensibilidad, fiabilidad y reproducibilidad. Además, el uso de una placa de 96 pozos hace que este método sea adecuado para estudios de cuantificación de calosa de alto rendimiento con sesgos mínimos de muestreo y análisis.

Introducción

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La calosa es un polisacárido de β-1,3-glucano, que es un compuesto natural que se encuentra en las paredes celulares de diversas plantas superiores. La calosa se sintetiza por las calosintasas (CalS) y se degrada por las β-(1,3)-glucanasas 1,2,3. Está involucrado en varios procesos biológicos, incluyendo el crecimiento y desarrollo y la respuesta a estrés abióticosy bióticos 4,5,6. Durante la infección por patógenos, el aumento de la deposición calosa en las papilas ayuda a prevenir una colonización microbiana adicional, actuando como barrera de permeabilidad entre las células vegetalesvecinas 2,4,7,8,9,10,11,12 . Al ralentizar la invasión de patógenos en el tejido atacado, la deposición calosa permite la inducción de respuestas de defensa adicionales13. La cuantificación espaciotemporal precisa de la calosa en los tejidos vegetales es esencial para comprender su papel en los distintos procesos fisiológicos. Sin embargo, los métodos actuales de cuantificación de calosas a partir de tejidos vegetales, que incluyen la microscopía de epifluorescencia, la inmunofluorescencia y la espectrofotometría de fluorescencia, presentan limitaciones significativas y desafíos de cuantificación. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de explorar métodos alternativos para la cuantificación de calosas que superen estos inconvenientes. Se planteó la hipótesis de que la espectrofotometría de inmunofluorescencia o el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) podrían ofrecer un método más eficiente de cuantificación de calosas en muestras vegetales, que incluye alta especificidad, sensibilidad, fiabilidad, reproducibilidad y un método de alto rendimiento.

El método estándar de oro para la cuantificación de calosas implica la imagen de partículas de calosa teñidas de azul de anilina mediante microscopíade epifluorescencia 14,15,16,17. La calosa teñida de azul de anilina, cuando se expone a la excitación de luz azul o UV, aparece como partículas fluorescentes amarillas, que pueden contarse manualmente para el número de partículas de calosafluorescentes 14,15 o contar mediante software automatizado de conteo de calosa. El conteo manual de partículas de calosa es laborioso, lleva mucho tiempo y es subjetivo para elinvestigador 18, mientras que el conteo automatizado requiere adquirir recursos de software y considerables habilidades técnicas. Algunos de los programas utilizados para el conteo automático de calosas incluyenImageJ 19,20,21,22, Photoshop23, CalloseMeasurer24, Icy18,25 e Ilastik26. La calosa teñida de azul de anilina también puede cuantificarse usando la espectrofotometría defluorescencia 17,19,27,28,29. Sin embargo, la alta autofluorescencia de fondo/autofluorescencia asociada a la microscopía de epifluorescencia y la espectrofotometría de fluorescencia hacen que estos métodos sean difíciles e poco fiables debido a la baja relaciónseñal-ruido de 26. Además, el azul de anilina puede teñir a otros glucanos β-1,3 además de la calosa30, haciendo que tanto la microscopía de epifluorescencia como los métodos de espectrofotometría de fluorescencia para la detección y cuantificación de la calosa sean parcialmente inespecíficos e poco fiables. Un método de microscopía de inmunofluorescencia para cuantificación de calosa, basado en anticuerpos específicos de callosa, también se ha utilizado en variosestudios 31,32,33. Aunque este método comparte algunas desventajas con la microscopía de epifluorescencia de callosa teñida de azul de anilina, tiene la ventaja de ser específico de callosa debido a los anticuerpos utilizados aquí. La cuantificación de calosas también se ha realizado utilizando métodos basados en la actividad enzimática. Los métodos basados en la actividad enzimática para la cuantificación de calosa incluyen la evaluación de las actividades de la calosa sintasa (CalS)20,33 y de β-(1,3)-glucanasa 34,35. Los métodos basados en la actividad enzimática presentan varias desventajas en comparación con la microscopía de epifluorescencia, la inmunofluorescencia y la espectrofotometría de fluorescencia. Estos incluyen la estimación indirecta de la callosa, la dificultad de extracción enzimática y los ensayos de actividad enzimática, y la falta de distribución uniforme de calosa en los tejidos vegetales.

Debido a las desventajas de los métodos actuales de cuantificación de calosa, que incluyen microscopía de epifluorescencia, inmunofluorescencia, espectrofotometría de fluorescencia, ensayos CalS y β-(1,3)-glucanasa, fue necesario idear un nuevo método de cuantificación de calosas que ofreciera varias ventajas, entre las que 1) alta especificidad, sensibilidad, fiabilidad y reproducibilidad, y 2) una cuantificación de calosa más sencilla con capacidad de alto rendimiento. No se ha explorado el uso de la espectrofotometría de inmunofluorescencia para la cuantificación de calosa. Aquí se presenta un nuevo método de cuantificación de calosas basado en la espectrofotometría de inmunofluorescencia, más concretamente, el Ensayo de Inmunoabsorción Enzimática (ELISA). El método puede optimizarse para la cuantificación de calosas en diferentes plantas o sus tejidos con un buen grado de especificidad en callosidad, precisión, reproducibilidad y una capacidad experimental de alto rendimiento. Este método también puede modificarse para cuantificar cualquier analito de origen vegetal si existe el anticuerpo contra ese analito. Para garantizar una distribución espaciotemporal precisa, eficiente y fiable de la calosa en los tejidos vegetales, se recomienda utilizar simultáneamente diferentes métodos de cuantificación de calosa, que incluyen la microscopía, la espectrofotometría y los métodos basados en la actividad enzimática. En consecuencia, esto permitirá comprender de manera precisa y eficiente el papel de la calosa en diversas respuestas fisiológicas y al estrés.

Protocolo

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1. Inoculación de plantas experimentales

  1. Aislar, preparar y confirmar el inóculo Xvm utilizando procedimientos estándar36,37. Seleccionar aleatoriamente 10 plantas de Musa balbisiana y Mbwazirume derivadas de cultivos tisulares de 2 meses y inocular el lado dorsal del pecíolo foliar más joven y completamente abierto con 200 μL (1 x 108 células) del inóculo Xvm confirmado por PCR (Figura 1)38.
  2. De manera similar, selecciona al azar 10 plantas de plátano Musa balbisiana y Mbwazirume e inocúlalas con 200 μL de agua destilada estéril (SDW).
  3. Mantener las plantas de plátano inoculadas con Xvm y controlar las plantas de plátano en condiciones similares en la caseta con un fotoperiodo de 12 horas de luz y 12 horas de fotoperiodo oscuro a 25 °C, regándolas cada 3 días.
    NOTA: Consulte la Tabla de Materiales y la Tabla 1 para la lista de materiales y equipos y la receta de los buffers, respectivamente.

2. Muestreo de tejidos de cormos y preparación de muestras

  1. Realizar muestreos destructivos para obtener muestras de cormos de las plantas experimentales (Figura 1).
  2. Extrae rápidamente aproximadamente 2 g de muestras de cormo utilizando cuchillas quirúrgicas estériles a los 14 días de la inoculación (dpi) y colócalas individualmente en tubos etiquetados de 50 mL. Haz esto para las 10 muestras recogidas de las plantas inoculadas con Xvm y las plantas de control.
  3. Sumerge inmediatamente los tubos de 50 mL que contienen las muestras en nitrógeno líquido.
  4. Transporta las muestras al laboratorio y guárdalas a -80 °C hasta que estén listas para continuar. Almacena las muestras a −80 °C durante hasta 1 año o más, con ciclos mínimos de congelación y descongelación.
  5. Liofilizar las muestras durante 72 horas usando un liofilizador (Figura 1).
  6. Coloca exactamente 30 mg de las muestras liofilizadas en 2 mL de tubos que contienen 2 cuentas de acero para bicicleta y pulverizalas hasta obtener polvo fino, con la velocidad fijada en 5 durante 1 minuto (Figura 1).
  7. Guarda las muestras pulverizadas en un ambiente fresco y seco a temperatura ambiente, bien selladas hasta que estén listas para proceder. Almacenar las muestras pulverizadas a temperatura ambiente durante hasta 4 meses o a −80 °C durante hasta 1 año, con ciclos mínimos decongelación-deshielo 39,40.

3. Extracción de calosa y preparación de estándares de laminarina y blank

  1. Para extraer calosa de los 30 mg de la muestra pulverizada del cormo, añade 800 μL de 1 M NaOH e incuba durante 30 minutos a 80 °C en baño maria, con vórtices ocasionales cada 10 minutos27,41 (Figura 1, Paso 6).
  2. Deja que las muestras se enfríen a temperatura ambiente (aproximadamente 5 minutos) y luego centrifuga a 15.294 x g durante 5 minutos.
  3. Transfiere el sobrenadante (extracto de calosa) a un tubo estéril de 2 mL y diluye con el tampón bloqueante (Tabla 1) en una proporción de 1:2.
    NOTA: Elige el factor de dilución basándote en la experimentación y optimización preliminares. La dilución del extracto de calosa puede o no ser necesaria. Cuando sea necesario, la dilución debe realizarse en el buffer de bloqueo y optimizar la relación de dilución para que los diferentes tipos de muestra se ajusten al rango de la curva estándar.
  4. Guarda los extractos de calosa a -20 °C hasta que estés listo para continuar. Conserva el extracto de calosa hasta 6 meses con ciclos mínimos de congelación y descongelación.
  5. Prepara un stock concentrado de laminarina estándar a 100 mg/mL en 1 M NaOH 6,42,43,44,45.
    NOTA: La laminarina es un polímero 1-3-β-glucano y puede usarse como estándar para equivalentes calosos en espectrofotometría de inmunofluorescencia.
  6. Incubar la suspensión resultante del estándar a 80 °C en un baño marea, agitándolo suavemente a intervalos, hasta que toda la laminarina esté completamente disuelta (aproximadamente 20-40 minutos).
  7. Enfría el estándar disuelto a temperatura ambiente (aproximadamente 10 minutos).
  8. Preparar los estándares de laminarina a concentraciones de 80 mg/mL, 60 mg/mL, 40 mg/mL, 20 mg/mL, 10 mg/mL, 1 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,1 mg/mL y 0,01 mg/mL utilizando el tampón bloqueante, partiendo del stock concentrado de 100 mg/mL.
  9. Prepara los blanks mezclando 1 M de NaOH y el buffer de bloqueo en una proporción de 1:2. Si se requiere dilución, utiliza la misma proporción de dilución que se utiliza para preparar el extracto de calosa.
  10. Guarda los estándares de laminarina y los blanks a −20 °C. Conserva los estándares y los blanks hasta 6 meses con ciclos mínimos de congelación y descongelación.

4. Cuantificación de calosas mediante espectrofotometría de inmunofluorescencia

  1. Añadir 100 μL del anticuerpo primario (1-3-β-IgG dirigido al glúcano para ratones) preparado utilizando el tampón de recubrimiento (Tabla 1) a cada uno de los 96 pozos de las placas ELISA de poliestireno (Figura 2).
  2. Sella bien la placa con película de parafina y déjala incubar durante la noche a 4 °C en la nevera.
  3. Al día siguiente, coloca el plato sobre la mesa y déjalo alcanzar la temperatura ambiente (aproximadamente 10 minutos).
  4. Lava la placa usando los procedimientos estándar de secado ylavado 46. En resumen, añade 200 μL del buffer de lavado (Tabla 1) a los pozos, haz un vórtice a 500 rpm durante 30 s usando un agitador digital y mancha papel de seda. Repite este proceso de lavado dos veces (Figura 2). Asegúrate de que los pozos no se sequen completamente y utiliza una punta de micropipeta estéril para eliminar cualquier burbuja sin tocar la base ni las paredes de los pozos.
  5. Añade 200 μL del tampón de bloqueo a cada uno de los pozos (Figura 2) y sella la placa herméticamente con película de parafina. Incubarla durante 4 horas a 37 °C. Lava el plato como se mencionó anteriormente (Figura 2).
  6. Añadir 100 μL del extracto caloso de las 10 plantas inoculadas con Xvm y 10 de control a los pozos designados. Añadir 100 μL de los estándares laminarinos a otros pozos. Añadir 100 μL del blank a otros pozos (Figura 2).
  7. Sella la placa herméticamente con película de parafina e incuba toda la noche a 4 °C en la nevera. Lava el plato de nuevo como se mencionó antes (Figura 2).
  8. Añadir 100 μL del anticuerpo primario (IgG dirigido al ratón 1-3-β-glucano) preparado utilizando el tampón bloqueante a cada uno de los pozos (Figura 2).
  9. Sella la placa firmemente con película de parafina e incuba durante 4 horas a 37 °C, luego lava la placa como se indica arriba (Figura 2).
  10. Añadir 100 μL de anticuerpo secundario anti-IgG-fosfatasa alcalina anti-ratón a cadapozo 46,47 (Figura 2).
  11. Sella la placa herméticamente con película de parafina e incuba toda la noche a 4 °C en la nevera. Luego, lava la placa como se indica arriba (Figura 2).
  12. Añadir 100 μL de solución recién preparada de para-nitrofenil fosfato (pNPP) a una concentración de 1 mg/mL (Tabla 1) a los pozos (Figura 2)
  13. Incuba el plato en el banco a temperatura ambiente durante 30 min48.
    NOTA: El tiempo de incubación puede variar según las muestras de planta y el estándar utilizado. En este estudio, la laminarina tuvo la mejor lectura a los 30 minutos.
  14. Termina la reacción añadiendo 100 μL de solución de parada recién preparada (0,5 M NaOH) a cada uno de lospozos 48 (Figura 2).
  15. Transfiere la placa a un lector de microplacas (equilibrado a 37 °C), agita a velocidad media durante 1 minuto y lee las absorbancias a 405nm 48 (Figura 1, Figura 2).

5. Análisis de datos

  1. Realizar una regresión lineal sencilla de la absorbancia de laminarina a 405 nm frente a la concentración de laminarina (μg/mL) para obtener la curva estándar. La ecuación de la curva estándar es
    Y = β1X + β0
    donde Y representa la absorbancia de laminarina a 405 nm, β1 es la pendiente de la línea de regresión (coeficiente de correlación de Pearson), X es Log10 (concentración de laminarina en μg/mL) y β0 es la intersección y.
  2. Calcula las concentraciones de calosa en las muestras de los cormos restando la absorbancia del blank de la absorbancia de las muestras. Luego se utiliza la curva estándar para estimar la concentración de calosa en μg/mL como equivalente a laminarina (LE).
  3. Examinar todos los datos para determinar la normalidad de la distribución utilizando la prueba de Shapiro-Wilk y comprobar la homoscedasticidad de las varianzas usando la prueba de Levene (α > 0,05).
  4. Utilice la prueba t de muestra independiente para comparar la producción de calosas entre los grupos inoculados con Xvm y control (p≤ 0,05).

Resultados

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Las concentraciones conocidas de los estandartes de laminarina se analizaron mediante espectrofotometría y se registraron sus valores de absorbancia correspondientes. Utilizando estos datos, se construyó un gráfico de Beer-Lambert graficando las concentraciones de los estandartes de laminarina en el eje x y la absorbancia en el eje y. La ecuación de la línea de regresión era y = 0,5079x − 0,04534 (Figura 3)49. El gráfico de Beer-Lambert dio un alto coeficiente de correlación (r) de 0,9988 y un coeficiente de determinación (r2) de 0,9975, lo que indica una fuerte relación lineal entre concentración y absorbancia, y hasta 0,9975 de la varianza en la variable dependiente (absorbancia) se explicaba mediante la variable independiente (concentración; Figura 3; p<0,0001). Por lo tanto, este modelo era un buen ajuste, preciso y fiable para predecir la concentración de laminarina y callosa. La concentración de calosa en las muestras de cormos de plátano se determinó midiendo la absorbancia de las muestras mediante espectrofotometría y utilizando los valores de absorbancia para calcular las concentraciones de calosa mediante la ecuación.

El ensayo de espectrofotometría de inmunofluorescencia mostró un aumento significativo en la calosa inducida en plantas inoculadas con Xvm en comparación con el grupo control en ambos genotipos de plátano (prueba t de muestra independiente, p < 0,05; Figura 4). La producción de calosa en las plantas de control a 14 dpi fue de 1474,34 mg/mL y 1037,11 mg/mL para Mbwazirume y M. balbisiana, respectivamente (Figura 4). La inoculación de las plantas con Xvm resultó en 4190,78 mg/mL y 1996,07 mg/mL de calosa en los cormos de las plantas de Mbwazirume y M. balbisiana inoculadas con Xvm a 14 dpi, respectivamente (Figura 4). La inoculación con Xvm provocó una producción de calosas entre 1,9 y 2,8 veces mayor en comparación con las plantas control (prueba t de muestra independiente, p < 0,001; Figura 4).

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Figura 1: Ilustración esquemática de los principales pasos implicados en la cuantificación de calosas mediante el nuevo método de espectrofotometría de inmunofluorescencia. Esta figura muestra los principales pasos implicados en la cuantificación de calosa a partir de tejidos de plátano, que incluyen la elevación de las plantitas derivadas de cultivos tisulares, inoculación con Xvm, muestreo destructivo de los tejidos cormáticos, liofilización de las muestras, extracción de calosa y cuantificación de calosa mediante el nuevo método de espectrofotometría de inmunofluorescencia. Esta cifra ha sidoreimpresa en 50. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2: Ilustración esquemática detallada del método de espectrofotometría de inmunofluorescencia para la cuantificación de calosa. Esta figura ofrece una demostración detallada del método de espectrofotometría de inmunofluorescencia para la cuantificación de calosa, mostrando cómo la placa ELISA se carga con los distintos componentes y cómo finalmente se cuantifica la calosa mediante espectrofotometría. Esta cifra ha sidoreimpresa en 50. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 3: Cuantificación de proteínas. El gráfico de Beer-Lambert basado en los estándares de laminarina de concentraciones conocidas y lecturas de absorbancia (a 405 nm) se utiliza para el cálculo de concentraciones de calosis (como equivalentes de laminarina, LE) a partir de lecturas de absorbancia de las muestras de cormo. Esta cifra ha sidoreimpresa en 49. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 4: Comparación de la concentración de calosa. Comparación de concentraciones medias de calosa (media ± SEM, n = 9) en los cormos de las plantas de plátano M. balbisiana y Mbwazirume inoculadas con Xvm , según lo determinado por el nuevo método de espectrofotometría de inmunofluorescencia (prueba t de muestra independiente, α ≤ 0,05). Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

BufferComposiciónAlmacenamiento
Búfer de bloqueo10 g de albúmina sérica bovina (BSA; 1% w/v), disuelta en 1 L de PBS.-20 °C durante hasta 6 meses
Amortiguador de recubrimiento1,59 g de carbonato sódico (Na2CO3), 2,93 g de bicarbonato sódico (NaHCO3), 0,2 g de azida sódica (NaN 3), disueltos en 1 L de H2O desionizado, pH 9,6.-20 °C durante hasta 12 meses
Búfer conjugado2 g de PVP (2% p/v), disuelto en 1 L de buffer bloqueante.-20 °C durante hasta 6 meses
Solución de para-nitrofenil fosfato (pNPP)Disolver el paranitrofenil fosfato (pNPP) en el tampón del sustrato hasta una concentración operativa de 1 mg/mL-20 °C durante hasta 12 meses
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)8,0 g de cloruro de sodio (NaCl), 0,2 g de fosfato potásico monobásico (KH2PO4), 1,15 g de fosfato de sodio dibásico (Na2HPO 4), 0,2 g de cloruro potásico (KCl), 0,2 g de azida sódica (NaN 3), disueltos en 1 L de H2O desionizado, pH 7,4.-20 °C durante hasta 12 meses
Anticuerpo primario en el tampón bloqueadorReconstituir el anticuerpo primario liofilizado según las instrucciones del fabricante para obtener el material concentrado. Diluir el stock primario reconstituido de anticuerpos obtenido en el tampón bloqueador a una concentración operativa de 2 μg/mL.-20 °C durante hasta 6 meses
Anticuerpo primario en buffer de recubrimientoReconstituir el anticuerpo primario liofilizado según las instrucciones del fabricante para obtener el material concentrado. Diluir el stock primario de anticuerpos reconstituido obtenido en el tampón de recubrimiento hasta una concentración de trabajo de 2 μg/mL.-20 °C durante hasta 6 meses
Anticuerpo secundario1:1000 de concentrado secundario de anticuerpos: tampón conjugado-20 °C durante hasta 6 meses
Amortiguador de sustrato97 mL de dietanolamina, 0,2 g de azida de sodio (NaN 3), disueltos en 1 L de H2O desionizado, pH 9,8-20 °C durante hasta 12 meses
Buffer de lavado0,5 mL de Tween 20 (0,05% v/v), disuelto en 1 L de PBS, pH 7,5-20 °C durante hasta 12 meses

Tabla 1: Receta para los amortiguadores.

Discusión

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El método de espectrofotometría de inmunofluorescencia se aplicó por primera vez en la cuantificación de calosas en los cormos de plátano. Se basa en el inmunoensayo enzimático (EIA), utilizado para cuantificar la calosa en el extracto crudo 1 M NaOH de plátano utilizando anticuerpos específicos paracallosa 47,51,52. En resumen, este nuevo ensayo de cuantificación específico para callosa basado en espectrofotoproscencia de inmunofluorescencia consistía en recubrir la microplaca con un anticuerpo específico de callosa que luego se une a la calosa en el extracto de la planta, seguido de un anticuerpo secundario también específico para la callosa. Se añade la detección de un anticuerpo vinculado a una enzima (fosfatasa alcalina) y se forma un complejo con el anticuerpo secundario. A continuación, se añade un sustrato, el paranitrofenil fosfato (pNPP). La cuantificación de calosa en la muestra depende de la capacidad de la fosfatasa alcalina para partir los grupos fosfato de las moléculas de pNPP, lo que resulta en la formación de un compuesto de color amarillo (p-nitrofenol). La detección de la intensidad del color amarillo se realizó mediante un espectrofotómetro a 405 nm y la absorbancia se correlacionó con la actividad de fosfatasas alcalinas, que era directamente proporcional a la concentración de calosas presentes en la muestra. La reacción se detuvo aumentando el pH mediante la adición de 0,5 M de NaOH, lo que evitó una mayor actividad de fosfatasa alcalina.

En cambio, el método estándar de oro para localizar y cuantificar la calosa es el método de microscopía de epifluorescencia, un método bien establecido basado en la tinción de calosa con fluorocromo azul de anilina53. En resumen, este método se basa en la unión específica del tinte azul de anilina a beta-1,3-glucanos (callosa), formando un complejo. El azul de anilina en este complejo se excita entonces usando la luz ultravioleta (longitud de onda de 365-375 nm). Cuando el tinte azul de anilina se excita, emite fluorescencia azul que se captura para permitir la visualización específica de la calosa en tejidosvegetales 53. La cuantificación de la calosa teñida de azul de anilina sigue una serie de técnicas de imagen que cuantifican la cantidad de fluorescencia proveniente de los tejidos vegetales. La fluorescencia es proporcional a la cantidad de calosa disponible en los tejidos vegetales. La microscopía de epifluorescencia se ha utilizado en la visualización y cuantificación de calosa en estrésbiótico 54.

En un estudio separado, la deposición de calosa se determinó utilizando tanto microscopía de epifluorescencia como espectrofotometría deinmunofluorescencia 49. Aunque se observaron algunas diferencias en los datos, el análisis estadístico mostró en gran medida la congruencia entre la microscopía de epifluorescencia y los datos de espectrofotometría de inmunofluorescencia, lo que indica consistencia en los dos métodos de detección de calos. Aunque los resultados de ambos métodos fueron en gran medida congruentes, es recomendable que tanto la microscopía de epifluorescencia como la espectrofotometría de inmunofluorescencia se complementen para una evaluación más fiable. Aunque el método basado en ELISA es específico para callosas, sensible y fiable, inicialmente requiere mucho tiempo durante la optimización del protocolo y la obtención de una curva estándar de mejor ajuste que se ajuste a todas las concentraciones y absorbancias.

Algunos de los métodos para cuantificación de calosa sonlaboriosos 17,32,55, y requieren tiempo 26,56, no específicos de callosas ya que el azul anilina puede teñir a otros glucanos β-1,3 además de calosa30, requieren software caro y sofisticado de conteode calosa 23,24,26 , requieren una cantidad considerable de habilidades técnicas y la alta autofluorescencia de fondo/autofluorescencia asociada a la espectrofotometría de fluorescencia hace que la cuantificación de calosa sea difícil e pocofiable 26. Los métodos de cuantificación de callose basados en flujos de trabajo automatizados de análisis de imágenes, como el software ImageJ, requieren un entrenamiento adecuado del complemento de análisis de imágenes, como el Trainable Weka Segmentation (TWS) para ImageJ, y esto es muyengorroso 57.

Los ensayos basados en espectrofotometría de inmunofluorescencia son muy preferidos debido a su especificidad, sensibilidad, facilidad de uso y reproducibilidad. Sin embargo, es importante señalar que el sistema de detección y su sensibilidad pueden variar según el protocolo de ensayo específico y el equipo utilizado.

Aquí se describe un nuevo método de cuantificación de calosas basado en la espectrofotometría de inmunofluorescencia. El método descrito aquí podría aplicarse para la cuantificación de calosas en diferentes tejidos y especies vegetales con un nivel satisfactorio de especificidad a callosa, alta precisión y reproducibilidad. Este método es una adición a los diversos métodos de cuantificación de calosa y puede utilizarse para monitorizar los cambios en los niveles de calosa durante el crecimiento y desarrollo en plantas, así como en respuesta a diversos estímulos o tratamientos. Además, el uso de placas de 96 pozos reduce el muestreo subjetivo y el análisis, haciendo que el método sea adecuado para la cuantificación de calosa de alto rendimiento. Cabe destacar que, aunque la calosa puede extraerse fácilmente de tejidos vegetales reciéncosechados 17,27,55, el paso de preparación de la muestra, que implica la liofilización, incluido en este nuevo protocolo, proporciona una ventaja para conservar las muestras durante mucho tiempo (hasta 1 año) y permite el almacenamiento y envío de muestras biológicas perecederas entre laboratorios distantes a temperaturas ambientes. Esto permite repetir extracciones de calosas sin necesidad de preparar repetidamente todo el experimento para la recogida de muestras nuevas.

Se recomienda la espectrofotometría de inmunofluorescencia para experimentos de cuantificación de calosa de alto rendimiento, mientras que la microscopía de epifluorescencia e inmunofluorescencia pueden utilizarse tanto para la cuantificación de calosa como para la histolocalización de calosa en tejidos vegetales. Para garantizar una distribución espaciotemporal precisa, eficiente y fiable de la calosa en los tejidos vegetales, se recomienda utilizar simultáneamente diferentes métodos de cuantificación de calosa, que incluyen la microscopía, la espectrofotometría y los métodos basados en la actividad enzimática. En consecuencia, esto permitirá comprender de manera precisa y eficiente el papel de la calosa en diversas respuestas fisiológicas y al estrés. Investigaciones futuras podrían evaluar de manera exhaustiva y simultánea varios métodos para la cuantificación de calosas, que incluyen la microscopía de epifluorescencia, la microscopía de inmunofluorescencia, la espectrofotometría de fluorescencia, la espectrofotometría de inmunofluorescencia y los métodos basados en la actividad enzimática.

Divulgaciones

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Los autores declaran no haber conflicto de intereses.

Agradecimientos

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Esta investigación fue financiada por la Fundación Bill & Melinda Gates, subvención número INV 009894/OPP1134098. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio; en la recopilación, análisis o interpretación de datos; en la redacción del manuscrito; o en la decisión de publicar los resultados.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Papel de aluminio  Kim-Fay EA Limited, Nairobi, Kenia
Balance analítico y nbsp;Mettler-Toledo AG, Greifensee, SuizaML204/01
Bateador de cuentas 96BioSpec Products Inc., Bartlesville, OK, EE. UU.1001EUR
Papel secante  Kim-Fay EA Limited, Nairobi, Kenia
Albúmina sérica bovina (BSA) y nbsp;Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.B14
Centrífuga, 5425REppendorf, Hamburgo, Alemania5406000240
Frigorífico combinado-congelador (4 grados; C y &menos; 20 y grados C)y nbsp;Haier Medical and laboratory Co. Ltd., Qingda, ChinaHYCD-282
Dietanolamina y nbsp;PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcelona, España191287
Shaker digital, MixMateEppendorf, Hamburgo, Alemania5353000529
Fosfato de hidrógeno de sodio (Na2HPO4)PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcelona, España141679
Placas ELISA, 96 pozos, base plana, transparentes, poliestireno, alta uniónSarstedt AG & Condado KG, Nü mbrecht, Alemania82.1581.200
Filtro para el lector de microplacas iMark, iMark 680, 405 nmLasec International Pty. Ltd., Ciudad del Cabo, SudáfricaBRD1681011
Liofilizador, VirTis— BenchTop " K” serie; Modelo: 4KBTXLLabWrench, Canadá, EE. UU.448053
Ácido clorhídrico (HCl) y nbsp;PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcelona, España141020
Incubadora de Convección Forzada Isotérmica, IFA-54-8Grupo Esco Lifesciences, Singapur2100002
Laminarina Alfa Aesar, Massachusetts, EE. UU.J66193
Tubos microcentrífugas 1,5 mL Eppendorf, Hamburgo, Alemania022363204
Tubos microcentrífugas 2 mL Genesee Scientific Corp., California, EE. UU.24– 283
Micropipeta (30– 300 & mu; L), 12 canales, serie 2100 y nbsp;Eppendorf, Hamburgo, AlemaniaEP-12-300R
Puntas de micropipeta epT.I.P.S.  SencillosEppendorf, Hamburgo, Alemania022363204
Micropipetas (0,5 y guion; 1000 y mu; L), Investigación  AdemásEppendorf, Hamburgo, Alemania3123000900
Lector de absorbancia de microplacas, iMarkBio-Rad Laboratories, Inc., California, EE. UU.1681135EDU
Microplate Manager 6 Versión 6 software  Bio-Rad Laboratories, Inc., California, EE. UU.1689520
ParafilmPaul Marienfeld GmbH & Compañía KG, Lauda-Kö Nigshofen, Alemania740751
Para-nitrofenil fosfato (pNPP)Merck KGaA, Darmstadt, Alemania20-106
Medidor de pH, HI9126Hanna Instruments, Woonsocket, RI, EE. UU.02310048991
Polivinilpirrolidona (PVP) y nbsp;PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcelona, EspañaA2260
Cloruro de potasio (KCl)PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcelona, EspañaA2939
Di-fosfato de potasio (KH2PO4) PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcelona, España141509
Baño-maria de precisión, GP10Thermo Fisher Scientific Inc., Newinton, CT, EE. UU.TSGP10
Anticuerpo primario (1-3-β-glucan-dirigido IgG de ratón)  Bio supplies Australia Pty Ltd., Melbourne, Australia400-2
Reservorios de reactivos y nbsp;Thermo Fisher Scientific Inc., Massachusetts, EE. UU.15075
Anticuerpo secundario conjugado a fosfatasa alcalina (anti-IgG de ratón) y nbsp;Sigma Life Sciences, Nueva Jersey, EE. UU.A5153
Azida de sodio (NaN3) PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcelona, EspañaA1430
Carbonato sódico (Na2CO3) PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcelona, España141648
Cloruro de sodio (NaCl) PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcelona, EspañaA2942
Carbonato de hidrógeno sódico (NaHCO3) PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcelona, España141638
Hidróxido de sodio (NaOH)PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcelona, España141687.1210
Preadolescente-20Biomatik Corporation, Ontario, CanadáA4031
Agua destilada ultrapuraThermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.10-977-015

Referencias

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