Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Generación de iTenocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas a través de la sobreexpresión combinada de escleraxis y la tensión uniaxial 2D

2.7K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/65837

⸱

1 de marzo de 2024

 ,  , 
1Orthopaedic Stem Cell Research Laboratory, Cedars-Sinai Medical Center, 2Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 4Department of Orthopedics, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center

En este artículo

Resumen

Este artículo describe un procedimiento para producir iTenocitos mediante la generación de células estromales mesenquimales derivadas de iPSC con sobreexpresión combinada de Scleraxis utilizando un vector lentiviral y estiramiento uniaxial a través de un biorreactor 2D.

Resumen

Los desafíos actuales en la reparación de tendones y ligamentos requieren la identificación de un candidato adecuado y eficaz para la terapia basada en células para promover la regeneración de los tendones. Las células estromales mesenquimales (MSC) se han explorado como una posible estrategia de ingeniería de tejidos para la reparación de tendones. Si bien son multipotentes y tienen potencial regenerativo in vivo, están limitados en su capacidad de autorrenovación y exhiben heterogeneidad fenotípica. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) pueden eludir estas limitaciones debido a su alta capacidad de autorrenovación y a su plasticidad de desarrollo sin precedentes. En el desarrollo de los tenocitos, la escleraxis (Scx) es un regulador molecular directo crucial de la diferenciación de los tendones. Además, se ha demostrado que la mecanorregulación es un elemento central que guía el desarrollo y la curación de los tendones embrionarios. Como tal, hemos desarrollado un protocolo para encapsular el efecto sinérgico de la estimulación biológica y mecánica que puede ser esencial para la generación de tenocitos. Las iPSC fueron inducidas a convertirse en células estromales mesenquimales (iMSC) y se caracterizaron con marcadores clásicos de células estromales mesenquimales mediante citometría de flujo. A continuación, utilizando un vector lentiviral, las iMSCs se transducieron a una sobreexpresión estable de SCX (iMSCSCX+). Estas célulasiMSC SCX+ pueden madurar aún más en iTenocitos mediante carga de tracción uniaxial utilizando un biorreactor 2D. Las células resultantes se caracterizaron por la observación de la regulación positiva de los marcadores tendinosos tempranos y tardíos, así como la deposición de colágeno. Este método de generación de iTenocitos se puede utilizar para ayudar a los investigadores a desarrollar una fuente celular alogénica potencialmente ilimitada para aplicaciones de terapia celular tendinosa.

Introducción

Para hacer frente a los problemas contemporáneos en la reparación de tendones y ligamentos, se requiere una célula candidata pertinente adecuada para las terapias basadas en células. Una vía de investigación en ingeniería de tejidos para la reparación de tendones implica la exploración de células estromales mesenquimales derivadas de la médula ósea (BM-MSC) y células estromales derivadas del tejido adiposo (ASC) como posibles estrategias. Estas células tienen capacidad multipotente, gran abundancia y potencial regenerativo in vivo. Además, han demostrado una mayor capacidad de curación y mejores resultados funcionales en modelos animales1. No obstante, estas células exhiben capacidades restringidas de autorrenovación, diversidad fenotípica y, en particular, una capacidad limitada para la formación de tendones. La tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) ofrece una solución a estas limitaciones debido a su notable capacidad de autorrenovación y a su inigualable adaptabilidad al desarrollo. Nuestro equipo de investigación y otros han logrado una diferenciación exitosa de las iPSC en entidades similares a las células estromales mesenquimales (iMSCs)2,3. Como tal, las iMSC tienen el potencial de ser una fuente alogénica para aplicaciones de terapia celular tendinosa.

La escleraxis (SCX) es un factor de transcripción esencial para el desarrollo de los tendones y se considera el marcador detectable más temprano para los tenocitos diferenciados. Además, SCX activa marcadores de diferenciación tendinosa aguas abajo, incluyendo el colágeno de cadena tipo 1a1 1 (COL1a1), mohawk (MKX) y tenomodulina (TNMD), entre otros 4,5,6. Otros genes expresados durante la maduración del tendón incluyen el miembro 3 de la familia de proteínas promotoras de la polimerización de la tubulina (TPPP3) y el receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRa)7. Si bien estos genes son esenciales para el desarrollo y la maduración de los tendones, desafortunadamente no son exclusivos del tejido tendinoso y se expresan en otros tejidos musculoesqueléticos como el hueso o el cartílago 5,7.

Además de la expresión de marcadores durante el desarrollo del tendón, la mecanoestimulación es un elemento esencial para el desarrollo y la cicatrización del tendón embrionario 4,5,6. Los tendones son mecanosensibles y sus patrones de crecimiento cambian en respuesta a su entorno. A nivel molecular, las señales biomecánicas afectan el desarrollo, la maduración, el mantenimiento y las respuestas de curación de los tenocitos8. Se han utilizado varios sistemas de biorreactores para modelar cargas fisiológicas y señales biomecánicas. Algunos de estos sistemas modelo incluyen la carga tisular ex vivo, los sistemas de carga celular 2D que aplican tensión biaxial o uniaxial y los sistemas 3D que utilizan andamios e hidrogeles 9,10. Los sistemas 2D son ventajosos cuando se estudian los efectos de la estimulación mecánica en genes específicos del tendón o en la morfología de las células en el contexto del destino celular, mientras que los sistemas 3D pueden replicar con mayor precisión las interacciones célula-ECM 9,10.

En los sistemas de carga 2D, la tensión entre las células y el sustrato de cultivo es homogénea, lo que significa que la carga aplicada en el citoesqueleto de las células puede controlarse por completo. En comparación con la carga biaxial, la carga uniaxial es fisiológicamente más relevante, ya que los tenocitos están predominantemente sujetos a la carga uniaxial de los haces de colágeno in vivo9. Se encuentra que durante las actividades diarias, los tendones están sometidos a una carga de tracción uniaxial de hasta un 6% de deformación11. Específicamente, estudios previos han encontrado que la carga dentro de los rangos fisiológicos del 4%-5% ha demostrado promover la diferenciación tenogénica al preservar la expresión de marcadores relacionados con tendones como SCX y TNMD, así como el aumento de la producción de colágeno 9,10. Las cepas de más del 10% pueden ser traumáticamente relevantes, pero no fisiológicamente relevantes12,13.

Aquí se presenta un protocolo que tiene en cuenta el efecto sinérgico de la estimulación mecánica y biológica que puede ser esencial para la generación de tenocitos. En primer lugar, describimos un método reproducible para inducir iPSCs en iMSCs a través de la exposición a corto plazo de cuerpos embrioides a factores de crecimiento, confirmado por marcadores de superficie de MSC mediante citometría de flujo. A continuación, detallamos un método de transducción lentiviral para diseñar iMSCs para que tengan una sobreexpresión estable de SCX (iMSCSCX+). Para una mayor maduración celular, los iMSCSCX+ se siembran en placas de silicona recubiertas de fibronectina y se someten a un protocolo de tensión uniaxial optimizado utilizando el biorreactor CellScale MCFX. El potencial tenógeno se confirmó al observar la regulación positiva de los marcadores tendinosos tempranos y tardíos, así como la deposición de colágeno14. Este método de generación de iTenocitos es una prueba de concepto que puede ofrecer una fuente alogénica ilimitada lista para usar para aplicaciones de terapia celular tendinosa.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Este protocolo para producir iTenocytes se puede llevar a cabo en tres pasos principales: iPSC a iMSC (10 días), iMSC a iMSCSCX+ (2 semanas), iMSCSCX+ a iTenocytes (mínimo 4 días). Cada paso importante del protocolo se puede pausar y reiniciar más tarde, según el cronograma experimental. Para los métodos relacionados con el cultivo de células, se deben emplear técnicas estériles. Todas las células de este protocolo deben cultivarse a 37 °C, 5% de CO2 y 95% de humedad.

1. Inducción de iPSC humanas en células estromales mesenquimales inducidas (iMSC)

  1. Preparación del experimento
    1. Preparar el medio de Dulbecco modificado de Iscove - Cuerpos embrioides (IMDM-EB).
      1. Suplementar 50 mL de medio basal IMDM con 8,5 mL de reemplazo sérico knock-out, 500 μL de aminoácidos no esenciales del Medio Esencial Mínimo (MEM), 0,385 μL (110 mM stock) de beta-mercaptoetanol y 500 μL de solución antibiótica-antimicótica (AAS) (concentraciones finales: 17%, 1%, 110 μM, 1%, respectivamente) (ver Tabla de Materiales).
    2. Prepare los medios de células estromales mesenquimales (MSC).
      1. Suplementar 440 mL de Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) bajo en glucosa con 50 mL de suero fetal bovino (FBS), 5 mL de solución antibiótica-antimicótica (AAS) y 5 mL de L-glutamina (concentraciones finales: 10%, 1%, 2 mM, respectivamente).
    3. Prepare placas recubiertas de poli(2-hidroxietilometacrilato) (poli-HEMA).
      1. Agregue 10 g de poli-HEMA (ver Tabla de materiales) a un frasco estéril.
      2. Agregue un agitador magnético a la botella y, mientras revuelve, agregue lentamente 500 ml de EtOH al 95%.
      3. Una vez que se haya agregado todo el EtOH, active el modo de agitación a 1200 rpm con calor lento adicional durante al menos 6 h. La solución poly-HEMA se puede almacenar a temperatura ambiente hasta por un año.
      4. En condiciones estériles, añadir 2,5 μg/cm2 en 9 mL a un matraz T75. Ajuste el volumen de acuerdo con el tamaño del recipiente de cultivo.
      5. Manteniendo la esterilidad, deje que los recipientes se sequen al aire para que el EtOH se evapore por completo antes de su uso. Esto suele tardar entre 24 y 72 horas.
    4. Prepara matraces recubiertos de gelatina.
      1. Lavar una botella de vidrio con NaOH y dedicarla a la preparación de la gelatina. No use detergente.
      2. Preparar solución de gelatina al 1% (5 g de gelatina y 500 ml de agua libre de endotoxinas). Esterilizar en autoclave el frasco de vidrio con la solución de gelatina durante 30 min.
      3. Deje que la solución de gelatina se enfríe y se puede almacenar a temperatura ambiente.
      4. Cubra un matraz T75 con 5 ml de solución de gelatina por matraz e incube durante al menos 1 h antes de sembrar las células. Los frascos recubiertos de gelatina se pueden preparar con 1 día de anticipación.
    5. Prepare el tampón de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
      1. Mezclar PBS con albúmina sérica bovina al 2% y azida sódica al 0,1%. Conservar a 4 °C.
  2. Generación de cuerpos embrioides (EBs)
    NOTA: Las iPSC deben cultivarse en una placa de 6 pocillos y deben alcanzar una confluencia del 70%-80% antes de su uso.
    1. El día 0, coloque una placa de PCR de fondo transparente 384 en la campana de cultivo de tejidos y UV durante 15 minutos sin tapa.
    2. Retire el medio de crecimiento de las iPSC (consulte la Tabla de materiales) y lave los pocillos con PBS.
    3. Añadir 0,5 ml de reactivo de disociación celular suave precalentado (ver Tabla de materiales) a cada pocillo e incubar durante 5 min a 37 °C. Observe las células cada 5 minutos hasta que las iPSC se hayan convertido en células individuales o pequeños agregados levantados en suspensión.
    4. Resuspendió la suspensión celular con una pipeta de 1 ml para garantizar una suspensión de una sola célula.
    5. Centrifugar las celdas a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    6. Retirar el sobrenadante, volver a suspender en medio IMDM-EB (paso 1.1.1) y contar las células viables con un hemocitómetro o un contador de células.
    7. Calcule el volumen apropiado de suspensión celular requerido para lograr 5,000-25,000 celdas por pocillo de la placa de 384 pocillos con 25 μL de suspensión celular por pocillo.
      NOTA: Generalmente, 2-3 pocillos confluentes (70%-80%) de una placa de 6 pocillos pueden producir EB en una placa de 384 pocillos. El tamaño de las células por EB se determinará empíricamente. Para una placa completa de 384 pocillos, se deben utilizar 9,6 ml de suspensión celular, 25 μl por pocillo.
    8. Centrifugar las células de nuevo a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    9. Retirar el sobrenadante y resuspender las células en un volumen adecuado de medio IMDM-EB y 10 μM de diclorhidrato de Y-27632 (stock: 10 mM, 1000x, ver Tabla de Materiales) en un tubo cónico preenfriado de 15 mL.
    10. Agregue la matriz de membrana basal solubilizada en frío (1 mg por placa de 384 pocillos de EB) al cónico (ver Tabla de Materiales).
    11. Distribuya 25 μL de la suspensión celular a cada pocillo. Coloque una tapa estéril en el plato y gírelo a 450 x g a 4 °C durante 7 min. Incubar a 37 °C durante 48 h.
    12. El día 2, transfiera las células a una placa de 100 mm con 3 ml de medios IMDM-EB precalentados.
    13. Transfiera los EB a los matraces T75 recubiertos de poli-HEMA con 10 ml de IMDM-EB. Ajuste el volumen de acuerdo con el tamaño del recipiente de cultivo. Deje que los EB crezcan durante 3 días.
    14. El día 5, transfiera los EB a los matraces T75 recubiertos de gelatina preparados con 10 ml de medios IMDM-EB. Ajuste el volumen de acuerdo con el tamaño del recipiente de cultivo. Cultive los EB durante 3 días más en suspensión.
    15. En el día 8, asegúrese de que se observan dos tipos de EB: EB que están unidos al matraz y EB no conectados. Lave los EB no adheridos del matraz con PBS.
    16. A los EB adjuntos, agregue medios IMDM-EB suplementados con TGFβ-1 (10 ng/mL) (ver Tabla de Materiales) y déjelos crecer durante 2 días.
    17. El día 10, cambie el medio a MSC medio. Las células deben alimentarse dos veces por semana. Una vez que el 70% confluya, proceda al "Protocolo estándar de celdas de elevación" para recubrir las celdas. Vuelva a colocar las células en placas recubiertas de gelatina.
  3. Protocolo estándar de células de elevación
    1. Una vez que las células adherentes hayan alcanzado el 70% de confluencia, aspire el medio de crecimiento de las placas y lávese con PBS.
    2. Levante las células añadiendo 5 ml de tripsina precalentada al 0,25% a cada placa de 150 mm e incube durante 5 minutos a 37 °C. Ajuste el volumen de tripsina de acuerdo con el tamaño del recipiente de cultivo.
    3. Bajo un microscopio, verifique que la mayoría de las células se hayan levantado de cada placa. Si todavía hay células adheridas, golpee suavemente los lados de las placas para desalojarlas.
    4. Recoja las células en un tubo cónico agregando el doble del volumen del medio de crecimiento precalentado.
    5. Centrifugar las células a temperatura ambiente durante 5 min a 300 x g. Retire el sobrenadante y continúe con los siguientes pasos.
  4. Evaluación de citometría de flujo para la expresión del marcador MSC
    NOTA: Las MSC humanas, al igual que las MSC de médula ósea, deben utilizarse como control positivo.
    1. Realice el "Protocolo estándar de células de elevación" (paso 1.3).
    2. Vuelva a suspender el sobrenadante con 3 ml de tampón FACS y transfiera todo el volumen a los tubos FACS.
    3. Centrifugar a temperatura ambiente durante 5 min a 300 x g. Repita el paso de lavado con el tampón FACS dos veces más.
    4. A los tubos teñidos, añadir 2 μL de CD90-FITC antihumano de ratón, CD44-APC antihumano de ratón y CD105-PE antihumano (ver Tabla de materiales) e incubar durante 45 min a 4 °C.
    5. A los tubos de control del isotipo, añadir 20 μL de IgG2a-FITC, IgG1-PB de ratón e IgG1-PE de ratón (véase la tabla de materiales).
    6. Incubar en la oscuridad a 4 °C durante 15 min. Lavar todos los tubos añadiendo 3 ml de tampón FACS y centrifugar durante 5 min a 300 x g (a temperatura ambiente). Vuelva a suspender las células en 250 μL de tampón FACS para cada tubo.
    7. Analizar la expresión de los marcadores de superficie de las MSCs mediante citometría de flujo14. Las longitudes de onda de excitación y emisión deben ser: CD90-FITC, pico de excitación a 495 nm y pico de emisión a 519 nm; CD44-APC, pico de excitación a 640 nm y pico de emisión a 660 nm; CD105-PE, pico de excitación a 561 nm y pico de emisión a 574 nm.

2. Aprobación y expansión de iMSC

  1. Preparación de reactivos
    1. Prepare los medios de congelación MSC.
      1. Combine 30 ml de DMEM bajo en glucosa, 5 ml de DMSO y 15 ml de FBS (concentraciones finales: 60%, 10%, 30%, respectivamente).
      2. Filtrar la solución con un filtro estéril de 0,45 μm. Conservar a 4 °C.
  2. Fallecimiento
    NOTA: Después de la inducción, las iMSC deben cultivarse en placas recubiertas de gelatina durante 2 pasadas adicionales antes de pasar a crecer en placas de cultivo de tejidos de plástico. Además, las celdas deben pasar con una relación de división de 1:3 cuando el 70% confluye.
    1. Realice el "Protocolo estándar de células de elevación" (paso 1.3).
    2. Resuspenda las células en medios MSC y distribuya equitativamente las células en tres nuevas placas de 150 mm de matraces T175 con 20 ml de medio por matraz. Vuelva a colocar las celdas a 37 °C.
    3. Alimente las células dos veces por semana reemplazando el medio de crecimiento con medios MSC precalentados.
  3. Congelación
    1. Realice el "Protocolo estándar de celdas de elevación".
    2. Vuelva a suspender las células en 1 ml de medio de congelación MSC. Añadir 1 ml de suspensión celular a un criovial y almacenar en un recipiente de congelación durante 24 h a -80 °C antes de transferirlo a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
  4. Descongelación
    1. Prepare 10 ml de medios MSC precalentados en un tubo cónico de 15 ml.
    2. Recupere el criovial, sumérjalo en un baño de agua a 37 °C y agite hasta que quede una bola de hielo del tamaño de un guisante (aproximadamente 1-2 minutos).
    3. En la campana de cultivo celular, agregue lentamente 1 ml del medio precalentado al criovial y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
    4. Transfiera la suspensión celular del criovial al tubo cónico preparado de 15 ml con medios precalentados y centrifugue durante 5 minutos a 300 x g (a temperatura ambiente).
    5. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender con medios nuevos. Añadir la suspensión celular a una placa de 150 mm con un volumen total de 20 mL. Ajuste el volumen de acuerdo con el tamaño del matraz de cultivo.
    6. Incubar las células a 37 °C hasta que estén listas para partir.

3. Ingeniería genética de iMSCs para sobreexpresar SCX mediante transducción lentiviral

NOTA: Esta sección del protocolo tarda dos semanas en completarse.

  1. Preparación de medios y reactivos
    1. Prepare medios celulares HEK293T/17.
      1. Suplementar 445 mL de Medio Esencial Mínimo de Eagle (EMEM) con 50 mL de FBS y 5 mL de AAS (concentraciones finales: 10%, 1%, respectivamente).
    2. Prepare los medios de empaquetado de MSC.
      1. Prepare el suero inactivado por calor calentando 50 ml de FBS a temperatura ambiente en un baño de agua a 60 °C durante 30 min.
      2. Combine 445 ml de DMEM bajo en glucosa con el FBS inactivado por calor y 5 ml de L-glutamina (concentraciones finales: 10%, 2 mM, respectivamente).
    3. Preparar complejo de transfección.
      1. Permitir que los componentes del complejo de transfección (ver Tabla de Materiales) se descongelen en hielo: plásmidos de empaquetamiento VSV-G y Delta, plásmido SCX y BioT15,16.
      2. Suavemente vórtice y gire hacia abajo los plásmidos. Mide las concentraciones de ADN.
      3. En función de las concentraciones de ADN y del número de frascos destinados a la transfección, calcule el volumen de cada componente necesario: para un matraz T75, el complejo de transfección consistirá en 750 μL de medio libre de suero (como DMEM o PBS sin suero), 7,5 μg de plásmido SCX, 0,75 μg de plásmido VSV-G, 6,75 μg de plásmido Delta y 22,5 μL de BioT. Considere un extra para el error de pipeteo.
      4. Mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Centrifugar brevemente en una centrífuga. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos y usar inmediatamente.
  2. Transfección y producción lentiviral
    PRECAUCIÓN: A partir del día 3, el protocolo implica trabajar con lentivirus y, por lo tanto, el trabajo debe llevarse a cabo utilizando procedimientos operativos de nivel de contención 2+. Los trabajadores deben usar equipo de protección personal, que incluye dos capas de guantes, cubiertas para las muñecas, gafas de seguridad, una mascarilla, pantalones largos y zapatos cerrados. Todos los residuos y materiales, incluidas las puntas de pipeta, los matraces y el medio líquido, deben descontaminarse con lejía (hipoclorito de sodio final al 1%) durante al menos 20 minutos. No utilice la aspiradora.
    1. Semilla HEK293T/17 células.
      1. Aproximadamente 18-24 h antes de la transfección (día 0), levante y coloque las células 293T en matraces T75. Los siguientes volúmenes asumen T75 como el recipiente de cultivo. Ajuste el volumen de acuerdo con el recipiente de cultivo celular utilizado.
      2. Retire el medio de cultivo de los matraces y lávelos con 5 ml de PBS.
        NOTA: Las células se levantan muy fácilmente de la superficie del matraz. Agregue PBS al costado del matraz y evite la adición directa de solución a las celdas.
      3. Añadir 3 ml de tripsina precalentada al 0,25% a cada matraz e incubar a 37 °C durante 5 min. Recoja las células en un tubo cónico y centrifugue a temperatura ambiente durante 5 minutos a 300 x g.
      4. Retire el sobrenadante, vuelva a suspender en medio 293T y cuente las células viables con un hemocitómetro o un contador de células.
      5. Coloque las células a 5,3 x 104 células/cm2 e incube a 37 °C durante la noche.
      6. Al día siguiente (día 1), prepare el complejo de transfección. Sustituya el medio de crecimiento de las células por 5 ml de medio de envasado de MSC precalentado (paso 3.1.2).
      7. Agregue el complejo de transfección gota a gota a las células. Incline suavemente el plato para asegurar una exposición uniforme del complejo de transfección a las células. Regrese las celdas a la incubadora durante 48 h.
        NOTA: La toxicidad debe observarse después de 24 h (día 2).
      8. Después de 48 h (día 3), recoja cuidadosamente el medio que contiene el virus en un tubo cónico separado con una pipeta y centrifugue durante 5 minutos a 300 x g (a temperatura ambiente).
      9. Agregue 5 ml de medio de envasado MSC precalentado al matraz T75 de células 293T y devuélvalo a la incubadora durante la noche.
      10. Después de la centrifugación, filtre el sobrenadante con un filtro estéril de 0,45 μm pipeteando directamente el sobrenadante a través del filtro. Almacene el medio que contiene virus a 4 °C durante la noche.
      11. Después de otras 24 h (día 4), una vez más recoja cuidadosamente el medio que contiene el virus en un tubo cónico separado con una pipeta y centrifugue durante 5 minutos a 300 x g (a temperatura ambiente).
      12. Combine el virus con el virus del día anterior de la recolección y mezcle para garantizar una solución homogénea. En este punto, el protocolo se puede pausar y reiniciar más tarde, dependiendo de la línea de tiempo experimental. El lentivirus puede ser alícuota y congelado a -80 °C, o el lentivirus puede ser almacenado en hielo mientras se procede con la "Transducción de iMSCs con SCX" (paso 3.3).
        NOTA: Una vez que las alícuotas de lentivirus estén congeladas y descongeladas, no vuelva a congelar.
  3. Transducción de iMSCs con SCX
    1. Realice la transducción de la placa de titulación.
      1. El día 0, realice el "Protocolo estándar de células de elevación".
      2. Vuelva a suspender las células en medios MSC y cuente las células viables con un hemocitómetro o un contador de células.
      3. En una placa de 6 pocillos, agregue 4 x 103 celdas/cm2. Vuelva a colocar el resto en una placa adicional de 150 mm con 20 ml de medios MSC (esta será la placa de control). Incubar las células durante 24 h a 37 °C.
      4. Al día siguiente (día 1), las celdas deben ser ~40% confluentes. Precaliente el medio de crecimiento de empaque de lenti y descongele el polibreno y aproximadamente 3 ml de lentivirus en hielo (o si se hace el mismo día de la recolección del virus, guárdelo en hielo hasta su uso).
      5. Agregue medio de crecimiento de lenti-empaque y lentivirus a los pocillos en función de los títulos deseados (es decir, 12.5%, 25%, 50%, 75%, 100%). Añadir 0,5 μL de polibreno para conseguir una concentración final de 5 μg/mL (concentración de stock: 10 mg/mL, ver Tabla de Materiales).
      6. Gire la placa para asegurar una exposición uniforme a todas las células. Vuelva a colocar la placa en la incubadora a 37 °C durante 48 h.
    2. Evalúe la eficiencia del título de lentivirus SCX con citometría de flujo.
      1. Después de 48 h, realice el "Protocolo estándar de células de elevación".
      2. Vuelva a suspender las células en PBS y cuente las células viables con un hemocitómetro o un contador de células. Centrifugar las células a temperatura ambiente durante 5 min a 300 x g.
      3. Retirar el sobrenadante y volver a suspenderlo en 3 mL de tampón FACS para lavar. Transfiera la suspensión celular a los tubos de citometría de flujo y centrifugue durante 5 min a 300 x g.
      4. Repita el lavado con tampón FACS dos veces más y vuelva a suspender los gránulos celulares finales en 300 μL de tampón FACS. Evaluar la expresión de GFP para cada título utilizando una máquina de citometría de flujo.
      5. Con base en los títulos y los recuentos de viabilidad celular, determine el título de lentivirus apropiado para proceder con la transducción. En este punto, el protocolo se puede pausar y reiniciar más tarde, dependiendo de la línea de tiempo experimental.
    3. Realice transducción SCX a gran escala.
      NOTA: Los volúmenes indicados son por 1 placa de 150 mm o 1 matraz T175. Esto se puede ajustar en consecuencia según el tamaño deseado del recipiente y la escala de transducción.
      1. El día 0, realice el "Protocolo estándar de células de elevación".
      2. Vuelva a suspender las células en medios MSC y cuente las células viables con un hemocitómetro o un contador de células. Siembre las celdas a 4 x 103 celdas/cm2. Incubar las células durante 24 h a 37 °C.
      3. Al día siguiente (día 1), las celdas deben ser ~40% confluentes. Precaliente el medio de crecimiento de envase de lenti y descongele el polibreno y la cantidad precalculada de lentivirus en hielo.
      4. Con base en el título decidido, agregue la cantidad deseada de medio de crecimiento de empaquetamiento de lenti y lentivirus a los pocillos. Añadir 5 μg/mL de polibreno (concentración de stock: 10 mg/mL).
      5. El día 3, observe las células bajo un microscopio fluorescente. El nuevo iMSCSCX+ debería emitir fluorescencia GFP. Sustituya el medio que contiene virus por un medio MSC precalentado. En este punto, el protocolo se puede pausar y reiniciar más tarde, dependiendo de la línea de tiempo experimental.

4. Pasaje y expansión del iMSCSCX+

  1. Realice el paso, la expansión, la congelación y la descongelación de iMSCSCX+ siguiendo lo mismo que para iMSC, como se describe en el paso 2 del protocolo.

5. Carga mecánica

NOTA: Esta sección tarda un mínimo de 4 días, pero puede ser más larga dependiendo de si se observa contracción celular.

  1. Preparación del experimento
    1. Prepara las placas de silicona.
      1. Autoclave 2 placas de silicona (ver Tabla de Materiales). Después, en condiciones estériles, retire las placas de silicona de la bolsa de autoclave y colóquelas en placas de 150 mm.
      2. Combine 130 μL de fibronectina (100x, ver Tabla de Materiales) con 13 mL de PBS estéril en un tubo cónico de 15 mL. Invierte el tubo varias veces para mezclar.
      3. Añadir 400 μL de solución de fibronectina a cada pocillo de las placas de silicona. Incubar las placas a 37 °C durante un mínimo de 2 h o toda la noche.
      4. Antes de usar, aspire la solución de fibronectina y deje que las placas se sequen al aire en la campana de cultivo celular durante al menos 30 minutos para que la solución de fibronectina se evapore por completo.
        NOTA: La solución de fibronectina se puede retirar de los pocillos con anticipación, y las placas ahora recubiertas pueden reposar a 37 ° C hasta un par de semanas hasta su uso.
    2. Prepare el medio estirable MSC.
      1. Prepare los medios estirables de MSC añadiendo 140 μl de ácido ascórbico (stock: 100x, concentración final: 50 μg/mL) a 14 ml de medios MSC precalentados en un tubo cónico de 15 ml.
        NOTA: El ácido ascórbico debe agregarse fresco al medio MSC antes de cada cambio de medio.
  2. Siembra de iMSCSCX+ en las placas de silicona
    1. Realice el "Protocolo estándar de células de elevación" (paso 1.3).
    2. Vuelva a suspender las células en medios MSC y cuente las células viables con un hemocitómetro o un contador de células.
    3. Calcular el volumen de suspensión celular necesario para obtener 1,25 x 104 células/cm2.
    4. Retire este volumen de medios elásticos MSC del tubo cónico de 15 ml. Agregue las celdas de destino. Invertir para homogeneizar la nueva suspensión celular.
    5. Agregue 400 μL de la nueva suspensión celular a cada pocillo de ambas placas de silicona.
    6. Vuelva a colocar la tapa en las placas de 150 mm y devuélvalas a la incubadora a 37 °C durante 24 h.
  3. Tensión uniaxial
    1. Al día siguiente, enjuague el aparato de estiramiento (ver Tabla de Materiales) con ddH2O seguido de etanol al 70%. Limpie el aparato, colóquelo en la campana de cultivo celular y aplique rayos UV durante 15 minutos.
    2. Recupere las placas sembradas y verifique que los pocillos se adhieran bien a las células.
    3. Deje una placa en la incubadora (control estático) y coloque la placa de silicona de segunda semilla en el aparato de estiramiento alineando los tornillos con los orificios de la placa de silicona. Vuelva a colocar la tapa del aparato para garantizar la esterilidad.
    4. Coloque el aparato con la placa de silicona sembrada en la fuente electrónica (consulte la tabla de materiales) y colóquelo en la incubadora a 37 °C.
    5. En el programa, ajuste el protocolo de estiramiento cíclico al 4% de deformación sinusoidal, 0,5 Hz, 2 h por día. Comience el estiramiento presionando el botón de inicio una vez. El estiramiento debe comenzar de inmediato.
    6. Estirar las células durante un mínimo de 3 días. Controle las células diariamente y detenga el protocolo de estiramiento si se puede observar la contracción celular. Cambie el soporte a un nuevo medio estirable MSC cada dos días.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Diferenciación de las iPSCs humanas a las iMSCs
Como se ha descrito anteriormente, el protocolo actual para diferenciar las iPSCs en iMSCs implica la formación de cuerpos embrioides2. Este proceso tarda aproximadamente diez días en inducir iMSCs a partir de iPSCs (Figura 1A). Sin embargo, se recomienda encarecidamente pasar los iMSC recién generados al menos dos veces. Esto no solo ayuda a eliminar la necesidad de placas recubiertas de gelatina, si...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

En este protocolo, los iTenocitos se generan a través de tres pasos principales: (1) inducción de iPSCs a iMSCs, (2) sobreexpresión de SCX utilizando un vector lentiviral y (3) maduración de células a través de tensión uniaxial 2D.

El protocolo presentado para diferenciar las iPSCs en iMSCs ha sido descrito previamente por nuestro grupo2. Desde esa publicación, se han desarrollado numerosos protocolos, incluido un protocolo establecido para el uso de iMSC en ensayos clí...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Todos los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue parcialmente apoyado por el NIH/NIAMS K01AR071512 y CIRM DISC0-14350 a Dmitriy Sheyn. Los dos plásmidos de empaquetamiento de lentivirus fueron un regalo del laboratorio Simon Knott (Departamento de Ciencias Biomédicas, Centro Médico Cedars-Sinai).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-mercaptoetanol Sigma AldrichM3148
AccutaseStemCell Technologies7920reactivo de disociación celular
Solución antibiótica-antimicóticaThermofisher15240096
Anti-CD105Ancell326-050
APC ratón anti-humano CD44BD Biosciences559942
Ratón APC IgG2 K control de isotipoBD Biosciences555745
BenchMark suero fetal bovinoGeminiBio100-106
BiglycanThermofisherHs00959143_m1
Albúmina sérica bovinaMillipore SigmaA3733
Colágeno tipo I alfa 1 cadena humano Taqman primerThermofisherHs00164004_m1
Colágeno tipo III alfa 1 cadena humano Taqman imprimaciónThermofisherHs00943809_m1
DimetilsulfóxidoMillipore SigmaD8418
DMEM, bajo en glucosa, piruvato, sin glutamina, sin rojo fenolThermofisher11054020
Medio esencial mínimo de Eagle (EMEM)ATCC30-2003
Fibronectina plasma bovinoSigma AldrichF1141
FITC ratón anti-humano CD90BD Biosciences555595
Gelatina de piel porcinaSigmaAldrich G1890
Cabra anti ratón IgG1-PEBio-RadSTAR117
HEK 293T/17ATCCCRL-11268
IMDM, sin rojo fenolThermofisher21056023
iPSC: 83i-cntr-33n1Cedars-Sinai iPSC Core FacilityN/Ahttps://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Anticuerpo de control de isotipo, ratón IgG2a-FITCMiltenyi Biotec130-113-271
KnockOut suero de reemplazoThermofisher10828010
ácido L-ascórbicoSigma AldrichA4544
L-GlutaminaThermofisher2503081
MatrigelCorning354230matriz de membrana basal
MechanoCulture FXCellScaleN/Aaparato de estiramiento
MEM solución de aminoácidos no esenciales Thermofisher11140050
Mohawk humano Taqman primer ThermofisherHs00543190_m1
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276
PBSThermofisher10010023
Receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas A humano Taqmanprimer Thermofisher Hs00998018_m1
Poli(2-hidroxietilometacrilato)Sigma Aldrich192066
Reactivos de infección/transfección de PolybreneMillipore SigmaTR-1003
Recombinante humano  TGF-beta 1 proteína humana cebador TaqmanRnD Systems240-B
Scleraxis humano cebador TaqmanThermofisherHs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) humano marcado clon ORFOriGeneRC224305L4
Placas de siliconaCellScaleN/A
Azida sódicaMillipore SigmaS2002
Tenascina C cebador humano TaqmanThermofisherHs00370384_m1
Tenomodulina humano cebador TaqmanThermofisherHs00223332_m1
Trombospondina 4 cebador humano TaqmanThermofisher Hs00170261_m1
Reactivo de transfección, BioTBioland Scientific LLCB01-01
Tripsina-EDTA (0,25%)Thermofisher25200072
Polimerización de tubulina miembro de la familia de proteínas promotoras 3ThermofisherHs03043892_m1
Y-27632 diclorhidratoBiogems1293823

Referencias

  1. Lim, W. L., Liau, L. L., Ng, M. H., Chowdhury, S. R., Law, J. X. Current progress in tendon and ligament tissue engineering. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (6), 549-571 (2019).
  2. Sheyn, D., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiate into functional mesenchymal stem cells and repair bone defects. Stem Cells Translational Medicine. 5 (11), 1447-1460 (2016).
  3. Czaplewski, S. K., Tsai, T. L., Duenwald-Kuehl, S. E., Vanderby, R., Li, W. J. Tenogenic differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells dictated by properties of braided submicron fibrous scaffolds. Biomaterials. 35 (25), 6907-6917 (2014).
  4. Jo, C. H., Lim, H. J., Yoon, K. S. Characterization of tendon-specific markers in various human tissues, tenocytes and mesenchymal stem cells. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (2), 151-159 (2019).
  5. Shukunami, C., et al. Scleraxis is a transcriptional activator that regulates the expression of Tenomodulin, a marker of mature tenocytes and ligamentocytes. Scientific Reports. 8 (1), 3155(2018).
  6. Huang, A. H., Lu, H. H., Schweitzer, R. Molecular regulation of tendon cell fate during development. Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 800-812 (2015).
  7. Harvey, T., Flamenco, S., Fan, C. M. A Tppp3(+)Pdgfra(+) tendon stem cell population contributes to regeneration and reveals a shared role for PDGF signalling in regeneration and fibrosis. Nature Cell Biology. 21 (12), 1490-1503 (2019).
  8. Yang, G., Rothrauff, B. B., Tuan, R. S. Tendon and ligament regeneration and repair: clinical relevance and developmental paradigm. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 99 (3), 203-222 (2013).
  9. Wang, T., et al. In vitro loading models for tendon mechanobiology. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 566-575 (2018).
  10. Wu, S. Y., Kim, W., Kremen, T. J. Jr In vitro cellular strain models of tendon biology and tenogenic differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 826748(2022).
  11. Screen, H. R., Lee, D. A., Bader, D. L., Shelton, J. C. An investigation into the effects of the hierarchical structure of tendon fascicles on micromechanical properties. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 218 (2), 109-119 (2004).
  12. Tatullo, M., et al. Mechanical influence of tissue culture plates and extracellular matrix on mesenchymal stem cell behavior: A topical review. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 29 (1), 3-8 (2016).
  13. Ding, S., Kingshott, P., Thissen, H., Pera, M., Wang, P. Y. Modulation of human mesenchymal and pluripotent stem cell behavior using biophysical and biochemical cues: A review. Biotechnology and Bioengineering. 114 (2), 260-280 (2017).
  14. Papalamprou, A., et al. Directing iPSC differentiation into iTenocytes using combined scleraxis overexpression and cyclic loading. Journal of Orthopaedic Research. 41 (6), 1148-1161 (2023).
  15. Pryce, B. A., Brent, A. E., Murchison, N. D., Tabin, C. J., Schweitzer, R. Generation of transgenic tendon reporters, ScxGFP and ScxAP, using regulatory elements of the scleraxis gene. Developmental Dynamics. 236 (6), 1677-1682 (2007).
  16. Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
  17. Mendicino, M., Bailey, A. M., Wonnacott, K., Puri, R. K., Bauer, S. R. MSC-based product characterization for clinical trials: an FDA perspective. Cell Stem Cell. 14 (2), 141-145 (2014).
  18. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  19. Dunkman, A. A., et al. The tendon injury response is influenced by decorin and biglycan. Annals of Biomedical Engineering. 42 (3), 619-630 (2014).
  20. Liu, H., et al. Crucial transcription factors in tendon development and differentiation: their potential for tendon regeneration. Cell and Tissue Research. 356 (2), 287-298 (2014).
  21. Bloor, A. J. C., et al. Production, safety and efficacy of iPSC-derived mesenchymal stromal cells in acute steroid-resistant graft versus host disease: a phase I, multicenter, open-label, dose-escalation study. Nature Medicine. 26 (11), 1720-1725 (2020).
  22. McGrath, M., Tam, E., Sladkova, M., AlManaie, A., Zimmer, M., de Peppo, G. M. GMP-compatible and xeno-free cultivation of mesenchymal progenitors derived from human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 11(2019).
  23. Lian, Q., Zhang, Y., Liang, X., Gao, F., Tse, H. F. Directed differentiation of human-induced pluripotent stem cells to mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. 1416, 289-298 (2016).
  24. Gaspar, D., Ryan, C. N. M., Zeugolis, D. I. Multifactorial bottom-up bioengineering approaches for the development of living tissue substitutes. FASEB Journal. 33 (4), 5741-5754 (2019).
  25. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  26. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS One. 5 (9), e12905(2010).
  27. Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2017).
  28. Nichols, A. E. C., Werre, S. R., Dahlgren, L. A. Transient scleraxis overexpression combined with cyclic strain enhances ligament cell differentiation. Tissue Engineering Part A. 24 (19-20), 1444-1455 (2018).
  29. Chen, X., et al. Force and scleraxis synergistically promote the commitment of human ES cells derived MSCs to tenocytes. Scientific Reports. 2, 977(2012).
  30. Kataoka, K., et al. In vitro neo-genesis of tendon/ligament-like tissue by combination of mohawk and a three-dimensional cyclic mechanical stretch culture system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 307(2020).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Explorar más artículos

Células madre pluripotentes inducidasgeneración de iTenocitoscélulas estromales mesenquimalesregeneración tendinosaterapia celularestiramiento en biorreactordeposición de colágenoanálisis de expresión génica
Generación de iTenocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas a través de la sobreexpresión combinada de escleraxis y la tensión uniaxial 2D
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.