Lesión por congelación en el músculo masetero de ratón para establecer un modelo de fibrosis muscular orofacial

Los músculos orofaciales son fundamentales en las actividades fisiológicas diarias, como la masticación, el habla, la respiración y^{la expresión facial}. Sin embargo, en las deformidades orofaciales congénitas, estos músculos exhiben alteraciones atróficas y fibróticas, lo que conduce a un deterioro de la salud corporal y de la cognición social². La cirugía reconstructiva facial sigue siendo el tratamiento de primera línea, pero hasta el 30-70% de los pacientes postoperatorios aún sufren pérdida de masa muscular y disfunción muscular ^3,4 El fracaso de la regeneración del músculo orofacial se ha atribuido a factores intrínsecos, que no pueden corregirse solo con cirugía.

La aparición de los músculos orofaciales es una novedad evolutiva, que acompaña a la compleja cabeza de vertebrado y al corazón con cámara ^5,6. A diferencia de sus contrapartes de extremidades derivadas de los somitas, los músculos orofaciales se originan en el arco branquial⁷. Estos caracteres filogenéticos y ontogenéticos pueden predisponerlos a distintos comportamientos regenerativos⁸. Se ha descrito que el músculo masetero (MAS) desarrolló fibrosis severa en el momento en que el músculo tibial anterior (TA) se regeneró completamente después de la exposición al mismo grado de lesión ^1,9. Sin embargo, el mecanismo subyacente de la regeneración sigue siendo poco conocido.

En este estudio, se estableció un modelo de lesión por congelación del músculo masetero de ratones para facilitar la investigación sobre la regeneración del músculo orofacial. Elegimos 14 días después de la lesión como punto de tiempo para evaluar el fenotipo de la fibrosis, ya que fue el punto de tiempo más temprano en el que se detectó una divergencia perceptible entre dos músculos. La regeneración completa del MAS después de una lesión requiere al menos 40 semanas¹. Consistentemente, este estudio reveló una notable deposición de colágeno después de la lesión por congelación de MAS en comparación con la regeneración regular del AT a los 14 días después de la lesión. Con la ayuda de este modelo, se pueden llevar a cabo más estudios mecanicistas de la atrofia muscular y la fibrosis, lo que a su vez ayudará al desarrollo de posibles vías terapéuticas para promover la regeneración del músculo orofacial después de la cirugía.

Todos los procedimientos con animales de este estudio fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética de la Escuela de Estomatología de China Occidental de la Universidad de Sichuan (WCHSIRB-D-2020-114). Los ratones machos C57BL/6 (5 semanas de edad) se criaron en una instalación con humedad controlada (53 ± 2%) y temperatura controlada (23 ± 2 °C) y se sometieron a un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo.

1. Lesión por congelación

1. Anestesia: Sedar a los ratones con bolas de algodón empapadas en isoflurano e inyectar tiletamina-zolazepam por vía intraperitoneal a una dosis de 50 mg/kg. La analgesia pre y postoperatoria se proporcionó mediante inyección intraperitoneal de meloxicam a una dosis de 1 mg/kg. Protege sus ojos con ungüento veterinario. Se colocó una almohadilla térmica mantenida a 38 °C debajo del paño quirúrgico durante todo el procedimiento para proporcionar soporte térmico al animal. Fije a los ratones con cinta adhesiva después de acostarlos de lado sobre una mesa quirúrgica (Figura 1). Evaluar la suficiencia de la anestesia mediante la pérdida del reflejo palpebral, el reflejo de enderezamiento y el reflejo de retirada del pedal.
   NOTA: Cuando aplique anestesia con isofluorano, sostenga el ratón en una mano y la bola de algodón empapada en isofluorano en la otra. Asegúrese de mantener la bola de algodón a distancia del animal para evitar molestias e irritaciones en la piel.
2. Depilación preoperatoria: Utilice una maquinilla de afeitar eléctrica para afeitar el vello de la pantorrilla y la cara del ratón y aplique la pasta depilatoria con un bastoncillo de algodón sobre la piel, cubriendo el músculo masetero y el músculo tibial anterior. Después de 1-2 minutos, lave la pasta con una toallita quirúrgica a base de etanol (Figura 2A y Figura 2G). Los sitios quirúrgicos se desinfectaron con tres rondas de un exfoliante a base de yodo y etanol al 75%.
   NOTA: La maquinilla de afeitar eléctrica por sí sola no era suficiente para la depilación, especialmente en la zona del masetero. A la hora de aplicar la pasta depilatoria, es importante no utilizar una pasta excesiva. Limpie la piel suavemente cuando lave la pasta para evitar quemaduras en la piel.
3. Exposición al campo quirúrgico: Cubrir con paños quirúrgicos antes del procedimiento quirúrgico. Para el músculo MAS, palpa primero a lo largo del borde inferior de la mandíbula. A 5 mm del borde, haga una incisión de 7 mm a lo largo de la línea que conecta la comisura oral con el trago (la línea discontinua indica la ubicación de la incisión en la Figura 2B).
4. Para el músculo TA, palpa primero a lo largo de la pantorrilla para ubicar el borde anterior del hueso de la tibia. Cortar 2 mm detrás del borde a través de la piel con un bisturí, comenzando desde la rodilla y terminando en el tobillo (la línea discontinua indica la ubicación de la incisión en la Figura 2H). Para cada ratón, si el MAS y el músculo TA del lado izquierdo están lesionados, utilice el otro músculo del lado contralateral como control.
   NOTA: Este corte es muy superficial para asegurar que los músculos no se lesionen durante la incisión. La incisión en la cara no debe estar demasiado cerca del trago. De lo contrario, la glándula parótida quedará expuesta, lo que provocará un sangrado excesivo durante el siguiente proceso de congelación.
5. Congelación con hielo seco: Sostenga una pieza de hielo seco con pinzas preenfriadas a lo largo de los ejes largos de los músculos MAS y TA (Figura 2C y Figura 2I, respectivamente). Coloque el hielo seco directamente sobre la superficie del músculo durante 5 s. Confirme que el músculo se ve rígido y de color blanco pálido inmediatamente después de retirar el hielo seco (Figura 2D y Figura 2J), pero que vuelve a su color y textura normales dentro de 22-25 s, similar al músculo adyacente no lesionado (Figura 2E y Figura 2K).
   NOTA: Las pinzas que sujetan el hielo seco deben enfriarse previamente para evitar la sublimación rápida del hielo seco. Un temporizador es obligatorio para realizar la lesión por congelación de 5 s y contar el tiempo de recuperación del músculo de 22 a 25 s. Cualquier músculo con un tiempo de recuperación inferior a 22 s o superior a 25 s debe ser abandonado. Este paso requiere práctica.
6. Cierre de la herida: Después de la recuperación total del músculo, cierre la herida cutánea con al menos tres suturas 7-0 (Figura 2F y Figura 2L).
7. Reanimación: Cuando se complete la sutura, coloque a los ratones en la jaula con soporte térmico y vigílelos continuamente hasta que se hayan recuperado todos los reflejos de adrizamiento.

2. Colección de músculo

1. Eutanasia a los ratones con una sobredosis de isoflurano, seguida de dislocación cervical. Extraiga los músculos MAS y TA en ambos lados para el análisis histológico.
2. Disección del músculo MAS: Cortar la piel de la cara del ratón y extirpar la glándula parótida para exponer la parte posterior del músculo MAS. Diseccionar el MAS desde su inserción anterior hasta su inserción posterior en la mandíbula. El área punteada blanca indica la parte expuesta del MAS (Figura 3A).
   NOTA: El músculo MAS está compuesto por compartimentos profundos y superficiales, ambos estrechamente unidos a la superficie de la mandíbula. Asegúrese de presionar las tijeras contra la mandíbula durante la disección para asegurar el aislamiento completo del MAS. Tenga cuidado de distinguir el cigomático-mandibular del SAM por sus límites entre el cigomático y la mandíbula.
3. Disección del músculo TA: corte la piel desde el tobillo hasta la rodilla y retire la fascia para exponer el músculo TA. Utilice la punta de las pinzas de microdisección para aislar el tendón del TA y deslícelo hasta la rodilla para romper las fibras que se unen a la tibia. Luego, corte el tendón del tobillo (Figura 3B).
   NOTA: Para el músculo TA, hay algunos tendones musculares alrededor del tobillo del ratón; se necesitaría práctica para discernir el tendón de TA, que es el más grande y el más cercano a la tibia.
4. Preenfriamiento de isopentano: Prepare dos barriles de aislamiento; Llene el barril pequeño con isopentano y el barril grande con nitrógeno líquido. Coloque el barril pequeño dentro del barril grande 10 minutos antes de la disección muscular (Figura 3D).
5. Preparación del molde de incrustación: Haga un molde cilíndrico de papel de aluminio para cada muestra y llénelos con compuesto de temperatura óptima de corte (OCT).
6. Fresco congelado: Sumerja el músculo en OCT, manteniéndolo perpendicular al compuesto de OCT (Figura 3C). Utilice un portaagujas para transferir el molde al isopentano preenfriado. Espere 40 s para que la OCT se vuelva blanca y sólida (Figura 3D).
   NOTA: Asegúrese de que la posición del molde no sea demasiado baja. De lo contrario, el isopentano se mezclará con la OCT y perjudicará el proceso de congelación muscular. El nivel de OCT en el molde debe ser comparable a la altura de la muestra de músculo. Evite una cantidad excesiva de OCT para garantizar una congelación rápida y eficiente.
7. Almacenamiento de muestras: Almacene muestras de músculo fresco congeladas en placas de 24 pocillos claramente etiquetadas. Seccione las muestras inmediatamente o guárdelas a -80 °C para su uso a largo plazo.

3. Análisis histológico

1. Utilice un criostato para cortar secciones de 10 μm de espesor de la muestra de músculo en portaobjetos tratados en la superficie.
2. Coloque los portaobjetos en acetona helada durante 20 minutos y séquelos al aire en la campana extractora durante 20 minutos.
3. Lave los portaobjetos durante 3 x 5 minutos con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   NOTA: A partir de este paso, los portaobjetos se mantuvieron en una cámara de humedad para evitar que se secaran.
4. Tinción Sirius Red
   1. Prepare la solución de trabajo de Sirius Red disolviendo 0,5 g de polvo de Sirius Red en 500 ml de ácido pícrico saturado.
   2. Tiñir los portaobjetos con la solución de trabajo Sirius Red durante 1 h a temperatura ambiente.
   3. Lavar los portaobjetos durante 2 x 5 min con ácido acético al 0,5%.
   4. Después del proceso de tinción, las muestras deben deshidratarse primero en etanol al 95% durante 15 s, seguido de deshidratación en etanol anhidro durante 1 min. El último paso consiste en montar el tobogán con bálsamo neutro.
5. Tinción inmunohistológica
   1. Permeabilizar las secciones con Triton al 0,3% en PBS durante 20 min a temperatura ambiente, seguido de un lavado con PBS.
   2. Para la tinción con Pax7, bloquee las secciones con el reactivo proporcionado con el kit de referencia; para la tinción de laminina y Pdgfrα, bloquear con 5% de albúmina sérica bovina (BSA) y 5% de suero de burro en PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
   3. Incubar las secciones con anticuerpos primarios contra Pax7, laminina y Pdgfrα durante la noche a 4 °C, seguido de un lavado con PBS durante 3 x 5 min.
   4. Incubar las secciones con anticuerpos secundarios conjugados con colorante fluorescente durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de un lavado con PBS durante 3 x 5 min.
   5. Incubar con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 3 min a temperatura ambiente, seguido de un lavado con PBS durante 3 x 5 min.
   6. Coloque el medio de montaje en la sección, coloque el cubreobjetos en la parte superior y use esmalte de uñas para sellar el cubreobjetos.

La tinción de HE y Sirius Red (Figura 4 y Figura Suplementaria S1) reveló una regeneración muscular completa de la AT en este modelo de lesión por congelación. Por el contrario, el MAS mostró una regeneración alterada de las miofibras y una deposición excesiva de la matriz extracelular. La histología del músculo MAS y TA intacto se muestra en la Figura 4A,B, donde las miofibras están alineadas y el área fibrótica solo apareció en el espacio intersticial y entre diferentes haces. Mientras que el músculo TA permaneció en gran medida con la misma estructura muscular que su control intacto a los 14 días después de la lesión (Figura 4G-J), la estructura del músculo MAS estaba gravemente alterada (Figura 4C-F). Aparecieron áreas fibróticas en el lugar de casi todas las fibras musculares en las secciones transversales anterior, media y posterior del músculo MAS (Figura 4C-F).

La tinción inmunohistológica de Pax7 (Figura suplementaria S2) y Pdgfrα facilitó la investigación adicional de las células satélite musculares (MuSC) y los progenitores fibroadipogénicos (FAP), respectivamente. En el músculo MAS, a los 14 ppp, aparecieron núcleos densamente poblados pero sin MuSCs proporcionalmente aumentados (Figura 5A,B). Se detectó un gran número de miofibras nucleadas centralmente (mostradas por la punta de flecha azul) en el AT a los 14 ppp (Figura 5H), mientras que el contorno de las miofibras apenas se notó en el MAS en el área lesionada (Figura 5E,F). En cambio, se observó la infiltración de FAPs positivas para Pdgfrα y miofibras de diámetro pequeño recién formadas (señaladas con flechas blancas) (Figura 5F).

Figura 1: Descripción general de la configuración quirúrgica. (A) El ratón fue anestesiado y fijado en la mesa de operaciones. Se le quitó el pelo de la cara y la pierna del lado izquierdo. Se utilizó un temporizador para controlar la congelación muscular y el tiempo de recuperación. (B) El hielo seco, con un diámetro de 3,5 mm y una altura de 6-12 mm, se preparó en un vaso de precipitados de vidrio para congelar. Las pinzas se enfriaron previamente en hielo seco para su uso posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Registro intraoperatorio de la lesión por congelación de MAS y TA. (A) Depilación para congelación de MAS. (B) Abrir la piel para exponer el músculo MAS. (C) Congelación con hielo seco a lo largo del eje largo del MAS. (D) La aparición de MAS inmediatamente después de 5 s de congelación. (E) La aparición de MAS después de 22-25 s de recuperación. (F) Cierre de herida facial. (G) Depilación para congelación de TA. (H) Abra la piel para exponer el músculo TA. (I) Congelación con hielo seco a lo largo del eje largo de TA. (J) La aparición de TA justo después de 5 s de congelación. (K) La aparición de AT después de 22-25 s de recuperación. (L) Cierre de herida en la pierna. Abreviaturas: MAS = masajista; TA = tibial anterior. Las líneas discontinuas en las Figuras 2B y 2H indican la ubicación de las incisiones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Recolección de músculo MAS y TA. (A) La aparición de músculo MAS a los 14 días después de la lesión por congelación. El óvalo discontinuo rojo indica MAS; el triángulo blanco discontinuo muestra la exposición del músculo MAS. (B) La aparición del músculo TA a los 14 días después de la lesión por congelación. El óvalo discontinuo rojo indica TA. (C) Sumerja la muestra de músculo en el compuesto OCT de manera perpendicular. (D) Transfiera la muestra de músculo a isopentano enfriado con nitrógeno. Abreviaturas: MAS = masajista; TA = tibial anterior; OCT = temperatura óptima de corte. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Análisis histológico de los músculos MAS y TA. Tinción roja de Sirius de la sección muscular intacta (A-E) del MAS y secciones anterior, media y posterior del MAS a 14 ppp. (De Padres a Viernes) Sección muscular intacta de TA y sección anterior, media y posterior de TA a 14 dpi. Barra de escala = 100 μm. Abreviaturas: MAS = masajista; TA = tibial anterior; DPI = días después de la lesión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Análisis inmunofluorescente de los músculos MAS y TA. Inmunotinción de Pax7 y DAPI (azul) en (A) MAS intacto, (B) MAS de 14 dpi, (C) TA intacto y (D) TA de 14 dpi. Inmunotinción de laminina, Pax7 y DAPI (azul) en (E) MAS intacto, (F) MAS de 14 ppp, (G) TA intacto y (H) TA de 14 dpi. Barra de escala = 20 μm. Abreviaturas: MAS = masajista; TA = tibial anterior; DPI = días posteriores a la lesión; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Las flechas blancas indican la fibra representativa de pequeño diámetro del MAS. El área punteada y las flechas azules indican las miofibras regeneradoras representativas y los núcleos centrales del AT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria S1: Fibrosis persistente durante la regeneración muscular. (A) Ilustración esquemática de la regeneración muscular TA y MAS inducida por lesión por congelación. (B-G) Imágenes representativas de la tinción de hematoxilina y eosina en secciones transversales de músculos TA y MAS en diferentes puntos de tiempo después de la lesión. Barras de escala = 100 μm. Esta figura se reproduce de Cheng et al.8. Abreviaturas: MAS = masajista; TA = tibial anterior; DPI = días después de la lesión. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: Deterioro del proceso de miogénesis. (A) Imágenes de inmunofluorescencia de Pax7 (verde) y DAPI (azul) en el músculo TA y MAS. (B) Cuantificación del porcentaje de núcleos positivos de Pax7/DAPI. Barra de escala = 100 μm * Indica significativamente diferente del control muscular intacto. # Indica significativamente diferente del otro músculo en el mismo punto de tiempo. **p < 0.01, ##p < 0.01. Esta figura se reproduce de Cheng et al.8. Abreviaturas: MAS = masajista; TA = tibial anterior; DPI = días posteriores a la lesión; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.