Tinción inmunohistoquímica multiplex para tejido de cáncer de pulmón incluido en parafina

La amplificación de la señal de tiramina (TSA), que tiene una historia de más de 20 años, es una clase de técnicas de ensayo que utilizan peroxidasa de rábano picante (HRP) para el marcaje in situ de alta densidad de antígenos diana y se aplica ampliamente en ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA), hibridación in situ (ISH), inmunohistoquímica (IHC) y otras técnicas para la detección de antígenos biológicos. mejorar sustancialmente la sensibilidad de la señal detectada¹. La tinción policromática de ópalo basada en la tecnología TSA ha sido desarrollada recientemente y ampliamente utilizada en varios estudios 2,3,4,5. La tinción tradicional de inmunofluorescencia (FI) proporciona a los investigadores una herramienta fácil para la detección y comparación de la distribución de proteínas en las células y tejidos de varios organismos modelo. Se basa en la unión específica de anticuerpos/antígenos e incluye abordajes directos e indirectos⁶. La inmunotinción directa implica el uso de un anticuerpo primario conjugado con fluoróforos contra el antígeno de interés, lo que permite la detección fluorescente directa mediante un microscopio de fluorescencia. El abordaje de inmunotinción indirecta implica la aplicación de un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos contra el anticuerpo primario no conjugado ^6,7.

Los métodos tradicionales de tinción por inmunofluorescencia de una sola etiqueta pueden teñir solo uno, dos o, en algunos casos, tres antígenos en los tejidos, lo cual es una limitación importante para extraer la rica información contenida en las secciones de tejido. La interpretación de los resultados cuantitativos a menudo depende de la observación visual y la cuantificación precisa mediante software de imágenes, como ImageJ. Existen limitaciones técnicas, como la restricción de especies de anticuerpos, señales débiles de etiquetado fluorescente y superposición de colores de colorantes fluorescentes (Tabla 1). La técnica Opal multiplex IHC (mIHC) se basa en la derivación TSA, que permite la tinción multiplex y el marcaje diferencial de más de 7-9 antígenos en la misma sección de tejido, sin restricción en el origen del anticuerpo primario, pero requiere una alta especificidad del anticuerpo correspondiente contra el antígeno. El procedimiento de tinción es similar al de la tinción de inmunofluorescencia normal, excepto por dos diferencias: cada ronda de tinción implica el uso de un solo anticuerpo y se agrega un paso de elución de anticuerpos. Los anticuerpos unidos al antígeno por enlaces no covalentes pueden eliminarse mediante elución por microondas, pero se conserva la señal fluorescente TSA unida a la superficie del antígeno por enlaces covalentes.

Las moléculas de tiramina (T) activadas marcadas con el colorante están altamente enriquecidas en el antígeno diana, lo que permite una amplificación eficiente de la señal fluorescente. Esto permite el marcaje directo del antígeno sin interferencia de anticuerpos, y luego se puede lograr el marcaje multicolor después de múltiples ciclos de tinción ^8,9,10 (Figura 1). Aunque esta tecnología produce imágenes fiables y precisas para el estudio de la enfermedad, la creación de una estrategia útil de tinción de inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) puede llevar mucho tiempo y ser exigente debido a la necesidad de una amplia optimización y diseño. Por lo tanto, este protocolo de panel multiplex se ha optimizado en un tinción IHQ automatizada con un tiempo de tinción más corto que el del protocolo manual. Este enfoque puede ser aplicado directamente y adaptado por cualquier investigador para estudios inmuno-oncológicos en muestras de tejido humano fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE)¹¹. Además, los métodos para la preparación de portaobjetos, la optimización de anticuerpos y el diseño multiplex serán útiles para obtener imágenes robustas que representen interacciones celulares precisas in situ y para acortar el período de optimización para el análisis manual¹².

El mfIHC incluye principalmente la adquisición de imágenes y el análisis de datos. En cuanto a la adquisición de imágenes, las muestras teñidas complejas marcadas con varios colores deben detectarse con equipos profesionales de imágenes espectrales para identificar las diversas señales de colores mezclados y obtener imágenes de alta relación señal-ruido sin interferencia de la autofluorescencia tisular. Los equipos actuales para la obtención de imágenes espectrales incluyen principalmente microscopios confocales espectrales y sistemas de obtención de imágenes de tejidos multiespectrales. El sistema de imagen tisular multiespectral es un sistema de imagen profesional diseñado para el análisis cuantitativo de cortes de tejido, y su característica más importante es la adquisición de información espectral de la imagen, que proporciona tanto la estructura morfológica como la información de mapeo óptico de muestras de tejido biológico^13,14. Cualquier píxel de la imagen espectral contiene una curva espectral completa, y cada colorante (incluida la autofluorescencia) tiene su espectro característico correspondiente, lo que permite el registro completo y la identificación precisa de señales multietiqueta mezcladas y superpuestas.

En términos de análisis de datos, las muestras marcadas multicolor son extremadamente complejas debido a la estructura morfológica y las células constituyentes de las muestras de tejido. El software ordinario no puede identificar automáticamente diferentes tipos de tejidos. Por lo tanto, el software inteligente de análisis cuantitativo de tejidos se utiliza para el análisis cuantitativo de la expresión de antígenos en regiones específicas 15,16,17,18.

Sobre todo, la tinción de inmunofluorescencia multietiqueta fusionada con la tecnología de imágenes multiespectrales y análisis de patología cuantitativa tiene las ventajas de un gran número de objetivos de detección, tinción efectiva y análisis preciso y, por lo tanto, puede mejorar significativamente la precisión del análisis histomorfológico, revelar la relación espacial entre las proteínas con resolución a nivel celular y ayudar a extraer información más rica y confiable de muestras de secciones de tejido¹⁹ (Tabla 1).

El protocolo está aprobado por las directrices del Comité de Ética del Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan, China. Las muestras de tejido de cáncer de pulmón se obtuvieron durante la cirugía en el Centro de Cáncer de Pulmón del Hospital de China Occidental, y se obtuvo el consentimiento informado de cada paciente.

1. Preparación de la sección de tejido

1. Preparación FFPE
   1. Sumergir los tejidos clínicos en una solución de formalina neutra durante más de 72 h.
   2. Completar el proceso de deshidratación de los tejidos utilizando xileno y soluciones alcohólicas graduadas²⁰.
   3. Realice la inclusión manual de parafina y el corte de tejido con un espesor de sección de 4 μm. Use portaobjetos de microscopio de adhesión para asegurarse de que los cortes de tejido no se caigan.
   4. Hornee los portaobjetos en un horno a 65 °C durante 2 h para asegurarse de que el tejido y los portaobjetos estén secos. Guárdelo en una caja deslizante a temperatura ambiente.
2. Pretratamiento de la sección de tejido
   1. Trate previamente los portaobjetos de tejido en un horno a 65 °C durante 5 min, y luego sumérjalos secuencialmente en soluciones de xileno durante 2 x 15 min, soluciones de etanol anhidro durante 2 x 15 min, solución de etanol al 90% durante 10 min, solución de etanol al 85% durante 10 min, solución de etanol al 80% durante 10 min y solución de etanol al 75% durante 10 min, A continuación, lave los portaobjetos con agua esterilizada durante 3 x 1 min.
      NOTA: Esta técnica experimental solo se puede utilizar para tejido FFPE, no para tejido congelado o fresco, ya que el proceso de reparación de antígenos múltiples a alta temperatura hace que el tejido se caiga del portaobjetos.

2. Optimización del anticuerpo primario

NOTA: Se utilizaron experimentos convencionales de IHQ para determinar las condiciones de incubación de anticuerpos individuales, incluyendo principalmente la concentración de anticuerpos y las condiciones de reparación de antígenos. Consulte las condiciones en el manual de instrucciones de anticuerpos.

1. Utilice una concentración de anticuerpos ligeramente superior al rango de concentración recomendado y valores intermedios.
2. Optimizar las rutinas de tampón de recuperación de antígenos PH6 y PH9 de acuerdo con la ubicación de la expresión de proteínas. Usar PH9 para las proteínas expresadas en el núcleo y usar cualquiera de las dos rutinas (PH6 o PH9) para otras proteínas.

3. Método de tinción mIHC

NOTA: La tinción de mIHC de ópalo es uno de los métodos de mIHC disponibles. En este protocolo experimental de 5 colores, como cada muestra de tejido debe teñirse con cuatro anticuerpos, se necesitan cuatro incubaciones de anticuerpos primarios, incubaciones de anticuerpos secundarios e incubaciones cromogénicas de amplificación de la señal TSA, así como cinco restauraciones de antígenos. Por último, se realiza la tinción de 4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y el sellado con agente de estallido antifluorescente.

1. Preparación del reactivo principal
   NOTA: Determine la cantidad de reactivo que se agregará de acuerdo con el tamaño de los portaobjetos de tejido. Use suficiente volumen para cubrir completamente la sección de tejido (generalmente, 50-150 μL por portaobjetos). Las soluciones de trabajo necesarias para el experimento se preparan de la siguiente manera:
   1. Solución de trabajo del tampón de lavado: diluir el tampón de lavado 20x a 1:20 con agua bidestilada y almacenar a temperatura ambiente.
   2. Solución de trabajo del tampón PH6: Diluir 100x tampón PH6 a 1:100 con agua bidestilada. Preparar antes de usar y almacenar a temperatura ambiente.
   3. Solución de trabajo del tampón PH9: Diluir 50x tampón PH9 a 1:50 con agua bidestilada. Preparar antes de usar y almacenar a temperatura ambiente.
   4. Polímero HRP: Prepare esta solución lista para usar solo para anticuerpos primarios de origen conejo y ratón.
   5. Solución de trabajo de fluoróforos: Reconstituya cada polvo de fluoróforo (excepto el fluoróforo 780) en 75 μL de DMSO. Antes de cada procedimiento, diluya el fluoróforo en diluyente de amplificación 1x a 1:100. Deseche cualquier porción no utilizada de la solución de trabajo de fluoróforos.
   6. Solución de trabajo de fluoróforo 780: Reconstituya TSA-DIG en 75 μL de DMSO y el polvo de fluoróforo 780 en 300 μL de agua bidestilada. Antes del procedimiento, diluya TSA-DIG en diluyente de amplificación 1x a 1:100 y diluya el fluoróforo 780 con diluyente Ab a 1:25.
   7. Solución de trabajo DAPI: Diluir la solución DAPI a 1:50 con agua bidestilada o PBS. Preparar antes de usar y conservar a 4 °C durante no más de 48 h.
      NOTA. Lave los portaobjetos solo con agua doblemente destilada y una solución de trabajo tampón de lavado recién preparada durante este experimento de tinción de fluorescencia multietiqueta. Las secciones de tejido no deben entrar en contacto con el agua del grifo; Los contaminantes en el agua del grifo pueden adherirse a las secciones de tejido y causar autofluorescencia. Mantenga las muestras alejadas de la luz durante todo el experimento.
2. Recuperación de antígenos
   1. Coloque los portaobjetos en una caja de tinción y reparación y llénela con solución tampón de trabajo PH6 o PH9, cúbralos con la tapa y caliéntelos en un horno microondas durante 2 x 8 minutos al 100% de potencia.
      NOTA: Agregue agua doblemente destilada a la caja de reparación durante el proceso de calentamiento para evitar una evaporación excesiva que puede hacer que las rodajas se sequen.
   2. Deje que los portaobjetos se enfríen a temperatura ambiente antes de continuar (30-60 min).
   3. Lave los portaobjetos 3 x 2 min con agua bidestilada. Use un bolígrafo de barrera hidrofóbica para rodear la sección de tejido en el portaobjetos.
3. Bloqueante
   1. Sumerja las secciones de tejido en tampón de lavado, cúbralas con una solución de bloqueo e incube los portaobjetos en una cámara humidificada a temperatura ambiente durante 10 minutos.
4. Incubación primaria de anticuerpos
   1. Retire la solución bloqueante de los portaobjetos y cubra las secciones de tejido con la solución primaria de anticuerpos que funciona. Incubar los portaobjetos en una cámara humidificada durante 1 h a 37 °C en la incubadora o durante la noche a 4 °C en el frigorífico.
      NOTA: No deje que los portaobjetos se sequen.
5. Introducción del polímero HRP
   1. Lave los portaobjetos en solución de trabajo tampón de lavado durante 3 x 2 min. Agregue Polymer HRP directamente gota a gota a las secciones de tejido e incube durante 15 min a temperatura ambiente.
      NOTA: En el caso de los portaobjetos almacenados en el refrigerador, manténgalos a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos antes de lavarlos para eliminar el anticuerpo primario.
6. Generación de amplificación de señal de tiramina (TSA)
   1. Lave el portaobjetos con solución de trabajo tampón de lavado durante 3 x 2 minutos, agregue la solución de trabajo de fluoróforo directamente gota a gota a las secciones de tejido e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lave el portaobjetos con la solución de trabajo del tampón de lavado durante 3 x 2 min.
7. Procedimiento especial para el fluoróforo 780
   NOTA: El fluoróforo 780 es débil y se coloca rutinariamente en último lugar en el esquema de coincidencia de colores de todo el experimento. El fluoróforo 780 no se utiliza normalmente en este protocolo experimental, pero debido a su especificidad, se enumeran sus pasos experimentales.
   1. Introducción de TSA-DIG
      1. Lave el portaobjetos con solución de trabajo tampón de lavado durante 3 x 2 minutos, agregue la solución de trabajo TSA-Drg gota a gota a las secciones de tejido e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.
   2. Tratamiento con microondas
      1. Lave los portaobjetos con una solución de trabajo tampón de lavado durante 3 x 2 min.
      2. Coloque los portaobjetos en una caja de tinción y reparación, llénela con solución reparadora, cúbrala con la tapa y caliéntela en un horno microondas durante 2 x 8 minutos al 100% de potencia. Deje que los portaobjetos se enfríen a temperatura ambiente antes de continuar (30-60 min).
      3. Lave los portaobjetos durante 3 x 2 minutos con agua bidestilada.
   3. Generación de señales de fluoróforo 780
      1. Sumerja las secciones en tampón de lavado, cúbralas con una solución de trabajo de fluoróforo 780 e incube los portaobjetos en una cámara humidificada durante 1 h a temperatura ambiente.
      2. Lave los portaobjetos con una solución de trabajo tampón de lavado durante 3 x 2 min.
         NOTA: NO realice el tratamiento con microondas después de este paso.
   4. Utilice el fluoróforo 780 como último paso de todo el flujo de trabajo y, a continuación, tiña los núcleos directamente con la solución de trabajo DAPI.
      NOTA: Omita el paso 3.7 si no está utilizando el fluoróforo 780.
8. Tratamiento con microondas
   NOTA: Este paso de microondas elimina el complejo HRP primario-secundario y vuelve a exponer los antígenos, lo que permite la introducción del siguiente anticuerpo primario.
   1. Coloque los portaobjetos en una caja de tinción y reparación, llénela con solución tampón de trabajo PH6 o PH9, cúbralos con la tapa y caliéntelos en un horno microondas durante 2 x 8 minutos al 100% de potencia.
   2. Deje que los portaobjetos se enfríen a temperatura ambiente antes de continuar (30-60 min). Lave los portaobjetos 3 x 1 min con agua bidestilada.
   3. Sumerja los portaobjetos en la solución de trabajo del tampón de lavado durante 2 min. Realice la siguiente incubación de anticuerpos.
9. Próxima incubación de anticuerpos
   1. Repita los pasos 3.2 a 3.8 (excepto el paso 3.7).
10. Tinción nuclear celular y sellado de tejidos
    1. Cubra las secciones de tejido con la solución de trabajo DAPI e incube los portaobjetos en una cámara humidificada durante 5 minutos a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos durante 3 x 2 minutos con agua bidestilada.
    2. Retire las gotas de agua de los portaobjetos, agregue 10-20 μL de extintor antifluorescente a cada portaobjetos y selle los portaobjetos con una cubierta de microscopio.
    3. Guarde los portaobjetos terminados a 4 °C, protegidos de la luz, durante más de 1 mes.
       NOTA: Tenga cuidado de evitar las burbujas de aire.

4. Configura el control negativo

1. Procese los portaobjetos de control negativo como los portaobjetos que contienen tejido, pero sin la adición de reactivos como anticuerpos primarios, anticuerpos secundarios, reactivos TSA y DAPI, que se utilizan para eliminar la autofluorescencia tisular al escanear la película.

5. Escaneo totalmente automático de portaobjetos de tejido

NOTA: El equipo utilizado para la obtención de imágenes espectrales es un analizador de cuantificación de tejidos multiespectrales totalmente automatizado, y la visualización de imágenes y análisis de portaobjetos de 5 colores se puede realizar utilizando el sistema de referencia (consulte la Tabla de materiales). El sistema utiliza imágenes multiespectrales para la desmezcla cuantitativa de múltiples fluoróforos y la autofluorescencia tisular.

1. Configure manualmente el tiempo de exposición y el programa de escaneo para cada canal de fluorescencia y confirme que el instrumento ha completado la exposición y el escaneo totalmente automáticos de los portaobjetos de tejido.
   NOTA: La superficie del portaobjetos debe estar limpia y libre de película de agua. Tenga cuidado con la cantidad de sellador: demasiado hará que el cubreobjetos se deslice y que el instrumento informe de un error.

6. Análisis de fluorescencia

1. Haga doble clic en el software (consulte la Tabla de materiales), arrastre el archivo de imagen de fluorescencia multicolor obtenido del escaneo original al software y establezca el tipo de imagen en fluorescencia.
2. Haga clic en el botón Brillo y contraste y verifique los canales en el panel. Haga clic fuera y luego en el canal para seleccionar el canal de fluorescencia de interés. Arrastre la pantalla mínima y la pantalla máxima para ajustar el brillo y el contraste de cada canal.
3. Después del análisis, determine la vista que se va a guardar, haga clic en Mostrar descripción general de diapositivas y Mostrar ubicación del cursor para eliminar estos dos contenidos, mantenga la barra de escala y haga clic en Archivo | Exportar instantánea | Contenido actual del visor para exportar un archivo png.
   NOTA: Cada canal de fluorescencia y una figura combinada deben exportarse para futuros análisis.
4. Para un análisis más detallado de la positividad de las células diana, utilice el software de identificación y segmentación de células²¹ (ver Tabla de materiales).

Optimizamos el esquema de emparejamiento del anticuerpo primario CD8 y los fluoróforos. Ambos conjuntos de resultados de fluorescencia correspondieron exactamente a las mismas condiciones de incubación de anticuerpos en el grupo experimental, excepto por el cambio en el fluoróforo emparejado con anticuerpos. Como se muestra en la Figura 2, hubo una diferencia significativa en la coincidencia de canales de las células T CD8+ con el fluoróforo 480 y el fluoróforo 690. El canal con fluoróforo 690 muestra un fondo fluorescente extremadamente fuerte: la gran área de fluorescencia irregular roja dentro del círculo amarillo muestra color, lo que causa una gran interferencia en el análisis de localización de las células T CD8+ (Figura 2C, D). Sin embargo, el canal con fluoróforo 480 muestra una positividad muy específica de la membrana celular CD8 y sin fondo fluorescente. Por lo tanto, los círculos amarillos muestran una membrana celular positiva muy clara (Figura 2A), lo que ilustra completamente la importancia de la coincidencia de anticuerpos y canales de fluorescencia en este protocolo.

Se examinó la distribución de macrófagos y células T citotóxicas en tejidos de carcinoma escamoso de pulmón de células no pequeñas, y se verificó la expresión de la proteína característica HMGCS1 en células tumorales y células inmunitarias. Como se muestra en la Figura 3, las imágenes se derivaron de QuPath 0.3.2. El panel de mIHQ fueron los fluoróforos 480, 520, 620, 690 y DAPI, y los marcadores de anticuerpos correspondientes fueron CK5/6, un marcador de células de carcinoma escamoso de pulmón; CD8, un marcador de células T; CD68, un marcador de macrófagos; y HMGCS1, que es específico para células tumorales positivas para plasma. Los macrófagos y las células T CD8+ mostraron una fuerte infiltración y se distribuyeron alrededor y dentro de los focos del carcinoma escamoso, mientras que HMGCS1 se expresó ampliamente en el plasma de células del carcinoma escamoso, mostrando una fuerte positividad de las células tumorales.

Figura 1: Flujo de trabajo de la tinción inmunohistoquímica multiplex para tejido FFPE. Abreviatura: FFPE = fijada en formol e incrustada en parafina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Optimización de los protocolos de adaptación para CD8 y fluoróforos. Hubo una diferencia significativa en la coincidencia de canales de las células T CD8+ con el fluoróforo 480 y el fluoróforo 690. Barras de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Tinción inmunohistoquímica multiplexada en carcinoma escamoso de pulmón. La distribución de macrófagos y células T citotóxicas en tejidos de carcinoma escamoso de pulmón de células no pequeñas y la expresión de la proteína característica HMGCS1 en células tumorales y células inmunitarias. CK5/6 es un marcador de células de carcinoma escamoso de pulmón; El CD8 es un marcador de células T; CD68 es un marcador de macrófagos; y HMGCS1 es específico de células tumorales positivas para plasma. Barras de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Comparación entre la tecnología de inmunofluorescencia de marcado múltiple Opal y la tecnología de inmunofluorescencia tradicional.

Todos los autores declaran que no existen conflictos de intereses.