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Artículo de método

Fibras musculares esqueléticas cortas, intermedias y largas intactas obtenidas por disociación enzimática de seis músculos de las extremidades posteriores de ratones: más allá del flexor corto de los dedos

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DOI:

10.3791/65851

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1 de diciembre de 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Physiology and Biochemistry Research Group-PHYSIS, Faculty of Medicine, University of Antioquia

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Describimos un protocolo para obtener fibras disociadas enzimáticamente de diferentes longitudes y tipos a partir de seis músculos de ratones adultos: tres de ellos ya descritos (flexor corto de los dedos, extensor largo de los dedos, sóleo) y tres de ellos disociados con éxito por primera vez (extensor largo del dedo gordo, peroneo largo, peroneo largo de los dedos cuartos).

Resumen

Las fibras musculares esqueléticas obtenidas por disociación enzimática de los músculos de ratón son un modelo útil para experimentos fisiológicos. Sin embargo, la mayoría de los trabajos se ocupan de las fibras cortas del flexor corto de los dedos (FDB), lo que restringe el alcance de los resultados relacionados con los tipos de fibras, limita la cantidad de material biológico disponible e impide una conexión clara entre los fenómenos fisiológicos celulares y los conocimientos bioquímicos y dinámicos previos obtenidos en otros músculos.

Este artículo describe cómo obtener fibras intactas de seis músculos con diferentes perfiles y longitudes de tipo de fibra. Utilizando ratones adultos C57BL/6, mostramos el protocolo de disección muscular y aislamiento de fibras y demostramos la idoneidad de las fibras para estudios transitorios de Ca2+ y su caracterización morfométrica. También se presenta la composición de tipo de fibra de los músculos. Cuando se disociaron, todos los músculos quedaron intactos, fibras vivas que se contraen enérgicamente durante más de 24 h. La BDF dio fibras cortas (<1 mm), peroneo corto (PDQA) y peroneo largo (PL) intermedias (1-3 mm), mientras que los músculos extensor largo de los dedos (EDL), extensor largo de los dedos (EHL) y sóleo liberaron fibras largas (3-6 mm).

Cuando se registraron con el colorante rápido Mag-Fluo-4, los transitorios de Ca2+ de las fibras PDQA, PL y EHL mostraron una cinética rápida y estrecha que recuerda a la morfología tipo II (MT-II), que se sabe que corresponde a las fibras tipo IIX y IIB. Esto es consistente con el hecho de que estos músculos tienen más del 90% de fibras tipo II en comparación con FDB (~80%) y sóleo (~65%). Más allá de la FDB, demostramos por primera vez la disociación de varios músculos, que dan lugar a fibras que abarcan un rango de longitudes entre 1 y 6 mm. Estas fibras son viables y dan transitorios rápidos de Ca2+ , lo que indica que el MT-II se puede generalizar a fibras rápidas IIX y IIB, independientemente de su fuente muscular. Estos resultados aumentan la disponibilidad de modelos para estudios de músculo esquelético maduro.

Introducción

El músculo esquelético maduro de los mamíferos es un tejido multifuncional. Regula fuertemente el metabolismo, es la principal fuente de producción de calor y sus propiedades dinámicas le confieren un papel clave en la respiración, el movimiento de segmentos corporales o el desplazamiento de un punto a otro 1,2,3. El músculo esquelético también es relevante para la fisiopatología de muchas enfermedades, incluidas las hereditarias y crónicas, como las miopatías, las distrofias o la sarcopenia, así como muchas afecciones crónicas no musculares, como las enfermedades cardiometabólicas 3,4,5,6,7,8.

El estudio ex vivo de las propiedades estructurales y funcionales del músculo esquelético maduro en el contexto de la salud y la enfermedad ha sido posible principalmente a través de dos modelos experimentales: músculo entero y fibras aisladas. Enel siglo XX, los investigadores explotaron las propiedades de los músculos extensor largo de los dedos (EDL) intactos, el sóleo, el tibial anterior y el gastrocnemio de diferentes especies pequeñas como modelos fundamentales para aprender sobre las unidades motoras, los tipos de fibras y las propiedades dinámicas, como la fuerza y la cinética de contracción yrelajación.16. Sin embargo, el advenimiento de estudios de biología celular más refinados movió el área hacia el estudio de fibras musculares individuales. Un trabajo pionero permitió entonces aislar fibras intactas del flexor corto de los dedos (FDB) de ratas mediante disociación enzimática para su posterior caracterización 17,18,19. Aunque las fibras FDB también pueden obtenerse por disección manual20, la facilidad y el alto rendimiento de la disociación enzimática de los músculos murinos, además de su idoneidad para una variedad de enfoques experimentales, han hecho que este último modelo sea ampliamente utilizado durante las últimas dos décadas.

Las fibras cortas FDB son adecuadas para estudios electrofisiológicos y otros estudios biofísicos, análisis bioquímicos, metabólicos y farmacológicos, experimentos de microscopía electrónica y de fluorescencia, transfección para enfoques de biología celular o como fuente de células madre en estudios de miogénesis 5,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31,32. Sin embargo, el uso exclusivo de fibras FDB en experimentos musculares reduce el alcance de la investigación que se ocupa de los tipos de fibras y limita la cantidad de material biológico disponible para algunas técnicas metodológicas o para obtener más información de un animal. Estas limitaciones dificultan una clara correlación de los fenómenos fisiológicos celulares con estudios bioquímicos y dinámicos previos realizados en diferentes músculos enteros e intactos (por ejemplo, EDL, sóleo, peroneo).

Superando estas limitaciones, algunos grupos lograron disociar los músculos EDL y sóleo más largos 24,33,34,35,36,37,38,39,40, abriendo la puerta a extender aún más el método a otros músculos relevantes. Sin embargo, el uso de EDL y fibras de sóleo es aún escaso, probablemente debido a la falta de detalles metodológicos para obtenerlas como fibras intactas. Aquí, describimos en detalle cómo aislar fibras de diferentes longitudes y tipos de seis músculos: tres de ellos ya descritos (FDB, EDL y sóleo) y tres de ellos disociados con éxito por primera vez (extensor largo del dedo gordo [EHL], peroneo largo [PL] y peroneo de los dedos del cuarto [PDQA]). Los resultados del presente trabajo confirman que el modelo de fibras disociadas enzimáticamente es apto para una amplia gama de estudios y futuras correlaciones con datos publicados previamente, aumentando así la disponibilidad de modelos para estudios de músculo esquelético maduro.

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Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética en Experimentación con Animales de la Universidad de Antioquia (UdeA) (actas 104 del 21 de junio de 2016 y 005 del 15 de abril de 2021), de acuerdo con la Ley 84 de 1989 y la Resolución 8430 de 1993 expedida por el Gobierno de Colombia y fueron realizados y reportados en cumplimiento de la Zootecnia: Directrices para la presentación de informes sobre experimentos in vivo (ARRIVE)41. Todos los resultados presentados aquí provienen de ratones machos sanos, de 7 a 13 semanas de edad, de 20 a 26 g, C57BL/6. En la Figura 1 se muestra el diseño general de este estudio y el orden de los procedimientos. Todos los detalles de los reactivos, materiales y equipos se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Animales

  1. Aloje un máximo de seis ratones por jaula acrílica, transparente, rectangular, con cama derivada de la madera, en condiciones de temperatura controlada (21 ± 2 °C) y ciclos luz-oscuridad (12:12 h).
  2. Dar a los animales libre acceso a alimentos y agua del grifo en instalaciones específicas para animales libres de patógenos sin enriquecimiento ambiental.

2. Disección

  1. Soluciones, materiales y reactivos
    1. Preparar y filtrar (0,22 μm) las soluciones de trabajo con la siguiente composición (todas las concentraciones en mM):
      1. Tilode: 5,4 KCl, 1 MgCl2, 140 NaCl, 0,33 NaH2PO4, 2 CaCl2, 10 glucosa, 10 HEPES, pH 7,3
      2. Disociación: 2,7 KCl, 1,2 KH2PO4, 0,5 MgCl2, 138 NaCl, 0,1 Na2HPO4, 1 CaCl2, pH 7,4
      3. Solución salina tamponada con fosfato (PBS): 137 NaCl, 8,6 Na2HPO4, 2,8 KH2PO4, pH 7,34
    2. Preparar dos cámaras de disección; estereoscopio; tijeras de funcionamiento; tijeras finas; pinzas finas; y viales de vidrio limpios, transparentes, no cónicos, de 1-1,5 cm de ancho, de 3-4 mL de volumen total con tapones. Disponer de un sistema de estimulación eléctrica de los músculos de las cámaras de disección.
    3. Prepare pipetas de vidrio Pasteur pulidas al fuego de diferentes puntas de ancho: 5, 4, 3, 2 y 1 mm.
    4. Ajuste el baño de agua a 37 °C. Pesar alícuotas de 3 mg de colagenasa tipo 2.
  2. Procedimiento
    1. Sacrificar el ratón utilizando métodos aprobados por el Comité de Ética local. Se recomienda la luxación cervical porque es rápida, menos estresante y evita la exposición a fármacos, que pueden afectar al tejido muscular (como el CO2 o algunos anestésicos). Inicie la disección inmediatamente para obtener mejores resultados.
    2. Coloque el ratón sobre una superficie de espuma y pegue con cinta adhesiva o alfiler las extremidades delanteras. Cortar ambas extremidades traseras por encima de las rodillas con las tijeras de operación, transferir cada una de ellas a una cámara de disección separada y agregar Tyrode frío (10-20 °C) para cubrir el tejido.
      NOTA: Cada extremidad posterior dará seis músculos diferentes en el siguiente orden: FDB, sóleo, EDL, EHL, PL y PDQA. En la Figura 2 y en otros lugares se dan referencias anatómicas detalladas para diseccionar los seis músculos intactos de tendón a tendón42.
    3. Sujete la primera extremidad posterior a la cámara de disección en una posición en la que la cara posterior de las piernas sea visible. Retire la piel con aumento; luego exponga y retire el FDB (Figura 2). Guárdelo en un frasco de vidrio etiquetado con 1 ml de solución de Tyrode.
      NOTA: Se requiere un aumento adecuado y un entrenamiento previo para evitar cualquier corte no deseado en el tejido muscular.
    4. Exponga, retire y guarde el sóleo en un frasco separado con 1 ml de Tyrode. Utilice unas tijeras finas para separar primero el gastrocnemio y luego para retirar el sóleo, como se indica en la Figura 2.
    5. Exponga la cara anterior de la pierna, retire la piel e identifique los tendones distales del tibial anterior y los músculos EDL en el tobillo. Retire y deseche los tibialis; luego corte los tendones distales de la EDL (Figura 2). Continúe la disección hasta retirar el EDL y colóquelo en un vial de vidrio separado con 1 ml de Tyrode.
    6. Extirpe el músculo EHL, que se encuentra justo posterior y medial a la EDL. Comience la disección identificando y siguiendo el tendón hasta el1er dedo, como se indica en el panel correspondiente de la Figura 2. Mantenga el músculo en un frasco de vidrio separado con 1 ml de Tyrode.
    7. Identificar y seguir el tendón más externo del peroneo para cortarlo y extraer el músculo PL (Figura 2). Coloque el músculo en un frasco de vidrio separado con 1 ml de Tyrode.
    8. Identificar y seguir el tendón hasta el4º dígito; córtelo y retire el músculo PDQA (Figura 2). Colóquelo en un frasco de vidrio separado con 1 ml de Tyrode.
    9. Repita el procedimiento con la segunda extremidad posterior.
    10. Reúna ambos músculos del mismo tipo en un frasco de vidrio etiquetado o en una pequeña placa de Petri con solución de Tyrode.
      NOTA: Si se planea diseccionar más de dos pares de músculos durante una sesión de trabajo, contrate a dos investigadores para el procedimiento de disección.

3. Protocolo de aislamiento de fibras musculares

  1. Renueve la solución Tyrode en las cámaras de disección para eliminar los residuos y el pelo de ratón. Vierta los músculos FDB en una cámara de disección, verifique su integridad y transfiéralos a un nuevo frasco de vidrio con 1 ml de solución de disociación. Repita este procedimiento con los músculos EHL, PL y PDQA.
    NOTA: Si un músculo se ve hipercontraído, cortado o no responde a la estimulación eléctrica, no continúe con el siguiente paso del protocolo. En su lugar, optimice el protocolo de disección verificando la calidad de las soluciones (pH, contaminación, osmolaridad) y adquiriendo más habilidades de disección (Figura 1C y Video Suplementario S1).
  2. Realizar cortes longitudinales o diagonales en los músculos sóleo y EDL, siguiendo la orientación de las fibras (Figura 2). Para el sóleo, sigue el tendón central, cortando ~80% de su longitud. Para EDL, simplemente siga uno o dos tendones y corte aproximadamente la misma longitud que para el sóleo. Coloque cada par de músculos en frascos de vidrio con 1 ml de solución de disociación.
    NOTA: Este procedimiento hace que la EDL y el sóleo sean más pequeños y permite que la colagenasa ingrese mejor al tejido. Es obligatorio un aumento suficiente (40-50x), así como tijeras finas y fórceps. Compruebe siempre la integridad de la muestra mediante inspección visual y estimulación eléctrica antes de continuar con el siguiente paso del protocolo de disociación.
  3. Añadir 3 mg de colagenasa tipo 2 (con una actividad de 250-300 U/mg) a cada vial que contenga 1 mL de solución de disociación y un par de músculos. Estandarizar la cantidad exacta de colagenasa teniendo en cuenta la actividad del lote enzimático utilizado.
  4. Incubar los pares de músculos en el baño de agua durante 65-90 min a 36,8-37 °C, agitando suavemente.
    NOTA: Sea riguroso con el control de temperatura. Estandarizar el procedimiento para que los músculos no permanezcan en colagenasa por más de 100 min para evitar daños.
  5. Compruebe los viales con aumento estereoscópico cada 5 minutos después de los 65º minutos de incubación. Cuando los músculos se vean ligeramente ondulados, irregulares y sueltos, agite suavemente el vial y verifique si algunas fibras comienzan a desprenderse fácilmente. Si este es el caso, lavar los músculos con Tyrode a temperatura ambiente para inactivar y eliminar la colagenasa.
    NOTA: El lavado debe hacerse con cuidado, sin tocar los músculos con las pipetas. Comience agregando 0,8 ml de Tyrode y luego retire 0,8 ml de la solución. Repita este procedimiento 4-5 veces y verifique que la solución se vuelva completamente transparente.
  6. Separe más fibras de la mayor parte de los músculos con una trituración muy suave en Tyrode con la ayuda del juego de pipetas Pasteur pulidas al fuego. Comience agitando la solución alrededor del músculo con la pipeta más ancha (punta de 5 mm) y luego tire suavemente de los músculos hacia adentro y hacia afuera de la pipeta 3-4x. Cuando el músculo comience a liberar fibras y se vuelva más delgado, repita el procedimiento con la siguiente pipeta (punta de 4 mm).
    NOTA: Las fibras renderizadas a través de este procedimiento permanecen excitables y se contraen enérgicamente durante más de 24 h, como se ejemplifica con fibras PL, EDL, EHL y sóleo en el vídeo complementario S2, el vídeo complementario S3, el vídeo suplementario S4 y el vídeo complementario S5.

4. Procedimientos experimentales

NOTA: Las fibras aisladas se utilizaron para las estimaciones de la concentración sarcoplásmica de Ca2+ , las mediciones morfométricas y los estudios de expresión de cadenas pesadas de miosina (MHC).

  1. Medición del Ca sarcoplásmico2+ Concentración durante una contracción
    1. Monta un portaobjetos de vidrio limpio en la cámara de baño experimental. Cubra el portaobjetos con 2-3 μL de laminina y déjelo secar durante 30 s antes de verter ~400 μL de la suspensión de fibra sobre el portaobjetos. Deje que las fibras se adhieran a la laminina durante 10-15 minutos a temperatura ambiente.
    2. Monte la cámara experimental en la platina de un microscopio invertido equipado para la epifluorescencia (Figura 3A).
    3. Evocar espasmos individuales para verificar la viabilidad de las fibras mediante la aplicación de pulsos de corriente rectangulares (0,8-1,2 ms) a través de los dos electrodos de platino colocados a ambos lados de la cámara experimental. Incluso cuando se adhiere a la laminina, la contracción de las fibras sigue siendo visible principalmente en los extremos.
    4. Cargue las fibras con 3,5-4,5 μM del colorante rápido Ca2+ Mag-Fluo-4, AM durante 4-5 min en solución de Tyrode. Pasado este tiempo, lavar suavemente con Tyrode para eliminar el tinte extracelular. Deje que el tinte intracelular se desesterifique durante ~ 15-20 minutos en condiciones de oscuridad. Mantenga siempre la temperatura por debajo de 22 °C para evitar la compartimentación del tinte.
      NOTA: Prepare un stock de Mag-Fluo-4, AM en dimetilsulfóxido (DMSO) solamente, de modo que la concentración final de DMSO en la solución de Tyrode de carga sea inferior al 0,5%.
    5. Ilumine la fibra con un diodo emisor de luz (LED) blanco y un conjunto de filtros con las siguientes longitudes de onda para excitación/dicroica/emisión: 450-490/510/515 nm (Figura 3A).
      NOTA: Las fuentes alternativas de excitación incluyen lámparas de fluorescencia de mercurio y xenón. Utilice la intensidad y el tamaño más bajos posibles del punto de excitación para evitar el fotoblanqueo del tinte y el daño a la célula.
    6. Evocar la respuesta de Ca2+ de la fibra (transitorios sarcoplásmicos de Ca2+ ) aplicando pulsos de corriente rectangulares (0,8-1,2 ms) a través de los dos electrodos de platino colocados a ambos lados de la cámara experimental a 20-22 °C.
    7. Recopile y guarde las señales luminosas con un objetivo de larga distancia de inmersión en aceite 40x adecuado para fluorescencia y un tubo fotomultiplicador (PMT) conectado a un digitalizador (Figura 3A y Video complementario S6). Asegure una escala en el software de adquisición de 0-200 unidades arbitrarias (UA) y establezca la fluorescencia en reposo (Frest) del experimento en 10 UA en esa escala modulando el tamaño del punto de excitación y la ganancia del PMT. Una vez estandarizado el procedimiento, mantenga la ganancia sin modificar de un experimento a otro y establezca la escala solo mediante ajustes menores en el tamaño del punto.
      NOTA: Si surgen artefactos de movimiento, use 20-30 μM de N-bencil-p-tolueno sulfonamida (BTS) en la solución de Tyrode.
    8. Analice y calibre las señales de la siguiente manera:
      1. Filtro de paso bajo de toda la traza a 1 kHz.
      2. Calcule el reposo F en 1 s de la traza, ajuste el reposo F a 0 y mida la amplitud de los transitorios Sarcoplásmicos Ca2+ (pico F). Presente la amplitud como en la ecuación (1):
        Fórmula de relación de intensidad de fluorescencia ΔF / F = Fpeak / Frest, ecuación matemática.(1)
      3. Calcular la concentración máxima de Ca2+ ([Ca2+], μM) utilizando la ecuación (2)26 y los siguientes parámetros: constante de disociación in situ (Kd) = 1,65 × 105 μM2, fluorescencia máxima (Fmáx.) de 150,9 UA, fluorescencia mínima (Fmin) de 0,14 UA, concentración de Mag-Fluo-4 [D]T de 229,1 μM 26. Elpico F ya se obtuvo en el paso 4.1.8.2.
        Fórmula de cálculo de la concentración de calcio en análisis bioquímico, mostrando ecuación de equilibrio.(2)
      4. Mida el tiempo de subida del 10 % al 90 % de la amplitud (RT, ms), la duración a la mitad del máximo (HW, ms) y el tiempo de decaimiento del 90 % al 10 % de la amplitud (DT, ms). A continuación, estimamos la cinética de decaimiento de acuerdo con un ajuste con la función biexponencial (ecuación 3):
        Fórmula de decaimiento exponencial, diagrama, análisis de ajuste de datos, modelado de dinámica transitoria.(3)
      5. Guarde los valores de las constantes de tiempo de decaimiento τ1 y τ2 (ms) y las amplitudes A1 y A226.
  2. Medidas morfométricas
    1. Monta un portaobjetos de vidrio limpio en la cámara de baño experimental. Cubra el portaobjetos con 2-3 μL de laminina y déjelo secar durante 30 s antes de verter ~400 μL de la suspensión de fibra sobre el portaobjetos. Deje que las fibras se adhieran a la laminina durante 10-15 minutos a temperatura ambiente.
    2. Evocar espasmos individuales para verificar la viabilidad de las fibras mediante la aplicación de pulsos de corriente rectangulares (0,8-1,2 ms) a través de los dos electrodos de platino colocados a ambos lados de la cámara experimental. Incluso cuando se adhiere a la laminina, la contracción de las fibras sigue siendo visible principalmente en los extremos.
    3. Adquiera imágenes de las fibras vivas utilizando objetivos de 10x y 20x y una cámara de al menos 5 megapíxeles montada en un microscopio de fluorescencia invertida. Almacene las imágenes en archivos . Formato TIFF para análisis offline.
      NOTA: Es posible que se necesite un conjunto de ~ 2-6 imágenes para capturar completamente una fibra larga.
    4. Imagine una regla de calibración de micrómetro de microscopio con el mismo aumento. Almacene las imágenes en archivos . Formato TIFF para análisis offline.
    5. Mida las longitudes y diámetros de las fibras utilizando la herramienta de calibración del software gratuito para análisis de imágenes de la siguiente manera:
      1. Establezca una relación entre los píxeles y la distancia conocida (μm) en las imágenes con la ayuda de la regla de calibración del micrómetro del microscopio utilizando la herramienta Analizar/Establecer escala como se muestra en la Figura Suplementaria S1.
      2. Mida las longitudes una vez de una punta a la otra de la fibra y los diámetros en 2-6 lugares diferentes a lo largo de la fibra (1-2 medidas por imagen, dependiendo de su longitud), como en la Figura Suplementaria S1.
      3. Indique el valor de la longitud (μm o mm) y el promedio de todos los diámetros (μm) medidos por fibra.
  3. Estudios de expresión de cadenas pesadas de miosina
    NOTA: Para obtener detalles sobre la determinación del MHC por inmunofluorescencia43 y electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE)33,44,45,46 en músculos completos, consulte el Archivo Suplementario 1. El protocolo para la tipificación de fibras mediante la determinación por inmunofluorescencia del MHC en la suspensión de fibras aisladas con FDB es el siguiente:
    1. Cubra cada uno de los cinco portaobjetos de vidrio limpios con 2-3 μL de laminina y déjelo secar durante 30 s antes de verter ~ 300 μL de la suspensión de fibra en cada portaobjetos. Deje que las fibras se adhieran a la laminina durante 4 h a temperatura ambiente.
    2. Fije las preparaciones con acetona enfriada por congelación durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    3. Lavar suavemente 3 veces con PBS.
    4. Permeabilizar las membranas celulares con PBS suplementado con Triton X-100 al 0,7% durante 15 min a temperatura ambiente.
    5. Lavar suavemente 3 veces con PBS suplementado con 0,2% de albúmina sérica bovina (BSA) y 0,04% de Triton X-100, y posteriormente bloquear con PBS con 2% de BSA, 2% de suero de cabra y 0,4% de Triton X-100 durante 30 min a temperatura ambiente.
    6. Lavar suavemente 3 veces con PBS suplementado con 0,2% de BSA y 0,04% de Triton X-100 e incubar con los anticuerpos primarios de la siguiente manera:
      1. Diluir cada anticuerpo primario anti-MHC en un vial separado en PBS con BSA al 1 % y Triton X-100 al 0,04 %: anti-I (1:1.500), anti-II (1:600), anti-IIA (utilice medios acondicionados completos del hibridoma) y anti-IIB (1:500).
      2. Incubar cada portaobjetos con un anticuerpo y el portaobjetos restante con PBS como control durante 12-16 h a 4 °C.
        NOTA: En este protocolo, las fibras tipo IIX permanecieron sin etiquetar en todas las muestras.
    7. Lavar suavemente 3 veces con PBS e incubar todos los portaobjetos con el anticuerpo secundario (1:800) acoplado a una molécula verde fluorescente durante 1-2 h a temperatura ambiente.
    8. Tiñir los núcleos con 1 μg/mL de Hoechst durante 15 min.
    9. Lave suavemente 3 veces con PBS, agregue con cuidado 20-40 μL de medio de montaje y coloque un cubreobjetos.
      NOTA: Los intercambios suaves de soluciones y el lavado aseguran que docenas de fibras permanezcan adheridas al portaobjetos, lo que hace que el experimento sea estadísticamente sólido.
    10. Visualice cada portaobjetos utilizando un objetivo de 10x adecuado para fluorescencia y un conjunto de filtros con las siguientes longitudes de onda para excitación/dicroica/emisión: 450-490/510/515 nm y cuente todas las fibras positivas y negativas. Alternativamente, adquiera imágenes de fluorescencia utilizando las mismas condiciones técnicas y una cámara de al menos 5 megapíxeles montada en un microscopio de fluorescencia invertida y guárdelas en . Formato TIFF para análisis offline.
    11. Registre las fibras positivas y negativas de cada portaobjetos en una base de datos y calcule los porcentajes de fibras positivas I, IIA, IIB y II totales en función del número total de fibras presentes en el portaobjetos correspondiente. Calcule el porcentaje de fibras IIX restando la suma de IIA+IIB del porcentaje de fibras II totales. Estimar el porcentaje de fibras híbridas I/IIA restando la suma de I+II de un valor del 100%. Por último, resta el porcentaje de células híbridas del total de I y II para tener las fibras puras de tipo I y II.
      NOTA: En los estudios de composición MHC, los tipos de fibra se designan con una letra mayúscula, mientras que las isoformas se designan con una letra minúscula46.
  4. Tinción de hematoxilina y eosina
    1. Cubra un portaobjetos de vidrio limpio con 2-3 μL de laminina y déjelo secar durante 30 s antes de verter ~300 μL de la suspensión de fibra en el portaobjetos. Deje que las fibras se adhieran a la laminina durante 4 h a temperatura ambiente.
    2. Fijar la preparación con la solución de Carnoy (60% de etanol absoluto, 30% de cloroformo, 10% de ácido acético) durante 5 min a temperatura ambiente.
    3. Incubar con hematoxilina durante 90 s.
    4. Lavar suavemente 3 veces con agua del grifo.
    5. Incubar con eosina Y al 1% preparada en etanol al 70% durante 30 s.
    6. Lavar suavemente 3 veces con agua del grifo.
    7. Sumergir 3 veces en etanol absoluto.
    8. Incubar en xilol durante 60 s.
    9. Agregue 20-40 μL de medio de montaje y visualice con un microscopio convencional. Adquiera imágenes con el aumento deseado utilizando una cámara a color de al menos 5 megapíxeles.

5. Análisis estadísticos y gráficos

NOTA: La unidad experimental es una fibra muscular.

  1. Exprese los resultados como media ± desviación estándar y calcule intervalos de confianza del 95% (IC95%) para algunos análisis.
  2. Para comparar la longitud, el diámetro y la cinética de los transitorios de Ca2+ entre los grupos, se realizaron análisis de varianza (ANOVA) y pruebas post-hoc con la corrección de Bonferroni.
  3. Evaluar la normalidad y la igualdad de varianza utilizando las pruebas de Shapiro-Wilk y Levene, respectivamente.
  4. Considere que las diferencias son significativas cuando p < 0,05.

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Resultados

Concentración de Ca2+ sarcoplasmática durante una contracción
Para demostrar la viabilidad de los experimentos fisiológicos en el conjunto de fibras disociadas y ampliar nuestros hallazgos previos sobre el acoplamiento excitación-contracción (ECC) y los tipos de fibras, se adquirieron transitorios de Ca2+ en fibras de todos los músculos. En primer lugar, FDB (n = 5) y EDL (n = 7) mostraron una cinética de Ca2+ conocida como morfología tipo II (MT-II). Se trata de señal...

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Discusión

Para complementar los modelos disponibles para estudiar la biología del músculo esquelético maduro, aquí demostramos la disociación enzimática exitosa de una variedad de músculos de ratón con fibras cortas, intermedias y largas. Estas fibras permiten la demostración de la generalización de la cinética MT-II de los transitorios de Ca2+ en el músculo esquelético. Además, se clasificaron los tipos de fibras en los músculos enteros intactos. Dado que el FDB es el músculo más utilizado para experimentos fisiológico...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Los autores expresan su agradecimiento al profesor Robinson Ramírez de la UdeA por su ayuda con los animales y algunas fotos y a Carolina Palacios por su apoyo técnico. Johan Pineda de Kaika nos ayudó a configurar las cámaras de color y fluorescencia. Shyuan Ngo, de la Universidad de Queensland, tuvo la amabilidad de revisar el manuscrito. Este estudio fue financiado por el CODI-UdeA (2020-34909 del 22 de febrero de 2021 y 2021-40170 del 31 de marzo de 2022, SIU), y la Oficina de Planeación-UdeA (E01708-K y ES03180101), Medellín, Colombia, a JCC. Los financiadores no participaron en la recopilación y el análisis de datos, ni en la redacción ni en la presentación de manuscritos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivos
Etanol absolutoSigma Aldrich32221
AcetonaMerck179124
AcrilamidaGibco BRL15512-015
Persulfato de amonioPanreac141138.1610
Anticuerpo antimiosina ISigma AldrichM4276Anticuerpo primario
Anticuerpo antimiosina IISigma AldrichM8421Anticuerpo primario
Anticuerpo antimiosina IIAAmerican Type Culture CollectionSC-71Anticuerpo primario. Derivado del hibridoma HB-277
Anticuerpo antimiosina IIBEstudios del desarrollo Banco de hibridomasBF-F3-c Anticuerpo primario
Bis-acrilamidaAMRESCO0172
Albúmina sérica bovinaThermo ScientificB14
Reactivo BradfordMerck1.10306.0500
Azul de bromofenolCarlo Erba428658
Carbonato cálcicoMerck102066
Dicloruro cálcico (CaCl2)Merck2389
CloroformoSigma Aldrich319988
Colagenasa tipo 2WorthingtonCLS-2/LS004176
Consul-MountThermo Scientific9990440
Coomassie Azul brillante R 250 Merck112553
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma AldrichD2650
Dithiothreitol (DTT)AMRESCO0281
Ácido edético (EDTAAMRESCO0322
Eosina YSigma AldrichE4009
GlycerolPanreac 
GlicinaPanreac151340.1067
Suero de cabraSigma AldrichG9023
HematoxilinaThermo Scientific6765015
HEPESAMRESCO0511
Hoechst 33258Sigma Aldrich861405
ImidazolAMRESCOM136
IsopentanoSigma AldrichM32631
LamininSigma AldrichL2020
Mag-Fluo-4, AMInvitrogenM14206Preparado solo en DMSO. El ácido plurónico no es necesario y no debe usarse para evitar el deterioro de la fibra.
MercaptoetanolApplichemA11080100
MetanolProtokimica MP10043
RatonesVariosVarios Para este manuscrito, solo utilizamos ratones C57BL/6. Sin embargo, algunos resultados preliminares han demostrado que el protocolo funciona bien para ratones Swiss Webster de la misma edad y peso.
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
N,N,N',N'-tetrametiletano-1,2-diamina (TEMED)PromegaV3161
N-bencil-p-tolueno sulfonamida (BTS)Tocris1870
Compuesto de corte óptimo (OCT)Thermo Scientific6769006
Anticuerpo secundarioThermo ScientificA-11001Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H + L) anti-ratón de cabra, Alexa Fluor 488
Sulfato de dodecilo de sodioPanreac 
TRIS 0,5 M, pH 6,8 AMRESCOJ832
Tris(hidroximetil)aminometanoAMRESCOM151
Triton X-100AMRESCOM143
MaterialesCámara de
disecciónPortaobjetos
Erie Scientific5951PLUS
Cámara de baño experimentalWarner InstrumentsRC-27NE2 Cámara debaño estrecha con estimulación de campo, ensamblada sobre una plataforma calefactada PH-6
Pinzas finasWorld Precision Instruments500338, 500230
Tijeras finasWorld Precision InstrumentsVannas Tijeras 501778
Pipetas Pasteur de vidrioVariaspuntas
pulidas al fuegoViales de vidrio con tapónVariosVolumen de 2-3 mL
Tijeras de funcionamientoWorld Precision Instruments501223-G
Equipment
CentrifugeThermo ScientificSL 8R
Microscopio confocalOlympusFV1000
CryostatLeicaCM1850
La cámara digitalZeissErc 5s y Axio 305Axio 305, acoplada al estereoscopio Stemi 508, se utilizó para tomar imágenes durante la disección; mientras que Erc 5s o Axio 208, acopladas al microscopio Axio Observer A1, se utilizaron para tomar imágenes de las fibras aisladas y los ensayos
de inmunofluorescencia.Microscopio invertido Mini-Protean IV
acoplado a fluorescenciaZeissAxio Observer A1Acoplado a una fuente de luz, filtros y objetivos adecuados para fluorescencia
FotomultiplicadorHoribaR928 tubo, Hamamatsu, en un fotómetro D104, HoribaAcoplado al puerto lateral del microscopio de fluorescencia
EstereoscopioZeissStemi 508
Estimulador Instrumentos de hierba S6
Baño de agua MemmertWNE-22
XilolSigma Aldrich808691
Software
Software libre para análisis de electroforesisde KentuckyGelBandFitter v1.7http://www.gelbandfitter.org
Software libre para análisis de imágenes y morfometríaInstitutos Nacionales de SaludImageJ v1.54https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Software con licencia para la adquisición y análisis de señales Ca2+Molecular DevicespCLAMP v10.05https://www.moleculardevices.com
Software con licencia para análisis estadísticos y gráficosOriginLabOriginPro 2019https://www.originlab.com/
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