Microscopía de dos fotones para el estudio de los tendones

Resumen

Este artículo describe el proceso de preparación, configuración y obtención de imágenes de tendones mediante microscopía multifotónica. Además, cubre la aplicación de SHG para analizar la alineación de las fibrillas de colágeno y la creación de una representación 3D de los tendones. Esta metodología resulta muy valiosa en la caracterización de las células tendinosas y su MEC durante la lesión y el desarrollo.

Resumen

La microscopía de dos fotones se ha convertido en una potente herramienta para evaluar las células de tejido profundo y caracterizar la alineación de la matriz extracelular (MEC) en varios sistemas biológicos. Esta técnica se basa en interacciones no lineales luz-materia para detectar dos señales distintas: la señal de difusión generada por el segundo armónico (SHG), que facilita la visualización de las fibras de colágeno y su orientación, y la señal de excitación del infrarrojo cercano para obtener imágenes de la autofluorescencia excitada por ultravioleta.

Las imágenes SHG resultan especialmente efectivas en la visualización de fibras de colágeno debido a la estructura cristalina no centrosimétrica del colágeno fibrilar I. Dado que los tendones son tejidos ricos en matriz con un número limitado de células, su alto contenido en colágeno los convierte en candidatos ideales para el análisis mediante microscopía de dos fotones. En consecuencia, la microscopía de dos fotones ofrece un medio valioso para analizar y caracterizar las anomalías del colágeno en los tendones. Su aplicación se extiende al estudio del desarrollo de los tendones, las lesiones, la curación y el envejecimiento, lo que permite la caracterización integral de las células del tendón y sus interacciones con la MEC en diversas condiciones utilizando herramientas de microscopía de dos fotones. Este protocolo describe el uso de la microscopía de dos fotones en la biología de los tendones y presenta una metodología adaptada para lograr imágenes y caracterizaciones efectivas de las células del tendón durante el desarrollo y después de la lesión. El método permite la utilización de secciones microscópicas delgadas para crear una imagen completa de la MEC dentro de los tendones y las células que interactúan con esta matriz. En particular, el artículo muestra una técnica para generar imágenes en 3D utilizando microscopía de dos fotones en modelos animales.

Introducción

Para funcionar correctamente y transmitir la fuerza del músculo al hueso¹, los tendones dependen de los enlaces intermoleculares e intramoleculares entre las fibras de colágeno. El intrincado autoensamblaje, la reticulación y la alineación de las fibras de colágeno dan como resultado el establecimiento de una matriz altamente organizada que contribuye a la resistencia biomecánica y la flexibilidad del tejido tendinoso ^2,3,4. Aunque otras proteínas de la MEC también contribuyen a la estabilidad de la red fibrilar en los tendones⁵, la masa seca del tendón es aproximadamente un 86% de colágeno⁶, y el colágeno I constituye hasta el 96% del contenido total de colágeno ^7,8. En última instancia, esto hace que la estructura del colágeno sea una salida clave de la salud y la función normales del tendón.

Algunas modalidades de imágenes clínicas utilizadas para los tendones son la resonancia magnética y/o la ecografía. Si bien la tecnología de ultrasonido proporciona imágenes de la estructura fascicular del tendón y revela parte de la estructura fibrilar en el tejido⁹, la resolución no es ideal para la cuantificación. La resonancia magnética tiene una mejor resolución espacial que la ecografía, pero sigue siendo limitada. Sin embargo, estos métodos también están limitados en su profundidad potencial de imagen a través de un tejido. En una escala más microscópica, la dispersión de luz de ángulo pequeño y gran angular y la microscopía confocal se pueden utilizar para evaluar la estructura de las fibrillas de colágeno y cualquier anomalía potencial.

Por el contrario, la microscopía de generación de segundos armónicos (SHG) difiere de otros métodos de imagen, ya que puede capturar la capa externa de las fibrillas de colágeno. Las fibrillas de colágeno I en los tendones se organizan de forma uniaxial paralela a través de la MEC del tendón y son de naturaleza no centrosimétrica ^4,10. Estas propiedades se pueden aprovechar para obtener imágenes con un microscopio multifotónico, que puede producir imágenes claras que son hasta 2-3 veces más profundas que las imágenes confocales¹¹. Esto también nos permite generar secciones ópticas del tendón de mejor calidad. Cuando la luz se proyecta en la muestra de interés, se produce una señal SHG y se puede capturar esta dispersión de la luz. En los tendones, esto produce una imagen de la estructura y alineación del colágeno, lo que nos permite evaluar las posibles consecuencias morfológicas y patológicas de tendinopatías, lesiones, etc.

Dado que el colágeno constituye la mayor parte de la masa seca del tendón y contribuye a la función del tendón ^6,12, la alteración de la estructura del colágeno puede afectar las propiedades biomecánicas de los tendones. Por lo tanto, analizar su estructura puede ayudarnos a comprender mejor el impacto y la gravedad de las lesiones, así como a crear una métrica para la eficacia de la curación. En este trabajo se revisa un método que utiliza microscopía multifotónica y SHG para analizar cómo el desarrollo y las lesiones afectan a la estructura y alineación de las fibrillas de colágeno I y para generar imágenes 3D de la MEC tendinosa en modelos animales. Por lo tanto, nuestro método para obtener imágenes de los tendones puede ayudar a los investigadores a caracterizar las células del tendón y la MEC durante el desarrollo o después de una lesión.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) (Protocolo #2013N0000062) y las pautas de la AAALAC en el Hospital General de Massachusetts. BHLHE40 Para el presente estudio se utilizaron ratones hembra heterocigotos o knockout nulos en un fondo Scx-GFP, con una edad de 30 días. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Preparación y fijación de tejidos

1. Para preparar el tejido, se sacrificó a los ratones en una cámara de CO₂ (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente) seguido de una luxación cervical.
2. Para ayudar a reducir la cantidad de pelo que puede adherirse a la muestra de tejido, rocíe el ratón con EtOH al 70% hasta que el pelaje esté saturado. Despelleja las extremidades traseras y luego, con unas tijeras, retira las dos extremidades traseras cortando la articulación de la cadera.
3. Coloque las dos extremidades traseras en un vial de centelleo de 20 ml y sumérjalas en PFA al 4% de modo que el vial se llene. Coloque los viales a 4 °C con agitación durante la noche.
4. Lave las extremidades traseras en 1x PBS a temperatura ambiente (RT) con agitación durante 10 min y repita un total de 3 veces. Sumerja las extremidades traseras en EDTA 0,5 M (pH 8,0) a 4 °C con agitación durante un máximo de 2 semanas, reemplazándolas con EDTA fresco cada 2-3 días.
5. Lavar las extremidades posteriores en 1x PBS a RT con agitación durante 10 min, repitiendo los lavados un total de 3 veces.
6. Sumerja las extremidades en 1x PBS fresco y guárdelas a 4 °C hasta que se utilicen para la obtención de imágenes.

2. Disección del tendón y preparación del tejido para la obtención de imágenes

1. Mientras sujeta el pie con pinzas, deslice un extremo de la hoja de la tijera de resorte (consulte la Tabla de materiales) por debajo del tendón de Aquiles y asegúrese de cortar lo más cerca posible de la unión miotendinosa.
2. Sostenga el extremo miotendinoso cortado del tendón con pinzas y use las tijeras de resorte para cortar el tendón lo más cerca posible del hueso.
   NOTA: Si es necesario, use fórceps para ayudar a mantener el tendón de Aquiles alejado del resto de la extremidad posterior durante el primer corte. Asegúrese de no aplastar ni dañar el tejido, ya que afectará la alineación del colágeno durante la toma de imágenes.
3. Para permeabilizar y tener una contratinción nuclear, sumergir el tendón disecado en PBT (1% Triton-X en PBS) con 0,1% de Draq5 (concentración de stock, 5 mM, ver Tabla de Materiales). Coloque el tendón en un tubo de microcentrífuga de 2 mL y agregue 1 uL de Draq5 a 1 mL de PBT. Incuba durante la noche en RT en una mecedora. Dado que Draq5 es sensible a la luz, cubra los tubos de microcentrífuga con papel de aluminio y proteja las muestras de la luz.
4. Antes de tomar imágenes, retire la solución Draq5 y reemplácela con dPBS. Asegúrese de seguir protegiendo la muestra de la luz.
   PRECAUCIÓN: Draq5 tiene toxicidad de categoría tres y se considera peligroso según el Estándar de Comunicación de Peligros de OSHA. Evite el contacto y deséchelo en un contenedor de residuos etiquetado.
5. Con una herramienta de punzonado de biopsia con un diámetro interior de 6 mm, corte un trozo de espuma de gel (consulte la tabla de materiales) y colóquelo en una placa de Petri pequeña de 60 x 15 mm. Agregue ddH₂O al plato para permitir que la espuma de gel se expanda.
6. Coloque el tendón de Aquiles disecado sobre espuma de gel. Usando un cubreobjetos pegado a una arandela, coloque con cuidado la arandela sobre el tendón hasta que el cubreobjetos haga contacto con el pañuelo. Para evitar problemas al tomar imágenes, asegúrese de que no haya burbujas de aire entre la muestra y el cubreobjetos. Si es necesario, agregue más ddH₂O al plato para cubrir la muestra y la arandela con el cubreobjetos.

3. Obtención de imágenes con un microscopio multifotónico

1. Utilizando un microscopio láser multifotónico FVMPE-RS, objetivo de 25x que se puede sumergir en agua, láser pulsado IR HPDS-O y láser pulsado IR (consulte la Tabla de materiales), localice la muestra y la región de interés que se obtendrán utilizando la trayectoria de luz EPI. Una vez localizada la muestra, coloque la cámara en el extremo miotendinoso o entesial del tendón de Aquiles.
2. Cambie la trayectoria de la luz a LSH, ajuste la configuración del láser IR de Laser 2 a 840 nm y alinee activamente. Ajustar la intensidad del HV para poder ver el tejido y la señal SHG, sin superar el 20%. No ajuste la ganancia y mantenga el desplazamiento igual a 0.
3. A continuación, configure los parámetros de z-stack para adquirir las imágenes de muestra. Utilice un tamaño de escaneo de 1024 x 1024 y establezca el tamaño de paso en 0,4 micras. Las pilas Z son, en promedio, alrededor de 150 cortes, y comienzan desde la vaina exterior y se mueven hacia el centro del tendón hasta que la señal SHG ya no es clara, produciendo secciones ópticas sagitales¹³.
4. Ajuste la potencia del láser al modo Bright Z para permitir la estandarización de la detección de señales. Una vez establecidos los parámetros de inicio/parada de la pila Z, ajuste la intensidad del láser desde 4 al inicio de la imagen y 6 al final de la imagen. Esto ayuda a mantener la consistencia en la señalización SHG a medida que el endoscopio obtiene imágenes más profundas en el tejido.
5. Una vez que se hayan generado las pilas z, procéselas más en ImageJ/FIJI para crear una película de secciones ópticas en orientación transversal. Para ello, abra el software ImageJ/FIJI¹⁴ y haga clic en Image > Stacks > Reslice. Esto nos permitirá tener una visión transversal del tendón de Aquiles, revelando la morfología estrellada de los tenocitos y su orientación en la matriz de colágeno.

Resultados

Este protocolo es útil para caracterizar las células tendinosas y su matriz extracelular (MEC) después de una lesión, durante el desarrollo o en una condición mutante. Con una disección y preparación cuidadosas de la muestra, se pueden generar videos z-stack a través del tejido en una orientación sagital (Video 1 y Video 2). Mediante el uso de ImageJ/FIJI para procesar y recortar las imágenes, se crea una vista transversal del tendón de Aquiles (Vídeos 3 y Vídeo 4). Esto revela la morfología estrellada de los tenocitos y nos permite observar su arquitectura única dentro de la densa matriz de colágeno.

Mediante el uso de microscopía multifotónica y el aprovechamiento de las propiedades cristalinas no centrosimétricas del colágeno I fibrilar, se generaron imágenes de sección óptica de alta resolución que capturan tanto las células del tendón como su matriz. Estas secciones ópticas están aisladas de las pilas z tanto para el BHLHE40 +/-; Scx-GFP y BHLHE40 -/-; Ratones Scx-GFP (Figura 1A, B, respectivamente). Las secciones se toman de la pila z sagital original creada por imágenes 2-P y de la pila z recortada generada con ImageJ/FIJI. Además de esto, también podemos utilizar este método de imagen para analizar cualquier diferencia potencial en la organización del colágeno, la morfología celular, etc., entre los dos ratones.

Figura 1: Sección óptica de BHLHE40 +/-; Scx-GFP y BHLHE40 -/-; Tendón de ratón Scx-GFP. Z-stack se capturó utilizando un microscopio multifotónico. (A) Las secciones ópticas adquiridas de la pila Z muestran la señal SHG y las celdas GFP+/Draq5+ en un BHLHE40 +/-; Scx-GFP (P30, hembra, 14,68 g) y (B) BHLHE40 -/-; Scx-GFP (P30, hembra, 12,16 g). Las secciones sagitales tienen señal SHG incluida, mientras que las secciones transversales no. Las muestras se contratiñeron con Draq5. La SHG captura la matriz de colágeno en el tejido. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: Videos de la pila Z de la vista sagital de BHLHE40 +/-; Tendón de ratón Scx-GFP. Z-stack se capturó utilizando un microscopio de dos fotones. El video muestra la vista sagital del tendón de Aquiles. Las muestras se contratiñeron con Draq5. La SHG captura la matriz de colágeno en el tejido. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 2: Videos de la pila Z de la vista sagital de BHLHE40 -/-; Tendón de Aquiles del ratón Scx-GFP. Z-stack se capturó utilizando un microscopio de dos fotones. El video muestra la vista sagital del tendón de Aquiles en un ratón KO BHLHE40 nulo. Las muestras se contratiñeron con Draq5. La SHG captura la matriz de colágeno en el tejido. Haga clic aquí para descargar este video.

Vídeo 3: Vídeos de la pila Z de la vista transversal de BHLHE40 +/-; Tendón de ratón Scx-GFP. Z-stack se capturó utilizando un microscopio de dos fotones. El video muestra la vista transversal del tendón de Aquiles. Las muestras se contratiñeron con Draq5. La SHG captura la matriz de colágeno en el tejido. Haga clic aquí para descargar este video.

Vídeo 4: Vídeos de la pila Z de la vista transversal de BHLHE40 -/-; Tendón de Aquiles del ratón Scx-GFP. Z-stack se capturó utilizando un microscopio de dos fotones. El video muestra la vista transversal del tendón de Aquiles en un ratón KO BHLHE40 nulo. Las muestras se contratiñeron con Draq5. La SHG captura la matriz de colágeno en el tejido. Haga clic aquí para descargar este video.

Discusión

Este artículo presenta un método para preparar, diseccionar e obtener imágenes del tendón de Aquiles del ratón, utilizando las propiedades cristalinas no centrosimétricas de la ECM del tendón. Los pasos clave en la preparación de tejidos incluyen la permeabilización para las contratinciones y la garantía de la colocación adecuada del tejido en una placa de Petri durante la obtención de imágenes. En lugar de Draq5, Hoechst 33258 se puede utilizar con una dilución 1:100.000¹³, pero se prefiere Draq5 por su alta permeabilidad, fotoestabilidad y fotoblanqueo mínimo. La colocación adecuada del tejido es crucial para evitar burbujas entre el cubreobjetos y el tendón, ya que una orientación incorrecta puede afectar a las imágenes resultantes.

En comparación con otros métodos de microscopía, la microscopía de generación de segundos armónicos (SHG) permite la captura de fibrillas de colágeno y células tendinosas dentro de la matriz¹⁰. Combinados con las contratinciones, estos datos permiten analizar cómo el desarrollo, las lesiones o las mutaciones afectan a la estructura del tendón. La generación de imágenes 3D de la ECM del tendón permite la observación de las secciones ópticas a medida que pasan a través del tendón. Si bien la tecnología multifotónica proporciona una penetración superior en el tejido, todavía tiene limitaciones en la obtención de imágenes a través de todo el tendón de Aquiles, lo que requiere técnicas adicionales como el seccionamiento. Sin embargo, este método permite la producción de aproximadamente 150 secciones ópticas de 0,4 micras con claridad, evitando la perturbación del tejido mediante el corte.

En resumen, este método ofrece información valiosa para caracterizar el desarrollo de los tendones, las lesiones, la curación y el envejecimiento, mediante la obtención de imágenes de las células del tendón y la MEC mediante microscopía multifotónica. El uso de imágenes multifotónicas para secciones ópticas y videos de pila z en todo el tejido proporciona una mejor comprensión de los cambios en la morfología del tendón en condiciones experimentales.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	AM9262
Tubos de microcentrífuga de 2 mL	USA Scientific	1620-2700
vial de centelleo de 20 mL	Sigma-Aldrich	Z190527-1PAK
4% Paraformaldehído	Ciencias de Microscopía Electrónica	50-980-487	Utilice una ampuola de PFA para crear una solución de PFA al 4%
Herramienta de punzón de biopsia de 6 mm	Ted Pella Inc.	15111-60
			Petri de 60 x 15 mm
BHLHE40 ratones knockout nulos o heterocigotos en un fondo Scx-GFP	El Laboratorio Jackson	JAX ID #029732	MGI ID #3717419
Cubreobjetos	Fisher	12-544-F	Puede utilizar cualquier cubreobjetos que abarque el área de la arandela M20
dPBS	Gibco	14190144
Draq5	ABCAM	ab108410
Tijeras finas 21 mm de filo	Fine Science Tools	14060-10
FVMPE-RS láser multifotónico microscopio de barrido	Olympus
Gelfoam Esponja estéril tamaño 50	Pfizer	00009-0323-01
INSIGHT X3-OL Láser pulsado IR	Olympus
MaiTai HPDS-O Láser pulsado	Olympus
Solución salina tamponada con fosfato (1x)	Invitrogen	AM9625	Diluya 10x PBS en agua mili-Q para obtener 1x solución
Arandela plana M20 de acero inoxidable	McMaster-Carr
Triton X-100	MP Biomedicals	807426	Diluir Triton X-100 en dPBS para obtener una solución al 1%
Tijeras de resorte Vannas Filo de corte de 4 mm	Fine Science Tools	15018-10
XLPlan N 25X Lente