Modelo de oclusión transitoria de la arteria cerebral media de accidente cerebrovascular

El accidente cerebrovascular es una enfermedad devastadora que afecta aproximadamente a 15 millones de personas en todo el mundo anualmente, según la OMS. Alrededor de un tercio de los pacientes sucumben a la enfermedad, mientras que otro tercio experimenta una discapacidad permanente. El accidente cerebrovascular es una patología compleja que involucra varios tipos de células, como las células inmunitarias neurales y periféricas, la vasculatura y las respuestas sistémicas¹. La intrincada red de reacciones desencadenadas por el accidente cerebrovascular a nivel de sistemas no se puede replicar actualmente utilizando modelos in vitro . Por lo tanto, los modelos animales experimentales son esenciales para profundizar en los mecanismos de la enfermedad y para desarrollar y probar nuevas terapias. Actualmente, la reperfusión tisular precoz es la única intervención aprobada, ya sea mediante trombólisis con activador tisular del plasminógeno (tPA) o trombectomía endovascular¹.

Las oclusiones de la arteria cerebral media (ACM) son frecuentes en los pacientes con ictus. En consecuencia, inicialmente se desarrollaron modelos de roedores de oclusión transitoria de MCA (tMCAo) en ratas ^2,3,4. Hoy en día, los ratones modificados genéticamente son los animales más utilizados en modelos experimentales de ictus. En este estudio, describimos un modelo mínimamente invasivo de tMCAo intraluminal en ratones. El abordaje se realiza a través de la arteria carótida a nivel del cuello, sin craniectomía.

La duración del período de oclusión es un factor crítico que determina la extensión de la lesión isquémica. Incluso las oclusiones cortas de 10 minutos pueden causar muerte neuronal selectiva sin un infarto aparente, mientras que las oclusiones más largas, que suelen durar de 30 a 60 minutos, dan lugar a algún grado de infarto cerebral. A diferencia de las ramas proximal y distal de la ACM que irrigan la corteza y tienen colaterales, las arterias lenticulo-estriadas que suministran sangre al cuerpo estriado carecen de colaterales⁵. Como consecuencia, hay una mayor reducción del flujo sanguíneo en el cuerpo estriado que en la corteza después de la tMCAo. Así, las oclusiones de 30 min o menos afectan generalmente al cuerpo estriado pero no a la corteza, mientras que las oclusiones más largas, a partir de los 45 min, suelen generar una lesión isquémica en todo el territorio de la ACM, incluyendo el cuerpo estriado y la corteza dorsolateral.

Para garantizar el bienestar de los ratones, administramos analgésicos antes del procedimiento y utilizamos anestesia durante la cirugía. Sin embargo, la anestesia puede potencialmente introducir alteraciones artificiales en la fisiología del ratón y afectar algunas medidas de resultado⁶. La intervención quirúrgica, cuando es realizada por personal experimentado, suele durar unos 15 minutos para inducir la ACMo. Posteriormente, el tiempo total bajo anestesia depende del período de oclusión. Para los experimentos en los que minimizar la anestesia es crucial, un paso alternativo en el procedimiento implica suspender la anestesia durante el período de oclusión y limitarla solo a los pasos quirúrgicos para insertar y retirar el filamento que ocluye el MCA. Este abordaje reduce la duración de la anestesia y minimiza sus potenciales efectos artefactuales sobre el modelo experimental ^7,8. Por lo tanto, el método de inducción de isquemia focal transitoria se presenta por oclusión intraluminal de la ACM con dos variantes: con el ratón anestesiado durante todo el período de oclusión o con el ratón despierto durante este período. En cualquier caso, se debe realizar una cirugía simulada en paralelo a la intervención realizada en los ratones isquémicos. Además, se proporcionan datos sobre la evaluación de los resultados medidos por pruebas de comportamiento y resonancia magnética en varios momentos después de la reperfusión. Por último, se discuten los principales factores a tener en cuenta a la hora de implementar el procedimiento experimental.

El trabajo con animales se llevó a cabo siguiendo las leyes catalanas y españolas (Real Decreto 53/2013) y las Directivas Europeas, con la aprobación del Comité Ético de Experimentación Animal (CEEA) de la Universidad de Barcelona, y de los organismos reguladores locales de la Generalitat de Catalunya. Los estudios se informan de acuerdo con las directrices ARRIVE. Este procedimiento está diseñado para ser realizado en ratones adultos, a partir de las 8 semanas de edad, sin límite de edad. Aquí se proporcionan ejemplos del procedimiento quirúrgico desarrollado en ratones C57BL/6 de 10-12 semanas de edad. Se deben tener en cuenta las diferencias anatómicas en función de la cepa del ratón.

1. Preparación animal

1. Antes de comenzar el procedimiento quirúrgico, reúna y esterilice todos los materiales y herramientas necesarios. Prepare la mesa de operaciones con todos los materiales quirúrgicos necesarios (enumerados en la Tabla de Materiales).
2. Anestesiar al animal mediante inhalación de isoflurano en una mezcla de oxígeno y óxido nitroso (30%/70%).
3. Administrar buprenorfina (ver Tabla de materiales) por vía subcutánea a una dosis de 0,05 mg/kg de peso corporal para proporcionar analgesia y aliviar cualquier dolor y molestia.
   NOTA: La analgesia es obligatoria, pero se aceptan diferentes protocolos. Los signos de dolor y malestar también deben controlarse durante los primeros días después de la ACMc (ver paso 4). Aplicar soluciones correctivas cuando sea necesario.
4. Colocar al animal en una caja de inducción anestésica (ver Tabla de Materiales) con isoflurano al 5% hasta que alcance un estado de anestesia profunda (pérdida del reflejo en la punción de la pata y reflejo ocular).
5. Coloque el ratón en la mesa de operaciones y disminuya el nivel de isoflurano al 1,5%, administrado por la mascarilla. Aplique ungüento veterinario para evitar la sequedad ocular durante el procedimiento.
6. Mantener la temperatura corporal a 37 ± 0,5 °C controlada por una sonda rectal conectada a una almohadilla térmica (ver Tabla de Materiales).
7. Afeitar la parte ventral del cuello y la cabeza (calvaria) con una maquinilla de afeitar eléctrica. Retire con cuidado los restos de pelo y desinfecte las áreas de la piel tres veces con movimientos circulares con desinfectante a base de yodo y alcohol al 70%.
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2. Evaluación del flujo sanguíneo cerebral (CBF) con flujometría Doppler láser (LDF)

1. Con unas tijeras, haz una incisión en la piel de la cabeza, en dirección a la sutura sagital, desde las orejas hasta la zona entre los ojos.
2. Retraiga la piel y retire el periostio del lado derecho del cráneo.
3. Encuentre las coordenadas (2,5 mm laterales desde Bregma) y fije el soporte Doppler (ver Tabla de Materiales) con cianoacrilato. Después de que el pegamento se haya secado, conecte la sonda Doppler y verifique la lectura correcta de la señal.

3. Oclusión transitoria de la arteria cerebral media (tMCAo)

1. Gire el ratón a la posición supina y fíjelo a la mesa quirúrgica con cinta médica.
2. Haz una incisión en la línea media del cuello. Tire lateralmente hacia atrás de la piel y las glándulas salivales usando retractores (ver Tabla de Materiales) para exponer el territorio carotídeo.
3. Identificar la anatomía vascular de la arteria carótida común (ACC), la ACI y la ECA, así como las diferentes arterias derivadas de ellas (maxilar y lingual, tiroides superior, occipital y pterigopalatina) (Figura 1A).
4. Separe las arterias principales del tejido conectivo adyacente para que puedan ser manipuladas.
   NOTA: Tenga especial cuidado de no dañar los nervios, especialmente el nervio vago, que corre paralelo al CCA.
5. Envuelva una sutura de seda 6-0 (ver Tabla de Materiales) alrededor de la ECA en la bifurcación maxilar/lingual. Asegure firmemente un nudo para interrumpir permanentemente la circulación.
6. Pase una segunda sutura alrededor de la misma arteria, entre el primer nudo y la bifurcación de la CCA, y mantenga este nudo suelto.
7. Coloque un tercer hilo alrededor del CCA y haga un nudo corredizo que se pueda desatar fácilmente.
   NOTA: Esto también se puede llevar a cabo con un clip vascular, pero el hilo permite más movimiento y flexibilidad. En esta etapa es posible observar una primera disminución de CBF en la señal LDF.
8. Colocar una pinza vascular (ver Tabla de Materiales) que interrumpa la circulación sanguínea desde la ICA.
9. Haga una pequeña incisión en el ECA, cerca del área donde se encuentra el nudo apretado.
10. Inserte el monofilamento hasta que la capa gruesa haya entrado completamente en la luz arterial.
11. Apriete el segundo nudo para sujetar el monofilamento dentro de la arteria y evitar que la presión ejercida por la sangre la empuje hacia afuera (Figura 1B).
12. Retire el clip vascular de la ICA.
13. Corte el ECA por debajo del primer nudo y gire el tocón para orientarlo en la dirección del ICA (Figura 1C).
14. Avance el monofilamento a través del ICA hasta el punto donde se ramifica el MCA.
    NOTA: La oclusión se refleja en una caída abrupta del flujo sanguíneo en la lectura de LDF. Consideramos una oclusión exitosa cuando la caída del CBF es superior al 70% del valor basal. Si no se dispone de sistemas de medición de CBF, el punto de oclusión se puede notar por la resistencia al avance, que en ratones adultos suele estar a unos 11 mm de la bifurcación del CCA.
    1. Si se continúa con la anestesia durante el período de oclusión, controle al ratón y manténgalo bajo observación constante durante 45 minutos.
    2. En caso de que el ratón se despierte durante el período de oclusión, suturar la piel del cuello con varios puntos. Sin desconectar la sonda LDF, coloque el ratón en la caja con temperatura controlada, lo que permite la recuperación de la anestesia.
       NOTA: Es común que el ratón exhiba un comportamiento de círculos espontáneos durante este período, lo que indica una oclusión exitosa.
    3. Después de 40 min, anestesiar de nuevo al ratón siguiendo los mismos procedimientos de anestesia y desinfección indicados en los puntos 1.4, 1.5 y 1.7. Vuelva a colocarlo en la mesa quirúrgica y retire los puntos del cuello.
15. Después de 45 minutos de oclusión, afloje el nudo que mantiene el monofilamento en su lugar. Tire lenta y suavemente del filamento y compruebe que se produce la recanalización del tejido.
16. Saca el filamento y aprieta el nudo para evitar la pérdida de sangre.
17. Desata el nudo CCA. Asegúrese de que no haya daños en la pared arterial.
18. Retire los retractores y vuelva a colocar los músculos, las glándulas y la piel. Suturar la piel (6-0) y aplicar desinfectante.
19. Desconecte la sonda Doppler y separe el soporte. Suturar y desinfectar la piel de la cabeza.
20. Durante el período de recuperación de la anestesia, deje al ratón en una jaula provista de un calentador para mantener la temperatura. Manténgalo bajo observación constante hasta que esté completamente recuperado de la anestesia. Después de la recuperación, el ratón puede ser devuelto a su jaula.
    NOTA: Viviendas con enriquecimiento social son muy recomendables. Sin embargo, nunca mezcle ratones operados con ratones no operados en la misma jaula sin ninguna separación física para evitar la agresión.

4. Cuidados postoperatorios

1. Supervisar periódicamente a los animales siguiendo los procedimientos y normas establecidas según la normativa local. Proporcionar tratamiento analgésico en el horario adecuado para minimizar el dolor después de la cirugía.
   NOTA: En el presente estudio se aplicó el mismo analgésico que al inicio de la intervención (Buprenorfina 0,05 mg/kg de peso corporal) a las 6 h y 24 h después de la cirugía.
2. Realizar la eutanasia cuando los parámetros de supervisión así lo indiquen, siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente.
3. Controlar diariamente el peso de los animales. Proporcione alimentos blandos a los animales durante los primeros días después de la cirugía. Además, hidratarlos mediante inyección subcutánea de suero fisiológico (200 μL) inmediatamente después de la cirugía y periódicamente a partir de entonces si se observa que el ratón no se hidrata por sí solo. Organice la comida y el agua de una manera que sea fácilmente accesible para el animal.
4. Una vez que se completa el estudio in vivo , anestesiar a los ratones, sacrificarlos y extraer el tejido cerebral para un análisis histopatológico adicional (si es necesario).

Existen diferentes enfoques para evaluar el resultado del procedimiento tMCAo. Aquí se utilizan métodos de neuroimagen (IRM) in vivo y pruebas de comportamiento.

Los ratones desarrollan lesiones isquémicas en el cerebro, afectando principalmente al territorio irrigado por el ACM ipsilateral a la oclusión, como el cuerpo estriado y la corteza dorsolateral. Existen varios métodos para determinar la extensión de la lesión, incluida la tinción tisular con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC), la tinción histológica (hematoxilina/eosina, acetato de tionina) y modalidades de neuroimagen in vivo como la RMN. En este caso, se ha optado por la resonancia magnética debido a su naturaleza no invasiva y a la capacidad de utilizar el mismo tejido para otros estudios, lo que proporciona una evaluación exhaustiva de la lesión en cada ratón. Además, la resonancia magnética permite realizar mediciones repetidas en los mismos animales, lo que aumenta la reproducibilidad de los resultados y, a menudo, reduce el número de animales necesarios para un estudio.

En las sesiones de RM se utilizó el mismo protocolo de anestesia con isoflurano (inducción 5%, mantenimiento 1,5%). Para la evaluación del volumen de la lesión, se utilizó una secuencia rápida ponderada en T2 (T2w turbo RARE fast spin-echo)9 para minimizar el tiempo de anestesia del animal, lo cual es importante cuando se van a realizar estudios longitudinales con adquisiciones de RM en diferentes momentos en los mismos ratones. Este procedimiento permite evaluar los cambios en la lesión a lo largo del tiempo en los mismos animales, y es muy útil cuando se aplica para estudios de neuroprotección o para probar la eficacia de fármacos, entre otros. Los experimentos de imagen se llevaron a cabo en un escáner horizontal de animales de 7T. Las especificaciones técnicas de la secuencia anatómica (pueden diferir en función de la intensidad del campo magnético): T2_TurboRARE; 22 secciones coronales; 0,5 mm de espesor; tiempo de eco (TE) = 33 ms; tiempo de repetición (TR) = 2336.39 ms. 2 promedios. Ángulo de giro, 90°; campo de visión (FOV) = 20 mm x 20 mm, con un tamaño de matriz de 256 x 256. La Figura 2A muestra un ejemplo representativo de imágenes de RM de la evolución de la lesión en el mismo ratón, evaluadas a los 40 min, 6 h, 24 h y 48 h después de la reperfusión. La progresión del volumen de la lesión tarda horas o aproximadamente dos días en completarse. La cuantificación del volumen de la lesión muestra esta evolución a lo largo del tiempo (Figura 2B).

Se han descrito diversas escalas neurológicas para evaluar el deterioro neurológico causado por la lesión isquémica. Sugerimos el uso de pruebas de neuroscore que han sido ampliamente descritas en manuscritos anteriores. Por ejemplo, se recomienda la prueba reportada en detalle por Orsini et al. (2012)10 .

Existe una amplia variedad de pruebas conductuales, principalmente para detectar diferencias en el deterioro de la función motora y sensorial. Para ello, se utilizó la prueba de fuerza de agarre y la prueba de esquina. La prueba de fuerza de agarre se utiliza para evaluar la función motora. La fuerza de las extremidades anteriores se mide con un medidor de fuerza de agarre conectado a un transductor de fuerza digital (consulte la tabla de materiales). El ratón se agarra a una barra horizontal con ambas patas delanteras mientras tira suavemente de ella hacia atrás a través de la cola. Se observa la fuerza máxima de la empuñadura antes de soltar las patas delanteras. Se realizan cinco ensayos por animal, y el valor principal se calcula después de excluir los valores máximo y mínimo. La prueba de la esquina se utiliza para detectar anomalías unilaterales de las funciones sensoriales y motoras. El aparato consta de una esquina con dos tablas (30 cm × 20 cm × 1 cm) unidas con un ángulo de 30° y una pequeña abertura en el extremo. El ratón se coloca en la mitad de la esquina. Cuando el ratón entra profundamente en la esquina, ambos lados de las vibrisas se estimulan juntos. A continuación, el ratón se vuelve hacia atrás para mirar hacia el extremo abierto. Se realizan un total de 10 ensayos por animal y se anotan los lados elegidos. Se espera un 50% de giros a la izquierda y a la derecha en condiciones fisiológicas, mientras que se espera una preferencia a la derecha en ratones con el MCAo derecho. Una prueba se considera válida cuando se consigue un giro completo o cuando el ratón gira la cabeza ≥ 90º. Los resultados se muestran como el porcentaje de giros a la derecha (ipsilaterales).

Se presentan los resultados representativos que muestran la pérdida de fuerza exhibida por los ratones 24 h después de la tMCAo medida por la prueba de fuerza de agarre (Figura 3A), así como su preferencia por girar hacia el lado ipsilateral a la lesión cuando se estimulan en la prueba de esquina (Figura 3B). La realización de pruebas conductuales el mismo día de la cirugía puede ser menos precisa, ya que algunos parámetros podrían verse alterados debido a la proximidad de la anestesia y el postoperatorio.

Figura 1: Representación esquemática del árbol vascular del cuello (lado derecho). (A) La imagen muestra las arterias principales (Arteria Carótida Común-CCA, Arteria Carótida Externa-ECA, Arteria Carótida Interna-ICA) y las diferentes ramas (Arteria Pterigopalatina Pt; Arteria occipital Occ; Arteria tiroidea superior St; Arterias maxilar y lingual Max/Lin). (B) Los primeros pasos del procedimiento quirúrgico, con el CCA ligado por sutura, la circulación de la ICA se interrumpe mediante una pinza vascular y el monofilamento se introduce a través de la ECA. (C) Reorientación del ECA para empujar el monofilamento a la zona de oclusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imágenes representativas de RM. (A) Las imágenes T2-w del mismo ratón en diferentes momentos después de la reperfusión muestran la evolución de la lesión en la fase aguda. El área afectada por el infarto aumenta rápidamente durante las primeras horas y experimenta poca variación a partir de entonces. (B) Evolución del volumen de la lesión en la fase aguda tras la ACMac. Cada barra representa la media ± DE del porcentaje (%) del volumen de la lesión. El volumen de la lesión aumenta significativamente durante las primeras 24 h después de la reperfusión (*p = 0,0182; **p = 0,0088; ANOVA de 1 vía/prueba de Kruskal-Wallis). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Pruebas de comportamiento antes (basal) y 24 h después de tMCAo (n = 16 ratones). (A) La prueba de fuerza de agarre muestra la fuerza máxima (máx.) por ratón. (B) La prueba de las esquinas muestra el porcentaje (%) de giros a la derecha. Los gráficos muestran la caja y los bigotes (valores mínimos a máximos) por grupo, y los puntos corresponden a ratones individuales (****p < 0,0001; Prueba de rango con signo de parejas emparejadas de Wilcoxon). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.