Este protocolo describe el modelo de isquemia cerebral focal transitoria en ratones a través de la oclusión intraluminal de la arteria cerebral media. Además, se muestran ejemplos de evaluación de resultados mediante resonancia magnética y pruebas de comportamiento.
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Artículo de método
Modelo de oclusión transitoria de la arteria cerebral media de accidente cerebrovascular
En este artículo
Resumen
Resumen
El accidente cerebrovascular es una de las principales causas de muerte o discapacidad crónica en todo el mundo. Sin embargo, los tratamientos óptimos existentes se limitan a las terapias de reperfusión durante la fase aguda del ictus isquémico. Para obtener información sobre la fisiopatología del ictus y desarrollar enfoques terapéuticos innovadores, los modelos in vivo de ictus en roedores desempeñan un papel fundamental. La disponibilidad de animales modificados genéticamente ha impulsado especialmente el uso de ratones como modelos experimentales de ictus.
En los pacientes con accidente cerebrovascular, la oclusión de la arteria cerebral media (ACM) es una ocurrencia común. En consecuencia, el modelo experimental más prevalente es la oclusión intraluminal del ACM, una técnica mínimamente invasiva que no requiere craneectomía. Este procedimiento consiste en insertar un monofilamento a través de la arteria carótida externa (ECA) y hacerlo avanzar a través de la arteria carótida interna (ACI) hasta llegar al punto de ramificación de la ACM. Después de una oclusión arterial de 45 minutos, se retira el monofilamento para permitir la reperfusión. A lo largo del proceso, se monitoriza el flujo sanguíneo cerebral para confirmar la reducción durante la oclusión y la posterior recuperación tras la reperfusión. Los resultados neurológicos y tisulares se evalúan mediante pruebas conductuales y estudios de imágenes por resonancia magnética (IRM).
Introducción
El accidente cerebrovascular es una enfermedad devastadora que afecta aproximadamente a 15 millones de personas en todo el mundo anualmente, según la OMS. Alrededor de un tercio de los pacientes sucumben a la enfermedad, mientras que otro tercio experimenta una discapacidad permanente. El accidente cerebrovascular es una patología compleja que involucra varios tipos de células, como las células inmunitarias neurales y periféricas, la vasculatura y las respuestas sistémicas1. La intrincada red de reacciones desencadenadas por el accidente cerebrovascular a nivel de sistemas no se puede replicar actualmente utilizando modelos in vitro . Por lo tanto, los modelos animales experimentales son esenciales para profundizar en los mecanismos de la enfermedad y para desarrollar y probar nuevas terapias. Actualmente, la reperfusión tisular precoz es la única intervención aprobada, ya sea mediante trombólisis con activador tisular del plasminógeno (tPA) o trombectomía endovascular1.
Las oclusiones de la arteria cerebral media (ACM) son frecuentes en los pacientes con ictus. En consecuencia, inicialmente se desarrollaron modelos de roedores de oclusión transitoria de MCA (tMCAo) en ratas 2,3,4. Hoy en día, los ratones modificados genéticamente son los animales más utilizados en modelos experimentales de ictus. En este estudio, describimos un modelo mínimamente invasivo de tMCAo intraluminal en ratones. El abordaje se realiza a través de la arteria carótida a nivel del cuello, sin craniectomía.
La duración del período de oclusión es un factor crítico que determina la extensión de la lesión isquémica. Incluso las oclusiones cortas de 10 minutos pueden causar muerte neuronal selectiva sin un infarto aparente, mientras que las oclusiones más largas, que suelen durar de 30 a 60 minutos, dan lugar a algún grado de infarto cerebral. A diferencia de las ramas proximal y distal de la ACM que irrigan la corteza y tienen colaterales, las arterias lenticulo-estriadas que suministran sangre al cuerpo estriado carecen de colaterales5. Como consecuencia, hay una mayor reducción del flujo sanguíneo en el cuerpo estriado que en la corteza después de la tMCAo. Así, las oclusiones de 30 min o menos afectan generalmente al cuerpo estriado pero no a la corteza, mientras que las oclusiones más largas, a partir de los 45 min, suelen generar una lesión isquémica en todo el territorio de la ACM, incluyendo el cuerpo estriado y la corteza dorsolateral.
Para garantizar el bienestar de los ratones, administramos analgésicos antes del procedimiento y utilizamos anestesia durante la cirugía. Sin embargo, la anestesia puede potencialmente introducir alteraciones artificiales en la fisiología del ratón y afectar algunas medidas de resultado6. La intervención quirúrgica, cuando es realizada por personal experimentado, suele durar unos 15 minutos para inducir la ACMo. Posteriormente, el tiempo total bajo anestesia depende del período de oclusión. Para los experimentos en los que minimizar la anestesia es crucial, un paso alternativo en el procedimiento implica suspender la anestesia durante el período de oclusión y limitarla solo a los pasos quirúrgicos para insertar y retirar el filamento que ocluye el MCA. Este abordaje reduce la duración de la anestesia y minimiza sus potenciales efectos artefactuales sobre el modelo experimental 7,8. Por lo tanto, el método de inducción de isquemia focal transitoria se presenta por oclusión intraluminal de la ACM con dos variantes: con el ratón anestesiado durante todo el período de oclusión o con el ratón despierto durante este período. En cualquier caso, se debe realizar una cirugía simulada en paralelo a la intervención realizada en los ratones isquémicos. Además, se proporcionan datos sobre la evaluación de los resultados medidos por pruebas de comportamiento y resonancia magnética en varios momentos después de la reperfusión. Por último, se discuten los principales factores a tener en cuenta a la hora de implementar el procedimiento experimental.
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Protocolo
El trabajo con animales se llevó a cabo siguiendo las leyes catalanas y españolas (Real Decreto 53/2013) y las Directivas Europeas, con la aprobación del Comité Ético de Experimentación Animal (CEEA) de la Universidad de Barcelona, y de los organismos reguladores locales de la Generalitat de Catalunya. Los estudios se informan de acuerdo con las directrices ARRIVE. Este procedimiento está diseñado para ser realizado en ratones adultos, a partir de las 8 semanas de edad, sin límite de edad. Aquí se proporcionan ejemplos del procedimiento quirúrgico desarrollado en ratones C57BL/6 de 10-12 semanas de edad. Se deben tener en cuenta las diferencias anatómicas en función de la cepa del ratón.
1. Preparación animal
- Antes de comenzar el procedimiento quirúrgico, reúna y esterilice todos los materiales y herramientas necesarios. Prepare la mesa de operaciones con todos los materiales quirúrgicos necesarios (enumerados en la Tabla de Materiales).
- Anestesiar al animal mediante inhalación de isoflurano en una mezcla de oxígeno y óxido nitroso (30%/70%).
- Administrar buprenorfina (ver Tabla de materiales) por vía subcutánea a una dosis de 0,05 mg/kg de peso corporal para proporcionar analgesia y aliviar cualquier dolor y molestia.
NOTA: La analgesia es obligatoria, pero se aceptan diferentes protocolos. Los signos de dolor y malestar también deben controlarse durante los primeros días después de la ACMc (ver paso 4). Aplicar soluciones correctivas cuando sea necesario. - Colocar al animal en una caja de inducción anestésica (ver Tabla de Materiales) con isoflurano al 5% hasta que alcance un estado de anestesia profunda (pérdida del reflejo en la punción de la pata y reflejo ocular).
- Coloque el ratón en la mesa de operaciones y disminuya el nivel de isoflurano al 1,5%, administrado por la mascarilla. Aplique ungüento veterinario para evitar la sequedad ocular durante el procedimiento.
- Mantener la temperatura corporal a 37 ± 0,5 °C controlada por una sonda rectal conectada a una almohadilla térmica (ver Tabla de Materiales).
- Afeitar la parte ventral del cuello y la cabeza (calvaria) con una maquinilla de afeitar eléctrica. Retire con cuidado los restos de pelo y desinfecte las áreas de la piel tres veces con movimientos circulares con desinfectante a base de yodo y alcohol al 70%.
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2. Evaluación del flujo sanguíneo cerebral (CBF) con flujometría Doppler láser (LDF)
- Con unas tijeras, haz una incisión en la piel de la cabeza, en dirección a la sutura sagital, desde las orejas hasta la zona entre los ojos.
- Retraiga la piel y retire el periostio del lado derecho del cráneo.
- Encuentre las coordenadas (2,5 mm laterales desde Bregma) y fije el soporte Doppler (ver Tabla de Materiales) con cianoacrilato. Después de que el pegamento se haya secado, conecte la sonda Doppler y verifique la lectura correcta de la señal.
3. Oclusión transitoria de la arteria cerebral media (tMCAo)
- Gire el ratón a la posición supina y fíjelo a la mesa quirúrgica con cinta médica.
- Haz una incisión en la línea media del cuello. Tire lateralmente hacia atrás de la piel y las glándulas salivales usando retractores (ver Tabla de Materiales) para exponer el territorio carotídeo.
- Identificar la anatomía vascular de la arteria carótida común (ACC), la ACI y la ECA, así como las diferentes arterias derivadas de ellas (maxilar y lingual, tiroides superior, occipital y pterigopalatina) (Figura 1A).
- Separe las arterias principales del tejido conectivo adyacente para que puedan ser manipuladas.
NOTA: Tenga especial cuidado de no dañar los nervios, especialmente el nervio vago, que corre paralelo al CCA. - Envuelva una sutura de seda 6-0 (ver Tabla de Materiales) alrededor de la ECA en la bifurcación maxilar/lingual. Asegure firmemente un nudo para interrumpir permanentemente la circulación.
- Pase una segunda sutura alrededor de la misma arteria, entre el primer nudo y la bifurcación de la CCA, y mantenga este nudo suelto.
- Coloque un tercer hilo alrededor del CCA y haga un nudo corredizo que se pueda desatar fácilmente.
NOTA: Esto también se puede llevar a cabo con un clip vascular, pero el hilo permite más movimiento y flexibilidad. En esta etapa es posible observar una primera disminución de CBF en la señal LDF. - Colocar una pinza vascular (ver Tabla de Materiales) que interrumpa la circulación sanguínea desde la ICA.
- Haga una pequeña incisión en el ECA, cerca del área donde se encuentra el nudo apretado.
- Inserte el monofilamento hasta que la capa gruesa haya entrado completamente en la luz arterial.
- Apriete el segundo nudo para sujetar el monofilamento dentro de la arteria y evitar que la presión ejercida por la sangre la empuje hacia afuera (Figura 1B).
- Retire el clip vascular de la ICA.
- Corte el ECA por debajo del primer nudo y gire el tocón para orientarlo en la dirección del ICA (Figura 1C).
- Avance el monofilamento a través del ICA hasta el punto donde se ramifica el MCA.
NOTA: La oclusión se refleja en una caída abrupta del flujo sanguíneo en la lectura de LDF. Consideramos una oclusión exitosa cuando la caída del CBF es superior al 70% del valor basal. Si no se dispone de sistemas de medición de CBF, el punto de oclusión se puede notar por la resistencia al avance, que en ratones adultos suele estar a unos 11 mm de la bifurcación del CCA.- Si se continúa con la anestesia durante el período de oclusión, controle al ratón y manténgalo bajo observación constante durante 45 minutos.
- En caso de que el ratón se despierte durante el período de oclusión, suturar la piel del cuello con varios puntos. Sin desconectar la sonda LDF, coloque el ratón en la caja con temperatura controlada, lo que permite la recuperación de la anestesia.
NOTA: Es común que el ratón exhiba un comportamiento de círculos espontáneos durante este período, lo que indica una oclusión exitosa. - Después de 40 min, anestesiar de nuevo al ratón siguiendo los mismos procedimientos de anestesia y desinfección indicados en los puntos 1.4, 1.5 y 1.7. Vuelva a colocarlo en la mesa quirúrgica y retire los puntos del cuello.
- Después de 45 minutos de oclusión, afloje el nudo que mantiene el monofilamento en su lugar. Tire lenta y suavemente del filamento y compruebe que se produce la recanalización del tejido.
- Saca el filamento y aprieta el nudo para evitar la pérdida de sangre.
- Desata el nudo CCA. Asegúrese de que no haya daños en la pared arterial.
- Retire los retractores y vuelva a colocar los músculos, las glándulas y la piel. Suturar la piel (6-0) y aplicar desinfectante.
- Desconecte la sonda Doppler y separe el soporte. Suturar y desinfectar la piel de la cabeza.
- Durante el período de recuperación de la anestesia, deje al ratón en una jaula provista de un calentador para mantener la temperatura. Manténgalo bajo observación constante hasta que esté completamente recuperado de la anestesia. Después de la recuperación, el ratón puede ser devuelto a su jaula.
NOTA: Viviendas con enriquecimiento social son muy recomendables. Sin embargo, nunca mezcle ratones operados con ratones no operados en la misma jaula sin ninguna separación física para evitar la agresión.
4. Cuidados postoperatorios
- Supervisar periódicamente a los animales siguiendo los procedimientos y normas establecidas según la normativa local. Proporcionar tratamiento analgésico en el horario adecuado para minimizar el dolor después de la cirugía.
NOTA: En el presente estudio se aplicó el mismo analgésico que al inicio de la intervención (Buprenorfina 0,05 mg/kg de peso corporal) a las 6 h y 24 h después de la cirugía. - Realizar la eutanasia cuando los parámetros de supervisión así lo indiquen, siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente.
- Controlar diariamente el peso de los animales. Proporcione alimentos blandos a los animales durante los primeros días después de la cirugía. Además, hidratarlos mediante inyección subcutánea de suero fisiológico (200 μL) inmediatamente después de la cirugía y periódicamente a partir de entonces si se observa que el ratón no se hidrata por sí solo. Organice la comida y el agua de una manera que sea fácilmente accesible para el animal.
- Una vez que se completa el estudio in vivo , anestesiar a los ratones, sacrificarlos y extraer el tejido cerebral para un análisis histopatológico adicional (si es necesario).
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Resultados
Existen diferentes enfoques para evaluar el resultado del procedimiento tMCAo. Aquí se utilizan métodos de neuroimagen (IRM) in vivo y pruebas de comportamiento.
Los ratones desarrollan lesiones isquémicas en el cerebro, afectando principalmente al territorio irrigado por el ACM ipsilateral a la oclusión, como el cuerpo estriado y la corteza dorsolateral. Existen varios métodos para determinar la extensión de la lesión, incluida la tinción tisular con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazol...
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Discusión
El procedimiento intraluminal de tMCAo es el modelo más utilizado de isquemia cerebral focal con reperfusión en investigación básica. Actualmente, los ratones son el modelo animal preferido debido a la disponibilidad de cepas modificadas genéticamente. Sin embargo, es esencial reconocer que los ratones modificados genéticamente y sus antecedentes genéticos pueden afectar la vascularización cerebral. La presencia de circulación colateral y anastomosis entre diferentes territorios arteriales puede influir significativament...
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Estudio financiado por la subvención PID2020-113202RB-I00 financiada por el Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI), Gobierno de España/10.13039/501100011033 y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). Una manera de hacer Europa". NCC y MAR tenían becas predoctorales (PRE2021-099481 y PRE2018-085737, respectivamente) financiadas por MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033 y por "Fondo Social Europeo (FSE) Invertir en tu futuro". Agradecemos a Francisca Ruiz-Jaén y Leonardo Márquez-Kisinousky por su apoyo técnico. Agradecemos el apoyo del centro de resonancia magnética del Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS). El Programa Centres de Recerca de Catalunya (CERCA) de la Generalitat de Catalunya apoya al IDIBAPS.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sutura 6/0 | Arago | Ligaduras vasculares | |
| 6/0 sutura con aguja curva | Arago | Suturas cutáneas | |
| 9 mg/mL solución salina | Fresenius Kabi | CN616003 EC | Para hidratación |
| Sistema de anestesia | SurgiVet | ||
| Retractores romos, 1 mm de ancho | Fine Science Tools | 18200-09 | |
| Buprenorfine | Buprex | para alivio del dolor | |
| Pinza de aplicación de pinzas | Fine Science Tools | S& T CAF4 | |
| Dumont mini pinzas Fine | Science Tools | M3S 11200-10 | |
| Pinzas | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Pegamento | Loctite | Para pegar la sonda LDF al cráneo | |
| Medidor de fuerza de agarre | IITC Life Science Inc. | #2200 | |
| Isoflurano | B-Braun | CN571105.8 | |
| LDF Perimed | Perimed Periflux | System 5000 | |
| LDF Soportes de sonda Perimed | PH 07-4 | ||
| Cinta | |||
| Imán de resonancia magnética | Bruker BioSpin, Ettlingen, Alemania | BioSpec 70/30 escáner horizontal para animales | |
| Portaagujas con cortador de sutura | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Filamento de nylon | Doccol | 701912PK5Re | |
| Jaula de recuperación con almohadilla | |||
| Tijeras Sirgicales | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| Kit cauterizador para recipientes pequeños | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Microscopio estereoscópico y luz fría | Leica | M60 | |
| Pinza de atado de sutura | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Termostato, sonda rectal y alfombrilla de ratón | Letica Science Instruments | LE 13206 | |
| Tijeras de resorte Vannas (filo de 4 mm) | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Pinzas vasculares | Fine Science Tools | 00396-01 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
