Este protocolo demuestra una técnica fiable y eficaz para aislar fibroblastos primarios del tejido vaginal humano premenopáusico o posmenopáusico. Los protocolos existentes para el aislamiento de fibroblastos vaginales no tienen en cuenta los desafíos del aislamiento celular del tejido senescente. El tejido vaginal se obtuvo de las mujeres después de la cirugía de prolapso de órganos pélvicos.
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Artículo de método
Procesamiento de tejidos y aislamiento de fibroblastos primarios de la vagina humana
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Resumen
Resumen
El prolapso de órganos pélvicos es un trastorno que afecta gravemente a la calidad de vida de las mujeres. Ocurre cuando los músculos y ligamentos se debilitan y hacen que los órganos pélvicos caigan más abajo en la pelvis, creando una protuberancia en la vagina. La cirugía para corregir el prolapso de órganos pélvicos ha sido un tratamiento fundamental. Recientemente, ha habido un creciente interés en estudiar la composición tisular de los pacientes con prolapso a nivel celular.
Actualmente hay poco consenso sobre el efecto de la edad del donante o del paciente en las terapias basadas en células. Los protocolos publicados actualmente para el aislamiento de fibroblastos vaginales se concentran en el tejido premenopáusico o se niegan a comentar sobre la edad del tejido del donante. La mayoría de los protocolos existentes utilizan modelos animales. La consistencia del tejido vaginal humano es más densa que los tejidos utilizados en la mayoría de los protocolos. En este estudio, el tejido vaginal humano se obtuvo principalmente de donantes mayores, lo que probablemente contribuyó al fracaso de los protocolos existentes.
El objetivo de este estudio es describir un protocolo estándar para la adquisición fiable de fibroblastos vaginales humanos, independientemente de la edad de la donante y el estado menopáusico. Los resultados se reprodujeron utilizando tejido de nueve donantes distintos que se sometieron a una cirugía de prolapso de órganos pélvicos. Seis pacientes eran posmenopáusicas, y la donante de mayor edad tenía 78 años. La mediana de edad de los donantes de tejidos fue de 59 años.
Aquí, describimos un método confiable para generar una suspensión unicelular enriquecida con fibroblastos utilizando una combinación de disociación enzimática y mecánica y agrupación de suspensión celular de múltiples biopsias vaginales de un solo donante. El aislamiento fiable de los fibroblastos primarios vaginales humanos puede ser útil en el estudio del prolapso de órganos pélvicos, así como en las interacciones entre el microbioma y el huésped.
Introducción
La disparidad de género en la ciencia y la investigación es un problema constante. La investigación sobre los trastornos que afectan principalmente a las personas de género femenino está infrafinanciada1. El prolapso de órganos pélvicos es un trastorno fuertemente asociado al sexo femenino. Ocurre cuando los músculos y ligamentos se debilitan y hacen que los órganos pélvicos caigan más abajo en la pelvis, creando una protuberancia en la vagina. Se sabe poco sobre las interacciones celulares en el contexto de esta fisiopatología, ni sobre cómo los factores a nivel tisular influyen en el éxito de las intervenciones quirúrgicas3.
Las células primarias, en lugar de las líneas celulares, son ampliamente reconocidas como esenciales para la investigación clínica traslacional, ya que proporcionan una mayor relevancia fisiológica4. Las células primarias se toman directamente del tejido corporal de interés y pueden imitar con mayor precisión la fisiología in vivo . El aislamiento de fibroblastos primarios de la vagina humana puede ser útil para estudiar los mecanismos biológicos del prolapso de órganos pélvicos y el modelado de la enfermedad, teniendo en cuenta las características clave del donante, como la edad y el estado menopáusico.
El prolapso de órganos pélvicos suele afectar a personas mayores o posmenopáusicas. El aislamiento y la proliferación de células primarias de fibroblastos en el estudio de esta enfermedad son un desafío debido a la reducción de las poblaciones celulares y la capacidad clonogénica de los donantes mayores5. En nuestra experiencia, el uso de los protocolos previamente descritos para la disociación del tejido vaginal no logró extraer ningún fibroblasto de una biopsia de tejido estándar de 1cm2 .
A través de una revisión de la literatura, encontramos que estudios similares se subdividieron en dos grupos: modelos animales, como los murinos6, y modelos humanos 7,8. Al seguir el protocolo del ratón, el uso de tijeras para el procesamiento de tejido vaginal humano produjo una digestión mecánica inadecuada. La extrapolación de los protocolos utilizando tejido murino y otros sitios de tejido9 no tuvo éxito.
La mayoría de los trabajos que utilizaron muestras vaginales humanas utilizaron tejido de individuos premenopáusicos con prolapso de órganos pélvicos 7,10. A pesar de que algunos trabajos relataron el uso de muestras de individuos premenopáusicos y postmenopáusicos11, no describieron con suficiente detalle el protocolo utilizado para aislar con éxito fibroblastos de donantes mayores o posmenopáusicos. El aislamiento y el modelado de la enfermedad utilizando fibroblastos de tejido postmenopáusico pueden ser esenciales para comprender la fisiopatología celular del prolapso de órganos pélvicos, ya que esta condición tiene la mayor prevalencia en individuos en la década posterior a la menopausia12.
Describimos un método para el aislamiento y cultivo de una suspensión unicelular enriquecida con fibroblastos a partir de tejido vaginal humano utilizando una combinación de disociación mecánica y enzimática. Este artículo describe un protocolo confiable sobre cómo adquirir fibroblastos vaginales humanos posmenopáusicos o envejecidos. Se confirmó que las células aisladas eran fibroblastos mediante un examen morfológico mediante microscopía de contraste de fase e inmunofluorescencia (IF) para evaluar la expresión de vimentina, F-actina y actina de músculo α liso (α-SMA).
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Protocolo
El tejido vaginal se obtuvo de mujeres sometidas a cirugía de prolapso de órganos pélvicos. El tejido vaginal recolectado después de la cirugía se consideró material de desecho y, de lo contrario, se desecharía. El estudio se realizó de acuerdo con las directrices institucionales y fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del General Brigham de Massachusetts.
1. Extracción de tejido vaginal de la paciente
- Diagnostique el prolapso de órganos pélvicos mediante la anamnesis y los hallazgos del examen pélvico: Se obtuvieron mediciones de la cuantificación del prolapso de órganos pélvicos (POP-Q) en la clínica, que muestran evidencia de prolapso de órganos pélvicos.
- Utilizar los siguientes criterios de inclusión: mayores de 18 años; antecedentes de prolapso sintomático de órganos pélvicos; optando por la corrección quirúrgica del prolapso de órganos pélvicos.
- Excluya lo siguiente: Mujeres embarazadas y pacientes que se niegan a donar tejido.
- Recorte el exceso de tejido vaginal como un paso necesario de la cirugía de prolapso de órganos pélvicos. Este epitelio vaginal se extirpa en espesor total después de las siguientes cirugías: colporrafia anterior, colporrafia posterior y colpocleisis.
- Transporte el tejido al laboratorio en un recipiente estéril de recolección de muestras con solución salina normal o medios DMEM/F12 (Gibco) sin suero. Mantener en hielo.
2. Procesamiento y digestión de tejidos
- Preparación de tejidos
- Mida y corte el tejido para abarcar todo el grosor del epitelio vaginal, creando segmentos de aproximadamente 1cm2.
- Asegure una medición precisa del tamaño de la biopsia de 1 cm2.
NOTA: La sobreestimación del tamaño de la biopsia de tejido puede afectar la digestión del tejido. - Prepare 2-3 biopsias vaginales adicionales de1 cm2 cada una de un solo donante y reserve las biopsias.
- Digestión mecánica
- Colocar la biopsia vaginal en una placa de Petri de cultivo celular de 10 cm. Pipetear 500-1.000 μL de medio sin suero suplementado con 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 2,5 μg/mL de anfotericina Bonto el tejido vaginal para evitar que el tejido se reseque.
- Picar el tejido vaginal en pequeños fragmentos con dos bisturíes estériles (n.º 11 o n.º 15) con ambas manos.
- Asegúrese de que las puntas de las cuchillas estén perpendiculares a la superficie del tejido. Aplique una presión igual y constante sobre la superficie del tejido, utilizando dos bisturíes. Realice una acción de tracción alterna para cortar el tejido en trozos muy pequeños.
- Repita esta técnica de picado utilizando la técnica de dos bisturíes hasta que la muestra tenga una consistencia uniforme con trozos de 1-2 mm.
NOTA: La digestión mecánica con esta técnica de dos bisturíes deuna biopsia de 1 cm2 debería tardar aproximadamente 15-20 minutos en completarse. - Añadir 2-3 mL de medio DMEM/F12 sin suero suplementado con 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 2,5 μg/mL de anfotericina B a la placa, suspendiendo el tejido picado. Pipetea la solución que contiene fragmentos de tejido hacia arriba y hacia abajo para romper los grumos.
- Digestión enzimática
- Transfiera la solución que contiene fragmentos de tejido a un tubo cónico de 15 mL. Agregue medios DMEM/F12 sin suero a la placa de cultivo de tejidos donde se picó el tejido vaginal para recolectar los fragmentos de tejido restantes. Transfiera la solución que contiene fragmentos de tejido al tubo cónico. Agregue medios DMEM/F12 adicionales sin suero hasta que el volumen total sea de 10 mL.
- Disolver 5 mg de Liberasa en 1 mL de agua estéril (5 mg/mL). Almacenar en alícuotas de 230 μL a -20 °C durante un máximo de un mes o -80 °C durante 6 meses.
- Añadir 230 μL de Liberasa (stock 13 U/mL) al tubo, con una concentración final de 0,3 U/mL.
NOTA: La actividad de la liberasa puede variar de un lote a otro. Descongele cada alícuota inmediatamente antes de usarla con un baño de agua. Evite congelar y descongelar repetidamente. - Repita los pasos 2.1-2.3 para 2-3 biopsias vaginales adicionales de la misma donante.
NOTA: Mantenga cada solución que contenga fragmentos de tejido de una sola biopsia en tubos cónicos separados. Por ejemplo, 4 biopsias vaginales en 4 tubos. Esto es importante para una granulación óptima de las células después de la centrifugación. - Incubar los tubos durante 3 h a 37 °C con agitación constante y vigorosa utilizando un mezclador de muestras.
- Coloque un mezclador de muestras en una incubadora deCO2 . Mantener una agitación constante. (Ajustes del mezclador de muestra: 25 rpm de movimiento de rotación durante 5 s, 30° de movimiento recíproco (rotación de inclinación) durante 5 s y 2° de movimiento de vibración (vórtice) durante 3 s).
- Durante la incubación, agite los tubos a intervalos de 30 minutos.
- Centrifugar las muestras a 3.000 x g durante 5 min. Retire y deseche el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el pellet en medios DMEM/F12 de 1-2 mL con suero fetal bovino (FBS) al 10% y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 2,5 μg/mL de anfotericina B para diluir la enzima Liberasa. Pipetear enérgicamente hasta que el pellet se vuelva a suspender por completo.
3. Cultivo celular
- Extracción de fragmentos de tejido no digeridos
- Coloque un colador de células de 100 μm sobre un recipiente cónico estéril de 50 mL.
- Agrupar la suspensión celular de las múltiples biopsias de tejido del mismo donante.
- Cuele la suspensión de tejido/enzima, presionando con un émbolo de jeringa de 5 mL. Repita este paso hasta que los fragmentos de tejido restantes parezcan estar completamente presionados.
NOTA: Puede haber algo de mucosidad de los fragmentos de tejido de la vagina que no se ha trabajado completamente a través del colador. Deseche la mucosidad con el colador de células.
- Agrupación de cultivos celulares
- Suspensión de células agrupadas en placa de múltiples biopsias vaginales (del mismo donante) en una placa de Petri (60 mm x 15 mm).
- Incubar la placa de Petri en una incubadora deCO2 a 37 °C durante la noche.
- Observar y confirmar la presencia de células no adherentes con un microscopio de contraste de fase.
- Asegúrese de que el enfoque del microscopio esté en la parte inferior de la placa.
NOTA: Puede haber muchas células inmunitarias en primer plano. Se unirá un número menor de fibroblastos a la parte inferior de la placa. - Espere entre 18 y 24 horas antes de cambiar el medio de cultivo celular para garantizar una adherencia celular adecuada.
- Cambie el medio de cultivo cada tres días hasta que se produzca un 80% de confluencia. Cuando las células alcancen el 80-90% de confluencia, expándalas a un matraz más grande o congele las alícuotas de las células para su uso futuro.
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Resultados
Se recolectó tejido vaginal de 10 donantes independientes sometidas a cirugía de prolapso de órganos pélvicos. Utilizando el protocolo descrito, se aislaron células de tejido vaginal humano. Las poblaciones celulares tenían una apariencia característica alargada, plana y en forma de huso. Al igual que otros estudios, observamos una capacidad de duplicación celular significativamente más lenta y una menor capacidad clonogénica de los fibroblastos con el aumento de la edad del donante. Estas diferencias fueron marcadas al ...
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Discusión
Muchos estudios previos han reportado cómo aislar fibroblastos primarios de la vagina humana 3,7. Varios estudios utilizaron tejido vaginal humano de individuos premenopáusicos con prolapso de órganos pélvicos. A pesar de que algunos trabajos reportaron el uso de tejido de individuos premenopáusicos y postmenopáusicos 7,11, no describieron con suficiente detalle el protoc...
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Divulgaciones
No tenemos conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría expresar nuestra gratitud a todos los miembros del Centro Vincent de Biología Reproductiva del Hospital General de Massachusetts, así como a la Fundación del Hospital VIncent Memorial, por su generoso apoyo. Un agradecimiento especial al Dr. Bo Rueda y su laboratorio por sus valiosas sugerencias y por prestarnos equipos de laboratorio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anfotericina B | Bio Techne | B23192 | |
| Filtro de células (100 μ m) | ThermoFisher Scientific | 22363549 | |
| Tubos de centrífuga cónicos (15 mL) | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
| Bisturí Desechable de Plumas Nº 15 | Socorex | FB.15 | |
| Suero Fetal Bovino | Sigma Aldrich NC1983075 | ||
| Tubos de centrífuga cónicos de alta claridad (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| HulaMixer Mezclador de muestras | ThermoFisher Scientific | 15920D | |
| Fibronectina Humana DuoSet ELISA | R& D Systems | DY1918-05 | |
| Pro-Colágeno Humano I alfa 1 DuoSet ELISA | R& D Systems | DY6220-05 | |
| Liberase Research Grade | Sigma Aldrich | 05 401 119 001 | |
| Penicilina/estreptomicina (5000U/ml) | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Placas de Petri, poliestireno (100 mm x 20 mm) | Millipore Sigma | P5606 | |
| Pipetas serológicas (10 mL) | ThermoFischer Scientific | 170356N | |
| Jeringas estériles (5 mL) | Fischer Scientific | 14-955-458 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
