Method Article

Procesamiento de tejidos y aislamiento de fibroblastos primarios de la vagina humana

DOI:

10.3791/65864

⸱

November 22nd, 2024

 ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology, Division of Urogynecology, Massachusetts General Hospital, 2Massachusetts General Hospital/Vincent Center for Reproductive Biology/Harvard Medical School, 3Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology, Massachusetts General Hospital, Vincent Center for Reproductive Biology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo demuestra una técnica fiable y eficaz para aislar fibroblastos primarios del tejido vaginal humano premenopáusico o posmenopáusico. Los protocolos existentes para el aislamiento de fibroblastos vaginales no tienen en cuenta los desafíos del aislamiento celular del tejido senescente. El tejido vaginal se obtuvo de las mujeres después de la cirugía de prolapso de órganos pélvicos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El prolapso de órganos pélvicos es un trastorno que afecta gravemente a la calidad de vida de las mujeres. Ocurre cuando los músculos y ligamentos se debilitan y hacen que los órganos pélvicos caigan más abajo en la pelvis, creando una protuberancia en la vagina. La cirugía para corregir el prolapso de órganos pélvicos ha sido un tratamiento fundamental. Recientemente, ha habido un creciente interés en estudiar la composición tisular de los pacientes con prolapso a nivel celular.

Actualmente hay poco consenso sobre el efecto de la edad del donante o del paciente en las terapias basadas en células. Los protocolos publicados actualmente para el aislamiento de fibroblastos vaginales se concentran en el tejido premenopáusico o se niegan a comentar sobre la edad del tejido del donante. La mayoría de los protocolos existentes utilizan modelos animales. La consistencia del tejido vaginal humano es más densa que los tejidos utilizados en la mayoría de los protocolos. En este estudio, el tejido vaginal humano se obtuvo principalmente de donantes mayores, lo que probablemente contribuyó al fracaso de los protocolos existentes.

El objetivo de este estudio es describir un protocolo estándar para la adquisición fiable de fibroblastos vaginales humanos, independientemente de la edad de la donante y el estado menopáusico. Los resultados se reprodujeron utilizando tejido de nueve donantes distintos que se sometieron a una cirugía de prolapso de órganos pélvicos. Seis pacientes eran posmenopáusicas, y la donante de mayor edad tenía 78 años. La mediana de edad de los donantes de tejidos fue de 59 años.

Aquí, describimos un método confiable para generar una suspensión unicelular enriquecida con fibroblastos utilizando una combinación de disociación enzimática y mecánica y agrupación de suspensión celular de múltiples biopsias vaginales de un solo donante. El aislamiento fiable de los fibroblastos primarios vaginales humanos puede ser útil en el estudio del prolapso de órganos pélvicos, así como en las interacciones entre el microbioma y el huésped.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La disparidad de género en la ciencia y la investigación es un problema constante. La investigación sobre los trastornos que afectan principalmente a las personas de género femenino está infrafinanciada1. El prolapso de órganos pélvicos es un trastorno fuertemente asociado al sexo femenino. Ocurre cuando los músculos y ligamentos se debilitan y hacen que los órganos pélvicos caigan más abajo en la pelvis, creando una protuberancia en la vagina. Se sabe poco sobre las interacciones celulares en el contexto de esta fisiopatología, ni sobre cómo los factores a nivel tisular influyen en el éxito de las intervenciones quirúrgicas3.

Las células primarias, en lugar de las líneas celulares, son ampliamente reconocidas como esenciales para la investigación clínica traslacional, ya que proporcionan una mayor relevancia fisiológica4. Las células primarias se toman directamente del tejido corporal de interés y pueden imitar con mayor precisión la fisiología in vivo . El aislamiento de fibroblastos primarios de la vagina humana puede ser útil para estudiar los mecanismos biológicos del prolapso de órganos pélvicos y el modelado de la enfermedad, teniendo en cuenta las características clave del donante, como la edad y el estado menopáusico.

El prolapso de órganos pélvicos suele afectar a personas mayores o posmenopáusicas. El aislamiento y la proliferación de células primarias de fibroblastos en el estudio de esta enfermedad son un desafío debido a la reducción de las poblaciones celulares y la capacidad clonogénica de los donantes mayores5. En nuestra experiencia, el uso de los protocolos previamente descritos para la disociación del tejido vaginal no logró extraer ningún fibroblasto de una biopsia de tejido estándar de 1cm2 .

A través de una revisión de la literatura, encontramos que estudios similares se subdividieron en dos grupos: modelos animales, como los murinos6, y modelos humanos 7,8. Al seguir el protocolo del ratón, el uso de tijeras para el procesamiento de tejido vaginal humano produjo una digestión mecánica inadecuada. La extrapolación de los protocolos utilizando tejido murino y otros sitios de tejido9 no tuvo éxito.

La mayoría de los trabajos que utilizaron muestras vaginales humanas utilizaron tejido de individuos premenopáusicos con prolapso de órganos pélvicos 7,10. A pesar de que algunos trabajos relataron el uso de muestras de individuos premenopáusicos y postmenopáusicos11, no describieron con suficiente detalle el protocolo utilizado para aislar con éxito fibroblastos de donantes mayores o posmenopáusicos. El aislamiento y el modelado de la enfermedad utilizando fibroblastos de tejido postmenopáusico pueden ser esenciales para comprender la fisiopatología celular del prolapso de órganos pélvicos, ya que esta condición tiene la mayor prevalencia en individuos en la década posterior a la menopausia12.

Describimos un método para el aislamiento y cultivo de una suspensión unicelular enriquecida con fibroblastos a partir de tejido vaginal humano utilizando una combinación de disociación mecánica y enzimática. Este artículo describe un protocolo confiable sobre cómo adquirir fibroblastos vaginales humanos posmenopáusicos o envejecidos. Se confirmó que las células aisladas eran fibroblastos mediante un examen morfológico mediante microscopía de contraste de fase e inmunofluorescencia (IF) para evaluar la expresión de vimentina, F-actina y actina de músculo α liso (α-SMA).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El tejido vaginal se obtuvo de mujeres sometidas a cirugía de prolapso de órganos pélvicos. El tejido vaginal recolectado después de la cirugía se consideró material de desecho y, de lo contrario, se desecharía. El estudio se realizó de acuerdo con las directrices institucionales y fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del General Brigham de Massachusetts.

1. Extracción de tejido vaginal de la paciente

  1. Diagnostique el prolapso de órganos pélvicos mediante la anamnesis y los hallazgos del examen pélvico: Se obtuvieron mediciones de la cuantificación del prolapso de órganos pélvicos (POP-Q) en la clínica, que muestran evidencia de prolapso de órganos pélvicos.
  2. Utilizar los siguientes criterios de inclusión: mayores de 18 años; antecedentes de prolapso sintomático de órganos pélvicos; optando por la corrección quirúrgica del prolapso de órganos pélvicos.
  3. Excluya lo siguiente: Mujeres embarazadas y pacientes que se niegan a donar tejido.
  4. Recorte el exceso de tejido vaginal como un paso necesario de la cirugía de prolapso de órganos pélvicos. Este epitelio vaginal se extirpa en espesor total después de las siguientes cirugías: colporrafia anterior, colporrafia posterior y colpocleisis.
  5. Transporte el tejido al laboratorio en un recipiente estéril de recolección de muestras con solución salina normal o medios DMEM/F12 (Gibco) sin suero. Mantener en hielo.

2. Procesamiento y digestión de tejidos

  1. Preparación de tejidos
    1. Mida y corte el tejido para abarcar todo el grosor del epitelio vaginal, creando segmentos de aproximadamente 1cm2.
    2. Asegure una medición precisa del tamaño de la biopsia de 1 cm2.
      NOTA: La sobreestimación del tamaño de la biopsia de tejido puede afectar la digestión del tejido.
    3. Prepare 2-3 biopsias vaginales adicionales de1 cm2 cada una de un solo donante y reserve las biopsias.
  2. Digestión mecánica
    1. Colocar la biopsia vaginal en una placa de Petri de cultivo celular de 10 cm. Pipetear 500-1.000 μL de medio sin suero suplementado con 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 2,5 μg/mL de anfotericina Bonto el tejido vaginal para evitar que el tejido se reseque.
    2. Picar el tejido vaginal en pequeños fragmentos con dos bisturíes estériles (n.º 11 o n.º 15) con ambas manos.
    3. Asegúrese de que las puntas de las cuchillas estén perpendiculares a la superficie del tejido. Aplique una presión igual y constante sobre la superficie del tejido, utilizando dos bisturíes. Realice una acción de tracción alterna para cortar el tejido en trozos muy pequeños.
    4. Repita esta técnica de picado utilizando la técnica de dos bisturíes hasta que la muestra tenga una consistencia uniforme con trozos de 1-2 mm.
      NOTA: La digestión mecánica con esta técnica de dos bisturíes deuna biopsia de 1 cm2 debería tardar aproximadamente 15-20 minutos en completarse.
    5. Añadir 2-3 mL de medio DMEM/F12 sin suero suplementado con 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 2,5 μg/mL de anfotericina B a la placa, suspendiendo el tejido picado. Pipetea la solución que contiene fragmentos de tejido hacia arriba y hacia abajo para romper los grumos.
  3. Digestión enzimática
    1. Transfiera la solución que contiene fragmentos de tejido a un tubo cónico de 15 mL. Agregue medios DMEM/F12 sin suero a la placa de cultivo de tejidos donde se picó el tejido vaginal para recolectar los fragmentos de tejido restantes. Transfiera la solución que contiene fragmentos de tejido al tubo cónico. Agregue medios DMEM/F12 adicionales sin suero hasta que el volumen total sea de 10 mL.
    2. Disolver 5 mg de Liberasa en 1 mL de agua estéril (5 mg/mL). Almacenar en alícuotas de 230 μL a -20 °C durante un máximo de un mes o -80 °C durante 6 meses.
    3. Añadir 230 μL de Liberasa (stock 13 U/mL) al tubo, con una concentración final de 0,3 U/mL.
      NOTA: La actividad de la liberasa puede variar de un lote a otro. Descongele cada alícuota inmediatamente antes de usarla con un baño de agua. Evite congelar y descongelar repetidamente.
    4. Repita los pasos 2.1-2.3 para 2-3 biopsias vaginales adicionales de la misma donante.
      NOTA: Mantenga cada solución que contenga fragmentos de tejido de una sola biopsia en tubos cónicos separados. Por ejemplo, 4 biopsias vaginales en 4 tubos. Esto es importante para una granulación óptima de las células después de la centrifugación.
    5. Incubar los tubos durante 3 h a 37 °C con agitación constante y vigorosa utilizando un mezclador de muestras.
    6. Coloque un mezclador de muestras en una incubadora deCO2 . Mantener una agitación constante. (Ajustes del mezclador de muestra: 25 rpm de movimiento de rotación durante 5 s, 30° de movimiento recíproco (rotación de inclinación) durante 5 s y 2° de movimiento de vibración (vórtice) durante 3 s).
    7. Durante la incubación, agite los tubos a intervalos de 30 minutos.
    8. Centrifugar las muestras a 3.000 x g durante 5 min. Retire y deseche el sobrenadante.
    9. Vuelva a suspender el pellet en medios DMEM/F12 de 1-2 mL con suero fetal bovino (FBS) al 10% y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 2,5 μg/mL de anfotericina B para diluir la enzima Liberasa. Pipetear enérgicamente hasta que el pellet se vuelva a suspender por completo.

3. Cultivo celular

  1. Extracción de fragmentos de tejido no digeridos
    1. Coloque un colador de células de 100 μm sobre un recipiente cónico estéril de 50 mL.
    2. Agrupar la suspensión celular de las múltiples biopsias de tejido del mismo donante.
    3. Cuele la suspensión de tejido/enzima, presionando con un émbolo de jeringa de 5 mL. Repita este paso hasta que los fragmentos de tejido restantes parezcan estar completamente presionados.
      NOTA: Puede haber algo de mucosidad de los fragmentos de tejido de la vagina que no se ha trabajado completamente a través del colador. Deseche la mucosidad con el colador de células.
  2. Agrupación de cultivos celulares
    1. Suspensión de células agrupadas en placa de múltiples biopsias vaginales (del mismo donante) en una placa de Petri (60 mm x 15 mm).
    2. Incubar la placa de Petri en una incubadora deCO2 a 37 °C durante la noche.
    3. Observar y confirmar la presencia de células no adherentes con un microscopio de contraste de fase.
    4. Asegúrese de que el enfoque del microscopio esté en la parte inferior de la placa.
      NOTA: Puede haber muchas células inmunitarias en primer plano. Se unirá un número menor de fibroblastos a la parte inferior de la placa.
    5. Espere entre 18 y 24 horas antes de cambiar el medio de cultivo celular para garantizar una adherencia celular adecuada.
    6. Cambie el medio de cultivo cada tres días hasta que se produzca un 80% de confluencia. Cuando las células alcancen el 80-90% de confluencia, expándalas a un matraz más grande o congele las alícuotas de las células para su uso futuro.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se recolectó tejido vaginal de 10 donantes independientes sometidas a cirugía de prolapso de órganos pélvicos. Utilizando el protocolo descrito, se aislaron células de tejido vaginal humano. Las poblaciones celulares tenían una apariencia característica alargada, plana y en forma de huso. Al igual que otros estudios, observamos una capacidad de duplicación celular significativamente más lenta y una menor capacidad clonogénica de los fibroblastos con el aumento de la edad del donante. Estas diferencias fueron marcadas al comparar los fibroblastos aislados de individuos mayores (75-78 años) con los aislados de individuos jóvenes (35-47 años). Las células de donantes de mediana edad mostraron un perfil intermedio (56-61 años). Las tasas de proliferación celular se estimaron inicialmente mediante visualización directa utilizando un microscopio de contraste de fase con la misma densidad de siembra conocida.

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Figura 1: Representación esquemática del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 1 muestra una representación esquemática del protocolo de disociación y aislamiento. Siguiendo estos pasos, este protocolo produjo una tasa de éxito del 90% en el aislamiento primario de fibroblastos en nueve de cada diez donantes en un número de células suficiente para permitir el subcultivo de células. La mediana de edad de los donantes fue de 59 años.

Protocolo (Autor, año)Tejido del donante del protocolo originalNúmero de donantesEdad del donante en añosFibroblastos obtenidosMorfología
Ruiz-Zapata et al., 2013Vagina humana356-78NoN/A
Khan et al., 2016Oreja y cola de ratón248-65NoN/A
Waise et al., 2019Tejido humano356-75NoN/A
Nadalutti et al., 2020Prepucio humano165NoN/A
ActualVagina humana1035-79SíEn forma de husillo

Tabla 1: Comparación de protocolos para el aislamiento exitoso de fibroblastos vaginales humanos. Comparación de los diferentes protocolos existentes con el nuestro y evidenciado por los resultados morfológicos.

En la Tabla 1 se muestran los resultados del uso de otros protocolos para intentar el aislamiento de fibroblastos vaginales en este estudio. Desarrollamos un protocolo estándar para el aislamiento de fibroblastos primarios de la mucosa vaginal y de donantes mayores5.

Probamos varios protocolos establecidos, incluidos los enumerados en la Tabla 1, y no observamos éxito en el aislamiento celular utilizando estos protocolos en nuestro estudio. Proponemos las siguientes razones para sus limitaciones.

El protocolo publicado por Ruiz et al.3 consiste en raspar la fascia y cortar el tejido en trozos pequeños. En nuestra experiencia, es difícil distinguir la fascia, y los intentos de raspado pueden resultar en una reducción significativa en el rendimiento celular. Si bien este método es sencillo, carece de detalles críticos, lo que limita su generalización. Además, la digestión mecánica en este protocolo parece insuficiente para el tejido postmenopáusico, que tiende a ser más denso.

Los protocolos publicados por Khan et al.9 y Waise et al.13 emplean tijeras para el picado de tejidos, que no introducen fuerzas de cizallamiento multidireccionales significativas en comparación con la técnica del bisturí. En nuestra experiencia, el método de las tijeras tampoco funcionó de manera efectiva.

Por último, el protocolo de Nadalutti et al.14 , que utilizó el método del explante, no logró producir fibroblastos en nuestras manos. Este método puede ser menos efectivo debido a la naturaleza del tejido posmenopáusico, que puede requerir un procesamiento mecánico y enzimático más agresivo para disociar los fibroblastos con éxito.

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Figura 2: Imagen de contraste de fase de las células suspendidas en el día 0. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 2 muestra las celdas suspendidas en el día 0 utilizando nuestro protocolo.

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Figura 3: Imagen de contraste de fase de fibroblastos primarios vaginales en el día 14 de cultivo con un aumento de 100x de una suspensión celular combinada de tres biopsias de tejido de 1cm2 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 3 muestra fibroblastos primarios con un aumento de 100x a partir de una suspensión celular combinada de 3 biopsias de tejido de 1 cm² de dimensiones.

La identidad de los fibroblastos se investigó mediante técnicas de inmunofluorescencia como se describió anteriormente, con modificaciones menores. Para verificar el origen celular de las células vaginales primarias, utilizamos biomarcadores específicos de origen fibroblástico mediante tinción inmunofluorescente. Las células se identificaron como fibroblastos a partir de la tinción positiva de vimentina (Figura 4), F-actina y α-SMA de muestras de tejido premenopáusico y posmenopáusico (Figura 5). Los fibroblastos se cultivaron hasta la expansión con alta viabilidad (>90%) para su uso en experimentos.

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Figura 4: Tinción positiva de vimentina de fibroblastos vaginales. Los fibroblastos primarios aislados de tejido premenopáusico y postmenopáusico se sometieron a análisis de FI y las imágenes se tomaron con un aumento de 200x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Tinción positiva de F-actina y α-SMA de fibroblastos vaginales. Los resultados de la expresión de proteínas en comparación con el control de IgG. Las imágenes se recogieron con un aumento de 200x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muchos estudios previos han reportado cómo aislar fibroblastos primarios de la vagina humana 3,7. Varios estudios utilizaron tejido vaginal humano de individuos premenopáusicos con prolapso de órganos pélvicos. A pesar de que algunos trabajos reportaron el uso de tejido de individuos premenopáusicos y postmenopáusicos 7,11, no describieron con suficiente detalle el protocolo utilizado para aislar con éxito fibroblastos de donantes mayores o posmenopáusicos. La pared vaginal es más gruesa en las mujeres posmenopáusicas con prolapso genital que en las premenopáusicas, lo que puede explicar el aumento de la dificultad con el aislamiento en esta población13. El aislamiento exitoso de las donantes posmenopáusicas es esencial para el modelado y la investigación de la enfermedad, ya que los trastornos del suelo pélvico son más prevalentes en los grupos de edad posmenopáusica o mayores.

Establecimos un protocolo para recolectar y cultivar fibroblastos vaginales humanos de donantes de 35 a 78 años. El origen celular de las células vaginales primarias se confirmó mediante biomarcadores de origen fibroblástico mediante tinción inmunofluorescente.

El procedimiento de aislamiento de fibroblastos vaginales humanos presentado aquí permite el aislamiento y el cultivo de células de fibroblastos primarios. En nuestra experiencia, el uso de protocolos previamente publicados para tejido animal9y humano 3,14,16 para la disociación de células primarias no logró extraer ningún fibroblasto de muestras de vagina humana en este estudio14.

Planteamos la hipótesis de dos razones probables para los desafíos de la disociación celular del tejido vaginal humano: (1) el grosor dérmico de la mucosa es mayor en los donantes mayores y, en comparación con el del tejido no mucoso de los donantes mayores13,17, lo que dificulta la disociación celular y (2) la densidad de los fibroblastos puede reducirse notablemente en los individuos mayores17.

Dados estos desafíos, hay algunos pasos críticos en este protocolo que no deben modificarse. El primer paso crítico es la implementación de una digestión mecánica muy rigurosa. En este caso, utilizamos la técnica de los dos bisturíes. En nuestra experiencia, la sustitución con tijeras para picar el tejido no produce fragmentos lo suficientemente pequeños como para disociar los fibroblastos del tejido vaginal humano.

El otro paso crítico es la combinación de la suspensión celular y la combinación de 3-4 biopsias de espesor completo (1 cm2) de un solo donante. Esto es necesario para obtener suficientes células para el cultivo continuo. En todos los casos, recolectamos significativamente más tejido de 1cm2 ya que el exceso de epitelio vaginal se recorta como parte necesaria de la cirugía de prolapso de órganos pélvicos. En este estudio, solo agrupamos suspensiones celulares que se originaron en el mismo donante, ya que buscamos investigar y diferenciar las características celulares y la proliferación entre varios donantes.

Nuestro protocolo tiene una clara ventaja: la digestión mecánica y enzimática conduce a mejores rendimientos para el tejido posmenopáusico, pero no tiene un impacto negativo en las muestras premenopáusicas.

Reconocemos varias limitaciones de nuestro protocolo. El acceso al tejido vaginal humano puede ser difícil en situaciones en las que no se realiza una cirugía de prolapso vaginal. La necesidad de agrupar suspensiones celulares de múltiples muestras de biopsia de tejido también puede ser una limitación.

En conclusión, este protocolo de adquisición de fibroblastos vaginales humanos será una herramienta útil para futuras investigaciones sobre los trastornos del suelo pélvico, especialmente en individuos postmenopáusicos, así como una importante adición a la investigación de la salud de la mujer.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No tenemos conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos gustaría expresar nuestra gratitud a todos los miembros del Centro Vincent de Biología Reproductiva del Hospital General de Massachusetts, así como a la Fundación del Hospital VIncent Memorial, por su generoso apoyo. Un agradecimiento especial al Dr. Bo Rueda y su laboratorio por sus valiosas sugerencias y por prestarnos equipos de laboratorio.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anfotericina BBio TechneB23192
Filtro de células (100 μ m)ThermoFisher Scientific22363549
Tubos de centrífuga cónicos (15 mL)Fisher Scientific 14-959-53A
DMEM/F12ThermoFisher Scientific11320033
Bisturí Desechable de Plumas Nº 15SocorexFB.15
Suero Fetal BovinoSigma Aldrich NC1983075
Tubos de centrífuga cónicos de alta claridad (50 mL)Fisher Scientific 14-432-22
HulaMixer Mezclador de muestrasThermoFisher Scientific15920D
Fibronectina Humana DuoSet ELISAR& D SystemsDY1918-05
Pro-Colágeno Humano I alfa 1 DuoSet ELISAR& D SystemsDY6220-05
Liberase Research GradeSigma Aldrich05 401 119 001
Penicilina/estreptomicina (5000U/ml)ThermoFisher Scientific15070063
Placas de Petri, poliestireno (100 mm x 20 mm)Millipore SigmaP5606
Pipetas serológicas (10 mL)ThermoFischer Scientific170356N
Jeringas estériles (5 mL)Fischer Scientific14-955-458

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