Este protocolo agiliza la producción de vectores retrovirales y la transducción de células T murinas, lo que facilita la generación eficiente de células CAR-T de ratón.
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Artículo de método
Generación eficiente de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) murino
En este artículo
Resumen
Resumen
Las terapias celulares diseñadas que utilizan células T receptoras de antígenos quiméricos (CAR) han logrado una eficacia notable en individuos con neoplasias malignas hematológicas y actualmente están en desarrollo para el tratamiento de diversos tumores sólidos. Hasta ahora, la evaluación preliminar de nuevos productos de células CAR-T se ha llevado a cabo predominantemente en modelos tumorales de xenoinjertos utilizando ratones inmunodeficientes. Este enfoque se elige para facilitar el injerto exitoso de células CAR-T humanas en el entorno experimental. Sin embargo, los modelos de ratón singénicos, en los que los tumores y las células CAR-T se derivan de la misma cepa de ratón, permiten evaluar nuevas tecnologías de CAR en el contexto de un sistema inmunitario funcional y un microambiente tumoral integral (TME). El protocolo descrito aquí tiene como objetivo agilizar el proceso de generación de células CAR-T de ratón mediante la presentación de métodos estandarizados para la transducción retroviral y el cultivo ex vivo de células T. Los métodos descritos en este protocolo se pueden aplicar a otras construcciones de CAR más allá de las utilizadas en este estudio para permitir la evaluación rutinaria de nuevas tecnologías de CAR en sistemas inmunocompetentes.
Introducción
Las terapias adoptivas de células T que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR) han revolucionado el campo de la inmunoterapia contra el cáncer al aprovechar el poder del sistema inmunitario adaptativo para atacar y eliminar específicamente las células cancerosas con antígeno positivo1. Si bien el éxito de las terapias de células CAR-T dirigidas a las neoplasias malignas de células B ha sido validado clínicamente, los estudios preclínicos realizados en modelos animales siguen siendo vitales para el desarrollo de nuevos CAR dirigidos a tumores sólidos. Sin embargo, hasta el momento se ha demostrado una eficacia cl....
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Protocolo
Todos los procedimientos con animales se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Universidad de Columbia, protocolos AC-AABQ5551 y AC-AAAZ4470) utilizando ratones hembras BALB/c o CF57BL/6 de 6-8 semanas de edad con un peso de entre 20-25 g. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Este protocolo se estructura en torno a los "días posteriores a la activación" de las células T murinas, y la producción viral comienza en el día -2. El retrovirus puede almacenarse a -80 °C después de la producción inicial, y para el uso futuro de este protocolo, se puede comenzar con el paso ....
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Resultados
El protocolo descrito aquí tiene como objetivo estandarizar el proceso de transducción de células T murinas para la generación de células CAR-T de ratón. La Figura 1 proporciona una descripción detallada de los pasos involucrados. El proceso comienza con la producción de vectores retrovirales a través de la co-transfección de componentes virales en células Phoenix Eco. La Figura 2 proporciona una imagen de la densidad óptima de las células Phoenix Eco e.......
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Discusión
Este protocolo describe los pasos y reactivos necesarios para la transducción retroviral de células T murinas para generar células CAR-T para estudios in vivo . La optimización de las condiciones de transducción retroviral logra una expresión robusta de CAR sin la necesidad de concentración viral a través de ultracentrifugación o reactivos adicionales. Sin embargo, existen múltiples modificaciones que se pueden aplicar a esta metodología.
Si bien este protocolo describe el ejemplo de .......
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Divulgaciones
No se declaran conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a L. Brockmann por la revisión crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por NIH 1R01EB030352 y UL1 TR001873.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,45 μ m filtros | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
| jeringa de 1 mL | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL | Fisher Scientific | 05-408-135 | |
| jeringa de 10 mL | BD | 14-823-16E | |
| 100 μ m colador | Corning | 07-201-432 | |
| 15 cm TC placas de cultivo celular tratadas | ThermoFisher Scientific | ||
| tubos cónicos de 15 mL | Halcón | 14-959-70C | |
| 40 μ M colador | Corning | 07-201-430 | |
| Tubos cónicos de 50 mL | Halcón | 14-959-49A | |
| 70 μ m filtro | Corning | 07-201-431 | |
| Attune NxT Citómetro de flujo | ThermoFisher Scientific | ||
| BALB/C, 6-8 semanas de edad | Laboratorio Jackson | 651 | |
| B-Mercaptoetanol | Gibco | 21985023 | |
| Albúmina sérica bovina | GOLDBIO | A-420-500 | |
| DMEM Medio | Gibco | 11965092 | |
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco, sin calcio ni magnesio; | Gibco | 14-190-250 | |
| DynaMag-2 Imán | Invitrogen | 12-321-D | |
| EasySep Magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse T Kit de aislamiento | Stemcell Technologies | 19851 | |
| Tampón FACS | BD | BDB554657 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Corning | MT35011CV | |
| GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
| G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
| Solución tampón HEPES | Gibco | 15-630-080 | |
| IL-15 recombinante humano | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
| IL-2 recombinante humano | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
| IL-7 recombinante humano | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| MEM Solución de aminoácidos no esenciales | Gibco | 11140-050 | |
| Ratón Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
| Ratón Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
| Ratón Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
| Ratón Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
| Ratón Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
| Ratón Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
| Nikon Ti2 con cámara Prime 95B | Placas de 24 pocillos sin tratar de Nikon | ||
| CytoOne | CC7672-7524 | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
| pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
| Solución de penicilina/estreptomicina | Gibco | 15-070-063 | |
| Células Phoenix Eco | ATCC | CRL-3214 | |
| pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
| pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Producido por R.LV. | |
| SfGFP PURIFICADO | N/A | producido por R.LV. | |
| RetroNectin ('reactivo de transducción') | Takara Bio | T100B | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Pipeta serológica 10 | mL Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipeta serológica 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Pipeta serológica 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Piruvato de sodio | Gibco | 11-360-070 | |
| Placas de 24 pocillos tratadas con TC | Corning | 08-772-1 | |
| Azul de tripán | Gibco | 15-250-061 |
Referencias
- June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
- Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
- Hou, A. J., Chen,....
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Reimpresiones y permisos
