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Artículo de método

Aislamiento de astrocitos puros y microglía de la médula espinal de ratón adulto para ensayos in vitro y estudios transcriptómicos

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DOI:

10.3791/65893

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20 de octubre de 2023

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1Department of Anatomy and Cell Biology, The George Washington University School of Medicine

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el aislamiento de astrocitos y microglía purificados de la médula espinal de ratones adultos, lo que facilita aplicaciones posteriores como el análisis de ARN y el cultivo celular. Incluye métodos detallados de disociación celular y procedimientos diseñados para mejorar tanto la calidad como el rendimiento de las células aisladas.

Resumen

Los astrocitos y la microglía desempeñan un papel fundamental en el desarrollo del sistema nervioso central, las respuestas a lesiones y las enfermedades neurodegenerativas. Estas células altamente dinámicas exhiben respuestas rápidas a los cambios ambientales y muestran una heterogeneidad significativa en términos de morfología, perfiles transcripcionales y funciones. Si bien nuestra comprensión de las funciones de las células gliales en la salud y la enfermedad ha avanzado sustancialmente, sigue siendo necesario realizar análisis in vitro específicos de células en el contexto de lesiones o lesiones para caracterizar de manera exhaustiva las distintas poblaciones celulares. El aislamiento de células del ratón adulto ofrece varias ventajas sobre las líneas celulares o los animales neonatos, ya que permite el análisis de células en condiciones patológicas y en momentos específicos. Además, centrarse en el aislamiento específico de la médula espinal, excluyendo la afectación cerebral, permite investigar patologías de la médula espinal, incluida la encefalomielitis autoinmune experimental, la lesión de la médula espinal y la esclerosis lateral amiotrófica. Este protocolo presenta un método eficiente para aislar astrocitos y microglía de la médula espinal del ratón adulto, lo que facilita el análisis inmediato o futuro con aplicaciones potenciales en estudios funcionales, moleculares o proteómicos posteriores.

Introducción

Los astrocitos y la microglía son células gliales versátiles que desempeñan funciones vitales en el sistema nervioso central (SNC), abarcando responsabilidades como la regulación de la función neuronal, la contribución al desarrollo del SNC, el mantenimiento de la barrera hematoencefálica y la participación en otros procesos críticos 1,2,3,4 . Además de su papel en el mantenimiento de la homeostasis, estas células gliales también desempeñan un papel fundamental en los mecanismos de lesión y reparación. Las microglías son bien conocidas por sus capacidades fagocíticas, inflamatorias y migratorias después de lesiones o lesiones 5,6,7. Las respuestas de los astrocitos en la enfermedad son igualmente diversas, abarcando contribuciones a la inflamación, la formación de cicatrices gliales y el compromiso de la barrera hematoencefálica 8,9. Aunque nuestra comprensión de las funciones perjudiciales y reparadoras de la microglía y los astrocitos en el SNC ha crecido, la heterogeneidad inherente tanto en su estructura como en su función requiere herramientas sólidas para estudiarlos en diversos contextos.

Obtener más información sobre el papel de la microglía y los astrocitos en la salud y la enfermedad requiere un enfoque combinado de investigaciones in vivo e in vitro . Las técnicas in vivo aprovechan la intrincada diafonía entre las células gliales y las neuronas dentro del SNC, mientras que las metodologías in vitro resultan valiosas a la hora de evaluar las funciones o respuestas de una sola célula bajo estímulos específicos. Cada método ofrece ventajas únicas; Los estudios in vitro son esenciales para comprender las funciones específicas de estos tipos de células sin la entrada directa o indirecta de células vecinas. Además, los ensayos in vitro que utilizan líneas celulares inmortales presentan ciertos beneficios, incluida la capacidad de proliferar indefinidamente, la rentabilidad y la facilidad de mantenimiento. Sin embargo, es importante tener en cuenta que las células primarias imitan más de cerca las respuestas fisiológicas normales en comparación con las líneas celulares. Esta relevancia fisiológica es crucial en los ensayos funcionales y en los análisis transcriptómicos.

Uno de los retos en la obtención de células primarias, particularmente de la médula espinal de ratones adultos, radica en la cantidad y viabilidad de las muestras. La médula espinal adulta, al ser más pequeña que el cerebro y contener una cantidad significativa de mielina, plantea dificultades únicas. Si bien existen varios protocolos publicados que detallan el aislamiento de células gliales puras y viables de animales neonatos o del cerebro de ratón adulto 10,11,12,13, estas metodologías pueden no ser adecuadas para estudiar enfermedades y lesiones específicas de la médula espinal. En este protocolo, ofrecemos un procedimiento integral para aislar de manera eficiente la microglía y los astrocitos puros y viables de la médula espinal del ratón adulto, lo que facilita las aplicaciones posteriores en cultivos celulares y análisis transcriptómicos. Este protocolo se ha empleado con éxito para aislar estas células de ratones adultos de 10 semanas a 5 meses, lo que demuestra su utilidad en varios contextos, incluidos estudios con ratones knockout condicionales, respuestas a fármacos, investigación del desarrollo y modelos relacionados con la edad.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales y de cuidado de los animales se llevaron a cabo tras la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud de la Universidad George Washington (Washington, D.C., EE. UU.; IACUC#2021-004). El estudio utilizó ratones machos y hembras C57BL/6J de tipo salvaje (WT) de 10 semanas a 5 meses, que se obtuvieron de un proveedor comercial (ver Tabla de materiales) y se alojaron en la Universidad George Washington. En la Figura 1 se presenta una descripción general del flujo de trabajo del protocolo.

1. Preparación de la médula espinal

  1. Anestesiar a los animales con Avertin (12,5 mg/mL de 2,2,2-tribromoetanol y 2,5% de 2-metil-2-butanol en agua estéril) (ver Tabla de Materiales). Confirmar la ausencia de respuesta a los pellizcos de los dedos de los pies y la cola en los ratones.
  2. Realice la perfusión cardíaca con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) fría de 1x Dulbecco para eliminar las células mononucleares de sangre periférica.
    1. Coloque al animal en una bandeja poco profunda y haga una incisión lateral para exponer la cavidad pleural. Inserte una aguja de perfusión de 23 G conectada a una bomba peristáltica (ver Tabla de materiales) en el ventrículo izquierdo y active la bomba. Una vez que el DPBS frío fluya a través del corazón, cree una pequeña incisión en la aurícula derecha.
      NOTA: Se prefiere una velocidad de perfusión más rápida en este paso para mejorar la viabilidad celular. La sangre debe eliminarse en menos de 1 minuto. La limpieza del hígado indica una perfusión exitosa.
  3. Decapitar al animal con unas tijeras grandes y extraer la columna vertebral14. Sumérjalo en 1x DPBS frío con Ca2+/Mg2+/0,2% de glucosa en una placa de Petri con hielo para enjuagar los tejidos.
  4. A partir de ahora, asegúrese de que todos los pasos se lleven a cabo en un entorno estéril. Utilice la extrusión hidráulica14 para aislar toda la médula espinal. Emplee una aguja de 18 g y una jeringa de 10 ml llena de DPBS 1x frío con Ca2+/Mg2+/0,2% de glucosa. Transfiera la médula espinal a una placa de Petri colocada sobre bolsas de hielo que contengan suficiente DPBS frío 1x con Ca2+/Mg2+/0,2% de glucosa para sumergir todo el tejido.
  5. Retire con cuidado las meninges bajo un microscopio dentro de una campana de flujo laminar. Transfiera la médula espinal a una placa de Petri vacía en bolsas de hielo y, con un bisturí quirúrgico de hoja No. 10, corte toda la médula espinal en secciones de 2-3 mm.

2. Disociación enzimática de células

  1. Agregue la mezcla de enzimas 1 y la mezcla de enzimas 2 del kit de disociación cerebral para adultos disponible en el mercado siguiendo el protocolo del fabricante (consulte la tabla de materiales). Agitar las enzimas en la placa varias veces para asegurar un recubrimiento uniforme de la médula espinal, luego incubar a 37 °C durante 30 min. Cada 5 minutos, agite suavemente el plato para evitar la formación de grumos en el tejido y facilitar la distribución uniforme de los reactivos.
  2. Retire la placa de la incubadora y agregue 350 μL de 0,46 mg/ml de ADNasa I en medio esencial mínimo (MEM) (ver Tabla de Materiales). Mezcle girando suavemente.
  3. Agregue 1 ml de DMEM frío / 0.5% de suero fetal bovino (FBS) y mezcle agitando suavemente. Transfiera inmediatamente todo el contenido a un tubo de 5 ml.

3. Disociación celular mecánica

  1. Con una pipeta P1000, triture suavemente el tejido tres veces, asegurándose de que los trozos de tejido se estiren cada vez para disociar aún más el tejido. A continuación, con una pipeta Pasteur de vidrio de 9" taponada, triture suavemente cinco veces más, asegurándose de que no se generen burbujas durante el proceso.
  2. Coloque el tubo de 5 ml en posición vertical y deje que el tejido se asiente en el fondo durante 30 s. Una vez que el tejido se haya asentado, extraer el sobrenadante con una pipeta P1000 y pasarlo a través de un filtro de 30 μm a un tubo cónico de 15 ml.
  3. Al mismo tubo de 5 ml con el tejido restante, agregue 1 ml de DMEM frío/FBS al 0,5%. Con una pipeta Pasteur, triture suavemente tres veces.
  4. Deje que el tejido se asiente en el fondo durante 30 s, luego pase el sobrenadante a través de un filtro de 30 μm y recójalo en el mismo tubo de 15 ml que antes. Repita los pasos 3.3 y 3.4 una vez más.
  5. Centrifugar la suspensión celular filtrada a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT). Retire y deseche con cuidado el sobrenadante resultante con un aspirador de vacío.

4. Eliminación de mielina

  1. Elimine la mielina con la solución de eliminación de residuos (DRS, por sus siglas en inglés) que se proporciona en el kit de disociación cerebral para adultos siguiendo el protocolo del fabricante. Después de eliminar los residuos, agregue 5 ml de DMEM frío / 0.5% FBS al gránulo de la celda e invierta suavemente el tubo tres veces. Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT).
    NOTA: Si las células se van a utilizar para estudios in vitro y van a permanecer en cultivo, se debe utilizar DMEM/FBS al 0,5% precalentado.
  2. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 1 mL de DPBS/0,5% de FBS (frío para estudios de ARN y tibio para ensayos in vitro ). Cuente las células y evalúe la viabilidad con Trypan Blue.
    NOTA: Las suspensiones celulares de varios animales pueden combinarse para aumentar la concentración celular.
  3. Lave las células añadiendo DPBS/0,5% de FBS hasta un volumen total de 5 ml. Centrifugar la suspensión a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante con una pipeta.

5. Aislamiento de microglía y astrocitos

  1. Etiquete las células con microesferas anti-CD11b o anti-ACSA-2 siguiendo el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
  2. Ordene las celdas por selección positiva utilizando las columnas MS de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Después de la clasificación, centrifugue las células clasificadas a 300 x g durante 10 minutos y deseche el sobrenadante.

6. Células de siembra para ensayos in vitro

NOTA: Si las células no se van a sembrar y se van a utilizar inmediatamente para el análisis de ARN, continúe con el paso 8.

  1. Vuelva a suspender las células en 1 ml de DMEM tibio/FBS al 0,5%. Cuente las células y evalúe su viabilidad utilizando un hemacitómetro (ver Tabla de Materiales).
  2. Ajuste la concentración celular a 75.000 células por cada 50 μL. Agregue 50 μL de la suspensión celular a cada cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina11 en una placa de 24 pocillos.
  3. Incubar a 37 °C durante 2 h para permitir que las células se adhieran al cubreobjetos.
  4. Agregue con cuidado 450 μL de DMEM tibio/5% de FBS/Penicilina-Estreptomicina (Pen-Strep, consulte la Tabla de materiales) a cada pocillo.
  5. Después de 3 días, reemplace la mitad del medio con 250 μL de DMEM tibio/5% FBS/Pen-Strep. Para el mantenimiento, reemplace completamente el medio con 500 μL de DMEM tibio/5% FBS/Pen-Strep cada 4-5 días.

7. Inmunohistoquímica

NOTA: Es mejor realizar análisis inmunohistoquímicos después de al menos 3 días cuando el medio se ha reemplazado al menos una vez. Esto asegura que se hayan eliminado los residuos y que las células se hayan adherido completamente al cubreobjetos.

  1. Retirar el medio y etiquetar las células con mAb O4 antiratón (1:100) (ver Tabla de materiales) en DMEM tibio/5% FBS/10% suero normal de cabra (NGS) durante 15 min a temperatura ambiente (RT) o a 37 °C.
    NOTA: Omita este paso y continúe con el paso 7.3 si las celdas no se etiquetan con O4.
  2. Enjuague suavemente los cubreobjetos sumergiéndolos en DMEM/5% FBS tibio tres veces. Añadir 594 IgM (1:300) (ver Tabla de Materiales) en DMEM/5% FBS/10% NGS tibio e incubar a RT durante 15 min en la oscuridad. Enjuague suavemente tres veces en DMEM/5% FBS tibio.
  3. Fijar las celdas con ácido acético/metanol frío al 5% durante 15 min a 4 °C. Lavar tres veces con 1x PBS, luego etiquetar con el anticuerpo apropiado: GFAP anti-conejo (1:500), GFAP anti-ratón (1:500) o Iba1 anti-conejo (1:500) en 1% Triton-X100/10% NGS en 1x DPBS (ver Tabla de Materiales). Incubar durante 1 h a RT.
    NOTA: Mantenga los cubreobjetos en la oscuridad si ya han sido manchados con O4.
  4. Enjuague suavemente tres veces con PBS. Etiqueta con el anticuerpo secundario adecuado: anti-ratón 594 IgG (1:500), anti-conejo 488 IgG (1:500) (ver Tabla de Materiales). Incubar durante 30 minutos a RT en la oscuridad.
  5. Enjuague suavemente tres veces con PBS. Contratiñir con DAPI (1:1000) durante 1 min en RT. Enjuague tres veces con PBS, agregue medio de montaje (consulte la Tabla de materiales) y monte los cubreobjetos en los portaobjetos.

8. Extracción de ARN

NOTA: Lo ideal es que haya al menos 100.000 células para extraer suficiente ARN para su análisis. Si es necesario, se pueden combinar células de 2-3 médula espinal.

  1. Extraiga el ARN utilizando un kit de aislamiento de ARN disponible en el mercado siguiendo el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Para cada paso de lavado con el tampón de lavado RW1 incluido en el kit, deje las celdas en el tampón de lavado durante 2 minutos más.
  2. Elimine cualquier resto de ADN genómico utilizando la DNasa I de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Incubar con DNasa a RT durante 15 min, luego lavar con tampón RW1.
  3. Para aumentar el rendimiento de ARN, antes de la elución, incubar las muestras en agua libre de ARNasa a RT durante 10 min. Evalúe la integridad y la cantidad de ARN utilizando un bioanalizador15 (ver Tabla de Materiales).

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Resultados

Los métodos descritos en este protocolo permiten aislar la microglía y los astrocitos puros y viables de la médula espinal del ratón adulto, lo que facilita diversas aplicaciones posteriores, incluidos los ensayos funcionales o histológicos in vitro y el análisis de ARN.

Un aislamiento exitoso para estudios in vitro dará como resultado una proliferación celular continua durante varios días. Las células adultas exhiben una tasa de proliferación más lenta en comparación con las...

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Discusión

El aislamiento de células primarias puras y viables es primordial para investigar la estructura y función de tipos celulares específicos. En el ratón adulto, particularmente en la médula espinal, esta tarea plantea desafíos significativos, ya que los protocolos existentes a menudo no se adaptan a la médula espinal adulta10,17. Este protocolo presenta un método eficiente y rentable aplicable a diversas aplicaciones posteriores, incluidos los cultivos celulares, la...

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Agradecimientos

Agradecemos a Castle Raley, del Centro de Genómica de la Universidad George Washington, por los análisis de ARN y a Q2 Lab Solutions por los análisis de secuenciación de ARN. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares [subvención número F31NS117085] y la Fundación de Investigación Vivian Gill al Dr. Robert H. Miller. La figura 1 se creó con BioRender.com.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2,2,2-tribromoetanolSigma AldrichT48402
placa de cultivo de tejidos de 24 pocillosAvantor10861-558
2-metil-2-butanol, 98%Thermo FisherA18304-0F
4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidratoInvitrogenD13061:1000
solución de glucosa al 45%Corning25-037-CI
Tubos tapados de 5 mLEppendorf30122305
Ácido acéticoSigma-AdlrichA6283
Kit de disociación cerebral para adultosMiltenyi103-107-677
Kit de microesferas anti-ACSA2Miltenyi130-097-679
Anti-IBA1Wako019-1974
BioanalizadorAgilent TecnologíasG2939BA
ratones de tipo salvaje (WT) C57BL/6J Jackson Laboratories
CD11b (Microglía) MicroBeadsMiltenyi130-093-634
Celltrics 30 µ Filtro MSysmex Partec04-004-2326
Cámara de recuento (hemacitómetro)Hausser Scientific Co3200
Desoxirribonucleasa I de páncreas bovinoSigma AldrichD4527-40KU
Agua destiladaTMO15230001
DMEM/F12Thermo Fisher
DNasa para la purificación de ARNQiagen79254
Solución salina tamponada con fosfato de DulbeccoThermo Fisher14040117
Suero fetal bovinoThermo FisherA5209401
anticuerpo GFAP (ratón)Santa Cruzsc-336731:500
Anticuerpo GFAP (conejo)DakoZ03341:500
Cabra anti-ratón 594 IgGInvitrogena110321:500
Cabra anti-ratón 594 IgMInvitrogena210441:300
Cabra anti-Conejo 488 IgGInvitrogena110081:500
Iba1 anticuerpo (conejo)Wako019-19741:500
MACS SeparadorMiltenyi130-042-303
Masterflex C/L Sistema de bombaThermo Fisher77122-22
MEMCorning15-015-CV
MetanolSigma-Adlrich439193
Medio de montajeVector LaboratoriesH-1000-10
MS ColumnasMiltenyi130-042-401
O4 AnticuerpoR& DMAB1326
Penicilina-estreptomicinaGibco 15070063
Pipeta pasteur de vidrio taponada de 9"VWR14672-412
RNeasy Plus Micro KitQiagen74034
Royal-tek Hoja de bisturí quirúrgico n.º 10Fisher scientific22-079-683
Set de infusión de venas pequeñas, 23 G x 19 mmKawasumiD3K2-23G
11320074

Referencias

  1. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).
  2. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  3. Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586, 417-423 (2020).
  4. Yanuck, S. F. Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders. Front Psychiatry. 10, 712(2019).
  5. Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 896852(2022).
  6. Song, S., et al. Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury. J Neuroinflammation. 19 (1), 246(2022).
  7. Butler, C. A., et al. Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation. J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).
  8. Voskuhl, R. R., et al. Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS. J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).
  9. Bordon, Y. MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation. Nature Reviews Immunology. 20, 205(2020).
  10. Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 340, 108742(2020).
  11. Kerstetter, A. E., Miller, R. H. Isolation and culture of spinal cord astrocytes. Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).
  12. Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes. J Vis Exp. (185), 64175(2022).
  13. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147(2012).
  14. Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents. J Vis Exp. (119), e55226(2017).
  15. Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA. Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).
  16. Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 375, 109599(2022).
  17. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834(2020).
  18. Neuschulz, A., et al. A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation. Mol Syst Biol. 19, 11147(2023).
  19. CB, S., et al. One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 1-25 (2021).

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