Este protocolo describe el aislamiento de astrocitos y microglía purificados de la médula espinal de ratones adultos, lo que facilita aplicaciones posteriores como el análisis de ARN y el cultivo celular. Incluye métodos detallados de disociación celular y procedimientos diseñados para mejorar tanto la calidad como el rendimiento de las células aisladas.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Aislamiento de astrocitos puros y microglía de la médula espinal de ratón adulto para ensayos in vitro y estudios transcriptómicos
En este artículo
Resumen
Resumen
Los astrocitos y la microglía desempeñan un papel fundamental en el desarrollo del sistema nervioso central, las respuestas a lesiones y las enfermedades neurodegenerativas. Estas células altamente dinámicas exhiben respuestas rápidas a los cambios ambientales y muestran una heterogeneidad significativa en términos de morfología, perfiles transcripcionales y funciones. Si bien nuestra comprensión de las funciones de las células gliales en la salud y la enfermedad ha avanzado sustancialmente, sigue siendo necesario realizar análisis in vitro específicos de células en el contexto de lesiones o lesiones para caracterizar de manera exhaustiva las distintas poblaciones celulares. El aislamiento de células del ratón adulto ofrece varias ventajas sobre las líneas celulares o los animales neonatos, ya que permite el análisis de células en condiciones patológicas y en momentos específicos. Además, centrarse en el aislamiento específico de la médula espinal, excluyendo la afectación cerebral, permite investigar patologías de la médula espinal, incluida la encefalomielitis autoinmune experimental, la lesión de la médula espinal y la esclerosis lateral amiotrófica. Este protocolo presenta un método eficiente para aislar astrocitos y microglía de la médula espinal del ratón adulto, lo que facilita el análisis inmediato o futuro con aplicaciones potenciales en estudios funcionales, moleculares o proteómicos posteriores.
Introducción
Los astrocitos y la microglía son células gliales versátiles que desempeñan funciones vitales en el sistema nervioso central (SNC), abarcando responsabilidades como la regulación de la función neuronal, la contribución al desarrollo del SNC, el mantenimiento de la barrera hematoencefálica y la participación en otros procesos críticos 1,2,3,4 . Además de su papel en el mantenimiento de la homeostasis, estas células gliales también desempeñan un papel fundamental en los mecanismos de lesión y reparación. Las microglías son bien conocidas por s....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los procedimientos experimentales y de cuidado de los animales se llevaron a cabo tras la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud de la Universidad George Washington (Washington, D.C., EE. UU.; IACUC#2021-004). El estudio utilizó ratones machos y hembras C57BL/6J de tipo salvaje (WT) de 10 semanas a 5 meses, que se obtuvieron de un proveedor comercial (ver Tabla de materiales) y se alojaron en la Universidad George Washington. En la Figura 1 se presenta una descripción general del flujo de trabajo del protocolo.
1. Prepara....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Los métodos descritos en este protocolo permiten aislar la microglía y los astrocitos puros y viables de la médula espinal del ratón adulto, lo que facilita diversas aplicaciones posteriores, incluidos los ensayos funcionales o histológicos in vitro y el análisis de ARN.
Un aislamiento exitoso para estudios in vitro dará como resultado una proliferación celular continua durante varios días. Las células adultas exhiben una tasa de proliferación más lenta en comparación con las.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El aislamiento de células primarias puras y viables es primordial para investigar la estructura y función de tipos celulares específicos. En el ratón adulto, particularmente en la médula espinal, esta tarea plantea desafíos significativos, ya que los protocolos existentes a menudo no se adaptan a la médula espinal adulta10,17. Este protocolo presenta un método eficiente y rentable aplicable a diversas aplicaciones posteriores, incluidos los cultivos celulares, la.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Agradecimientos
Agradecemos a Castle Raley, del Centro de Genómica de la Universidad George Washington, por los análisis de ARN y a Q2 Lab Solutions por los análisis de secuenciación de ARN. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares [subvención número F31NS117085] y la Fundación de Investigación Vivian Gill al Dr. Robert H. Miller. La figura 1 se creó con BioRender.com.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2,2,2-tribromoetanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos | Avantor | 10861-558 | |
| 2-metil-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| solución de glucosa al 45% | Corning | 25-037-CI | |
| Tubos tapados de 5 mL | Eppendorf | 30122305 | |
| Ácido acético | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Kit de disociación cerebral para adultos | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Kit de microesferas anti-ACSA2 | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-IBA1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalizador | Agilent Tecnologías | G2939BA | |
| ratones de tipo salvaje (WT) C57BL/6J | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglía) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µ Filtro M | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Cámara de recuento (hemacitómetro) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Desoxirribonucleasa I de páncreas bovino | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Agua destilada | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | ||
| DNasa para la purificación de ARN | Qiagen | 79254 | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Suero fetal bovino | Thermo Fisher | A5209401 | |
| anticuerpo GFAP (ratón) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| Anticuerpo GFAP (conejo) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Cabra anti-ratón 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Cabra anti-ratón 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Cabra anti-Conejo 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 anticuerpo (conejo) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separador | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Sistema de bomba | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Metanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Medio de montaje | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columnas | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Anticuerpo | R& D | MAB1326 | |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco 15070063 | ||
| Pipeta pasteur de vidrio taponada de 9" | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Hoja de bisturí quirúrgico n.º 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Set de infusión de venas pequeñas, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
Referencias
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
