Aislamiento de astrocitos puros y microglía de la médula espinal de ratón adulto para ensayos in vitro y estudios transcriptómicos

Los astrocitos y la microglía son células gliales versátiles que desempeñan funciones vitales en el sistema nervioso central (SNC), abarcando responsabilidades como la regulación de la función neuronal, la contribución al desarrollo del SNC, el mantenimiento de la barrera hematoencefálica y la participación en otros procesos críticos 1,2,3,4 . Además de su papel en el mantenimiento de la homeostasis, estas células gliales también desempeñan un papel fundamental en los mecanismos de lesión y reparación. Las microglías son bien conocidas por sus capacidades fagocíticas, inflamatorias y migratorias después de lesiones o lesiones ^5,6,7. Las respuestas de los astrocitos en la enfermedad son igualmente diversas, abarcando contribuciones a la inflamación, la formación de cicatrices gliales y el compromiso de la barrera hematoencefálica ^8,9. Aunque nuestra comprensión de las funciones perjudiciales y reparadoras de la microglía y los astrocitos en el SNC ha crecido, la heterogeneidad inherente tanto en su estructura como en su función requiere herramientas sólidas para estudiarlos en diversos contextos.

Obtener más información sobre el papel de la microglía y los astrocitos en la salud y la enfermedad requiere un enfoque combinado de investigaciones in vivo e in vitro . Las técnicas in vivo aprovechan la intrincada diafonía entre las células gliales y las neuronas dentro del SNC, mientras que las metodologías in vitro resultan valiosas a la hora de evaluar las funciones o respuestas de una sola célula bajo estímulos específicos. Cada método ofrece ventajas únicas; Los estudios in vitro son esenciales para comprender las funciones específicas de estos tipos de células sin la entrada directa o indirecta de células vecinas. Además, los ensayos in vitro que utilizan líneas celulares inmortales presentan ciertos beneficios, incluida la capacidad de proliferar indefinidamente, la rentabilidad y la facilidad de mantenimiento. Sin embargo, es importante tener en cuenta que las células primarias imitan más de cerca las respuestas fisiológicas normales en comparación con las líneas celulares. Esta relevancia fisiológica es crucial en los ensayos funcionales y en los análisis transcriptómicos.

Uno de los retos en la obtención de células primarias, particularmente de la médula espinal de ratones adultos, radica en la cantidad y viabilidad de las muestras. La médula espinal adulta, al ser más pequeña que el cerebro y contener una cantidad significativa de mielina, plantea dificultades únicas. Si bien existen varios protocolos publicados que detallan el aislamiento de células gliales puras y viables de animales neonatos o del cerebro de ratón adulto 10,11,12,13, estas metodologías pueden no ser adecuadas para estudiar enfermedades y lesiones específicas de la médula espinal. En este protocolo, ofrecemos un procedimiento integral para aislar de manera eficiente la microglía y los astrocitos puros y viables de la médula espinal del ratón adulto, lo que facilita las aplicaciones posteriores en cultivos celulares y análisis transcriptómicos. Este protocolo se ha empleado con éxito para aislar estas células de ratones adultos de 10 semanas a 5 meses, lo que demuestra su utilidad en varios contextos, incluidos estudios con ratones knockout condicionales, respuestas a fármacos, investigación del desarrollo y modelos relacionados con la edad.

Todos los procedimientos experimentales y de cuidado de los animales se llevaron a cabo tras la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud de la Universidad George Washington (Washington, D.C., EE. UU.; IACUC#2021-004). El estudio utilizó ratones machos y hembras C57BL/6J de tipo salvaje (WT) de 10 semanas a 5 meses, que se obtuvieron de un proveedor comercial (ver Tabla de materiales) y se alojaron en la Universidad George Washington. En la Figura 1 se presenta una descripción general del flujo de trabajo del protocolo.

1. Preparación de la médula espinal

1. Anestesiar a los animales con Avertin (12,5 mg/mL de 2,2,2-tribromoetanol y 2,5% de 2-metil-2-butanol en agua estéril) (ver Tabla de Materiales). Confirmar la ausencia de respuesta a los pellizcos de los dedos de los pies y la cola en los ratones.
2. Realice la perfusión cardíaca con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) fría de 1x Dulbecco para eliminar las células mononucleares de sangre periférica.
   1. Coloque al animal en una bandeja poco profunda y haga una incisión lateral para exponer la cavidad pleural. Inserte una aguja de perfusión de 23 G conectada a una bomba peristáltica (ver Tabla de materiales) en el ventrículo izquierdo y active la bomba. Una vez que el DPBS frío fluya a través del corazón, cree una pequeña incisión en la aurícula derecha.
      NOTA: Se prefiere una velocidad de perfusión más rápida en este paso para mejorar la viabilidad celular. La sangre debe eliminarse en menos de 1 minuto. La limpieza del hígado indica una perfusión exitosa.
3. Decapitar al animal con unas tijeras grandes y extraer la columna vertebral¹⁴. Sumérjalo en 1x DPBS frío con Ca²⁺/Mg²⁺/0,2% de glucosa en una placa de Petri con hielo para enjuagar los tejidos.
4. A partir de ahora, asegúrese de que todos los pasos se lleven a cabo en un entorno estéril. Utilice la extrusión hidráulica¹⁴ para aislar toda la médula espinal. Emplee una aguja de 18 g y una jeringa de 10 ml llena de DPBS 1x frío con Ca²⁺/Mg²⁺/0,2% de glucosa. Transfiera la médula espinal a una placa de Petri colocada sobre bolsas de hielo que contengan suficiente DPBS frío 1x con Ca²⁺/Mg²⁺/0,2% de glucosa para sumergir todo el tejido.
5. Retire con cuidado las meninges bajo un microscopio dentro de una campana de flujo laminar. Transfiera la médula espinal a una placa de Petri vacía en bolsas de hielo y, con un bisturí quirúrgico de hoja No. 10, corte toda la médula espinal en secciones de 2-3 mm.

2. Disociación enzimática de células

1. Agregue la mezcla de enzimas 1 y la mezcla de enzimas 2 del kit de disociación cerebral para adultos disponible en el mercado siguiendo el protocolo del fabricante (consulte la tabla de materiales). Agitar las enzimas en la placa varias veces para asegurar un recubrimiento uniforme de la médula espinal, luego incubar a 37 °C durante 30 min. Cada 5 minutos, agite suavemente el plato para evitar la formación de grumos en el tejido y facilitar la distribución uniforme de los reactivos.
2. Retire la placa de la incubadora y agregue 350 μL de 0,46 mg/ml de ADNasa I en medio esencial mínimo (MEM) (ver Tabla de Materiales). Mezcle girando suavemente.
3. Agregue 1 ml de DMEM frío / 0.5% de suero fetal bovino (FBS) y mezcle agitando suavemente. Transfiera inmediatamente todo el contenido a un tubo de 5 ml.

3. Disociación celular mecánica

1. Con una pipeta P1000, triture suavemente el tejido tres veces, asegurándose de que los trozos de tejido se estiren cada vez para disociar aún más el tejido. A continuación, con una pipeta Pasteur de vidrio de 9" taponada, triture suavemente cinco veces más, asegurándose de que no se generen burbujas durante el proceso.
2. Coloque el tubo de 5 ml en posición vertical y deje que el tejido se asiente en el fondo durante 30 s. Una vez que el tejido se haya asentado, extraer el sobrenadante con una pipeta P1000 y pasarlo a través de un filtro de 30 μm a un tubo cónico de 15 ml.
3. Al mismo tubo de 5 ml con el tejido restante, agregue 1 ml de DMEM frío/FBS al 0,5%. Con una pipeta Pasteur, triture suavemente tres veces.
4. Deje que el tejido se asiente en el fondo durante 30 s, luego pase el sobrenadante a través de un filtro de 30 μm y recójalo en el mismo tubo de 15 ml que antes. Repita los pasos 3.3 y 3.4 una vez más.
5. Centrifugar la suspensión celular filtrada a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT). Retire y deseche con cuidado el sobrenadante resultante con un aspirador de vacío.

4. Eliminación de mielina

1. Elimine la mielina con la solución de eliminación de residuos (DRS, por sus siglas en inglés) que se proporciona en el kit de disociación cerebral para adultos siguiendo el protocolo del fabricante. Después de eliminar los residuos, agregue 5 ml de DMEM frío / 0.5% FBS al gránulo de la celda e invierta suavemente el tubo tres veces. Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT).
   NOTA: Si las células se van a utilizar para estudios in vitro y van a permanecer en cultivo, se debe utilizar DMEM/FBS al 0,5% precalentado.
2. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 1 mL de DPBS/0,5% de FBS (frío para estudios de ARN y tibio para ensayos in vitro ). Cuente las células y evalúe la viabilidad con Trypan Blue.
   NOTA: Las suspensiones celulares de varios animales pueden combinarse para aumentar la concentración celular.
3. Lave las células añadiendo DPBS/0,5% de FBS hasta un volumen total de 5 ml. Centrifugar la suspensión a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante con una pipeta.

5. Aislamiento de microglía y astrocitos

1. Etiquete las células con microesferas anti-CD11b o anti-ACSA-2 siguiendo el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
2. Ordene las celdas por selección positiva utilizando las columnas MS de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Después de la clasificación, centrifugue las células clasificadas a 300 x g durante 10 minutos y deseche el sobrenadante.

6. Células de siembra para ensayos in vitro

NOTA: Si las células no se van a sembrar y se van a utilizar inmediatamente para el análisis de ARN, continúe con el paso 8.

1. Vuelva a suspender las células en 1 ml de DMEM tibio/FBS al 0,5%. Cuente las células y evalúe su viabilidad utilizando un hemacitómetro (ver Tabla de Materiales).
2. Ajuste la concentración celular a 75.000 células por cada 50 μL. Agregue 50 μL de la suspensión celular a cada cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina¹¹ en una placa de 24 pocillos.
3. Incubar a 37 °C durante 2 h para permitir que las células se adhieran al cubreobjetos.
4. Agregue con cuidado 450 μL de DMEM tibio/5% de FBS/Penicilina-Estreptomicina (Pen-Strep, consulte la Tabla de materiales) a cada pocillo.
5. Después de 3 días, reemplace la mitad del medio con 250 μL de DMEM tibio/5% FBS/Pen-Strep. Para el mantenimiento, reemplace completamente el medio con 500 μL de DMEM tibio/5% FBS/Pen-Strep cada 4-5 días.

7. Inmunohistoquímica

NOTA: Es mejor realizar análisis inmunohistoquímicos después de al menos 3 días cuando el medio se ha reemplazado al menos una vez. Esto asegura que se hayan eliminado los residuos y que las células se hayan adherido completamente al cubreobjetos.

1. Retirar el medio y etiquetar las células con mAb O4 antiratón (1:100) (ver Tabla de materiales) en DMEM tibio/5% FBS/10% suero normal de cabra (NGS) durante 15 min a temperatura ambiente (RT) o a 37 °C.
   NOTA: Omita este paso y continúe con el paso 7.3 si las celdas no se etiquetan con O4.
2. Enjuague suavemente los cubreobjetos sumergiéndolos en DMEM/5% FBS tibio tres veces. Añadir 594 IgM (1:300) (ver Tabla de Materiales) en DMEM/5% FBS/10% NGS tibio e incubar a RT durante 15 min en la oscuridad. Enjuague suavemente tres veces en DMEM/5% FBS tibio.
3. Fijar las celdas con ácido acético/metanol frío al 5% durante 15 min a 4 °C. Lavar tres veces con 1x PBS, luego etiquetar con el anticuerpo apropiado: GFAP anti-conejo (1:500), GFAP anti-ratón (1:500) o Iba1 anti-conejo (1:500) en 1% Triton-X100/10% NGS en 1x DPBS (ver Tabla de Materiales). Incubar durante 1 h a RT.
   NOTA: Mantenga los cubreobjetos en la oscuridad si ya han sido manchados con O4.
4. Enjuague suavemente tres veces con PBS. Etiqueta con el anticuerpo secundario adecuado: anti-ratón 594 IgG (1:500), anti-conejo 488 IgG (1:500) (ver Tabla de Materiales). Incubar durante 30 minutos a RT en la oscuridad.
5. Enjuague suavemente tres veces con PBS. Contratiñir con DAPI (1:1000) durante 1 min en RT. Enjuague tres veces con PBS, agregue medio de montaje (consulte la Tabla de materiales) y monte los cubreobjetos en los portaobjetos.

8. Extracción de ARN

NOTA: Lo ideal es que haya al menos 100.000 células para extraer suficiente ARN para su análisis. Si es necesario, se pueden combinar células de 2-3 médula espinal.

1. Extraiga el ARN utilizando un kit de aislamiento de ARN disponible en el mercado siguiendo el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Para cada paso de lavado con el tampón de lavado RW1 incluido en el kit, deje las celdas en el tampón de lavado durante 2 minutos más.
2. Elimine cualquier resto de ADN genómico utilizando la DNasa I de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Incubar con DNasa a RT durante 15 min, luego lavar con tampón RW1.
3. Para aumentar el rendimiento de ARN, antes de la elución, incubar las muestras en agua libre de ARNasa a RT durante 10 min. Evalúe la integridad y la cantidad de ARN utilizando un bioanalizador¹⁵ (ver Tabla de Materiales).

Los métodos descritos en este protocolo permiten aislar la microglía y los astrocitos puros y viables de la médula espinal del ratón adulto, lo que facilita diversas aplicaciones posteriores, incluidos los ensayos funcionales o histológicos in vitro y el análisis de ARN.

Un aislamiento exitoso para estudios in vitro dará como resultado una proliferación celular continua durante varios días. Las células adultas exhiben una tasa de proliferación más lenta en comparación con las células aisladas de animales neonatos, y algunos desechos pueden estar presentes en los primeros días. A los 4 días in vitro (DIV), las células deben estar en gran parte libres de residuos, y la mayoría de las células deben adherirse al fondo del matraz. Los astrocitos comenzarán a formar procesos más largos, mientras que la microglía asumirá una forma ovalada con husos más cortos (Figura 2). A las 7 DIV, los astrocitos deberían formar una capa confluente conectada, y la microglía debería mostrar menos procesos y más cortos (Figura 3).

La pureza puede confirmarse mediante el doble marcaje de células clasificadas por ACSA2 con GFAP y O4 para evaluar la contaminación por oligodendrocitos en cultivos de astrocitos y células clasificadas por CD11b con Iba1 y GFAP para evaluar la contaminación de astrocitos en cultivos de microglía (Tabla 1).

Un protocolo exitoso también producirá ARN de alta calidad con una degradación mínima y una cantidad suficiente (Figura 4A). Los electroferogramas de ARN extraído de células aisladas deben exhibir picos prominentes de 18S y 28S. La disociación excesiva de las células o el tiempo prolongado entre la perfusión y la clasificación celular pueden conducir a la degradación del ARN (Figura 4B). Una disociación enzimática y/o mecánica insuficiente o una eliminación inadecuada de mielina pueden dar lugar a una reducción del rendimiento celular y del ARN (Figura 4C). Los astrocitos aislados se pueden secuenciar para identificar marcadores inflamatorios. La comparación de astrocitos sanos con astrocitos activados por inflamación (p. ej., de un animal experimental con encefalomielitis autoinmune) revelará ininhibiciones relativas de las vías inflamatorias en astrocitos sanos frente a astrocitos inflamatorios (Figura 4D).

Figura 1: Descripción general de la preparación de la médula espinal, la disociación de tejidos y la clasificación celular. La figura proporciona una visión general del proceso de preparación de la médula espinal, incluida la disociación de tejidos y la clasificación celular. Después de la disección de la médula espinal, los tejidos sufren disociación enzimática y mecánica. Se elimina la mielina y las células se marcan con anticuerpos anti-ACSA2 o anti-CD11b para atacar los astrocitos y la microglía. Las células clasificadas se pueden utilizar para cultivos celulares y análisis de ARN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imágenes de contraste de fase de astrocitos y microglía a los 4 días in vitro (4DIV). (A) Representa un ejemplo representativo de células clasificadas por ACSA2+ con procesos extendidos. (B) Las células CD11b+ muestran cuerpos celulares de forma ovalada y procesos cortos. Barra de escala = 50 μm. Esta figura es una adaptación de Ahn, J. J. et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes fluorescentes de astrocitos y microglía a los 8 días in vitro (8DIV). (A) Las células ACSA2+ marcadas con GFAP (verde) y O4 (rojo) exhiben una tinción mínima de O4 y forman una capa confluente conectada de astrocitos. (B) Las células CD11b+ marcadas con Iba1 (verde) y GFAP (rojo) muestran una presencia mínima de GFAP. Barra de escala = 50 μm. Esta figura es una adaptación de Ahn, J. J. et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Electroferogramas representativos de muestras de ARN. (A) Se espera ARN de alto rendimiento y alta calidad después de un aislamiento celular exitoso. (B) Se puede esperar ARN de bajo rendimiento y baja calidad o (C) ARN de bajo rendimiento y alta calidad en casos de muerte celular, disociación insuficiente o eliminación inadecuada de desechos. (D) El análisis de secuenciación de ARN de vías inflamatorias seleccionadas en astrocitos sanos frente a astrocitos inflamatorios revela una inhibición relativa de la inflamación en astrocitos sanos clasificados en comparación con astrocitos inflamatorios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Rendimiento, pureza y viabilidad de las células después de la clasificación de las células ACSA-2 y CD11b. Esta tabla es una adaptación de Ahn, J. J. et al.16.

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