Terapia fotodinámica antimicrobiana mediada por curcuminoides en un modelo murino de candidiasis oral

La candidiasis oral (OC) es la principal infección fúngica de la cavidad oral; es causada por el crecimiento excesivo de Candida spp. Los factores predisponentes para el CO incluyen la disfunción endocrina, el uso de antibióticos de amplio espectro, la radioquimioterapia y la quimioterapia, las deficiencias nutricionales, la xerostomía (bajo flujo salival), el uso de dentaduras postizas, la mala higiene y, especialmente, la inmunosupresión¹. Entre las especies de Candida, Candida albicans es la más prevalente y virulenta; Se encuentra como especie comensal en el cuerpo humano y como patógeno oportunista. C. albicans tiene la capacidad de cambiar su morfología de levaduras comensales (blastóforos) a filamentos patógenos (hifas y pseudohifas)². Las formas filamentosas, especialmente las hifas, pueden invadir el epitelio del huésped por endocitosis o penetración activa, causando infección³. Otros factores de virulencia de C. albicans incluyen la adhesión, la formación de biopelículas y la secreción de enzimas y toxinas lipolíticas e hidrolíticas, como lipasas, fosfolipasas, proteinasas y candidalisina⁴.

Los tratamientos antifúngicos implican el uso de agentes antifúngicos, especialmente polienos y azoles tópicos (nistatina y miconazol)⁵. Sin embargo, solo muestran eficacia a corto plazo y la recurrencia es frecuente. Además, el uso excesivo de antifúngicos ha dado lugar al problema del desarrollo y la propagación de la resistencia a los antifúngicos⁶. Por lo tanto, se necesitan terapias alternativas, como la terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT), que combina un fotosensibilizador (PS) y luz a una longitud de onda adecuada (la misma que la de la absorción de PS) en presencia de oxígeno. Las PS se unen a las células o son absorbidas por ellas y, cuando son activadas por la luz, producen especies reactivas de oxígeno (ROS) que son tóxicas para las células sensibilizadas⁷.

En la aPDT, uno de los fotosensibilizadores (PS) empleados es la curcumina (CUR), un compuesto natural extraído de los rizomas de la planta de cúrcuma (Curcuma longa L.). La curcumina posee numerosos atributos terapéuticos, incluyendo capacidades antiinflamatorias, antioxidantes, anticancerígenas y antimicrobianas ^8,9. Una investigación previa encontró que la aPDT que utiliza CUR disminuyó efectivamente C. albicans en un modelo murino de candidiasis oral sin causar ningún daño a los tejidos del huésped¹⁰. El CUR es el principal curcuminoide extraído de la cúrcuma, pero otros polifenoles, como la demetoxicurcumina y la bis-demetoxicurcumina, también se encuentran en esta planta. La aPDT mediada por curcuminoides demostró actividad antibacteriana contra biopelículas de Staphylococcus aureus cultivadas en catéteres¹¹. Sin embargo, hasta donde sabemos, su actividad antifúngica contra C. albicans sigue sin estar clara. Por lo tanto, en este estudio, evaluamos la aPDT mediada por una sal curcuminoide contra C. albicans en un modelo murino de CO.

El protocolo de investigación para el uso de ratones fue aprobado por el Comité de Ética para el Uso de Animales (casos números 05/2008 y 09/2020) de la Facultad de Odontología de Araraquara, UNESP. Se utilizó C. albicans (ATCC 90028) como cepa de referencia. Para el presente estudio se utilizaron ratones suizos hembra de seis semanas de edad (n = 45), con un rango de masa corporal de 20-30 g. Los animales fueron proporcionados por la Universidad Estadual Paulista, UNESP, Botucatu.

1. Preparación de PS y selección de la fuente de luz para aPDT

1. Prepare el PS de acuerdo con las especificaciones de la sustancia que se va a probar.
   NOTA: En este estudio, se utilizó una mezcla soluble en agua de curcuminoides (mezcla de sales solubles en agua a base de CUR¹²) como PS (ver Tabla de Materiales y Figura 1). Las diluciones a 20 μM, 40 μM y 80 μM (15,6, 29,2 y 58,4 mg/L, respectivamente) se prepararon en agua ultrapura inmediatamente antes de su uso y se mantuvieron a 5 °C.
2. Seleccione un equipo de luz con una longitud de onda adecuada (la misma que la de la absorción PS) capaz de iluminar todo el objetivo fotosensibilizado de manera uniforme y simultánea sin calentar el tejido.
   NOTA: En este estudio, se utilizó una pieza de mano que contenía un diodo emisor de luz (LED, ver Tabla de Materiales), que fue diseñada en el Instituto de Física de São Carlos (Universidad de São Paulo, São Carlos, SP, Brasil). La potencia de salida entregada por la luz fue de 89,2 mW/^cm2 a una longitud de onda azul de aproximadamente 455 nm.

2. Preparación del inóculo de C. albicans

1. Mantener la cepa de referencia C. albicans (ATCC 90028) en levadura-peptona-glucosa (YEPD, ver Tabla de Materiales) con glicerol al 50% a -80 °C hasta su uso.
2. Descongelar la cepa congelada a temperatura ambiente, extender una alícuota de 100 μL en una placa de Petri con agar dextrosa Sabouraud (SDA) con cloranfenicol (ver Tabla de Materiales), e incubar a 37 °C durante 48 h.
3. Transfiera cinco colonias a 10 mL de caldo de nitrógeno de levadura con medio de glucosa al 2% (YNBg) y crezca aeróbicamente a 37 °C durante 16 h.
4. Diluir el cultivo de levadura en YNBg fresco (1:10) e incubar aeróbicamente a 37 °C hasta que la densidad óptica alcance la fase logarítmica media de crecimiento.
   NOTA: Estandarizar previamente la curva de crecimiento microbiano para cada laboratorio. En la presente investigación, los cultivos se dejaron incubar durante unas 8 h, hasta que alcanzaron la fase logarítmica media de crecimiento, como indica la densidad óptica a 540 nm (OD₅₄₀), con un valor medio de 0,536 ± 0,062 unidades arbitrarias (media ± desviación estándar [DE]).
5. Centrifugar el cultivo a 5.000 x g a temperatura ambiente durante 5 min, desechar el sobrenadante y lavar el gránulo dos veces con el mismo volumen de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS; 0,136 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM KH₂PO₄, 10 mM Na₂HPO₄, pH 7,4).
6. Utilice alícuotas de 100 μL para realizar cuatro diluciones seriadas de 10 veces en PBS, extienda las diluciones en placas SDA e incube a 37 °C durante 48 h para el recuento de colonias. Como estándar, las suspensiones fúngicas se utilizan en concentraciones de aproximadamente 4,5 × 10⁷ unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL)].

3. Inducción de CO en ratones

NOTA: La siguiente metodología fue descrita previamente por Takakura et ^al.13 y reproducida por nuestro grupo^10,14, con algunas modificaciones.

1. Distribuya aleatoriamente los ratones en nueve grupos (n = 5), correspondientes al mismo número de tratamientos (Ficha Suplementaria 1).
   NOTA: La cavidad oral de los ratones debe ser negativa para el crecimiento de Candida . Esto debe comprobarse frotando la cavidad bucal con un hisopo y colocando la muestra en SDA.
2. Mantener a los animales en cajas de propileno¹⁰ (5 ratones por caja como máximo), con virutas de madera para cubrir el suelo, en un vivero a temperatura controlada a 23 ± 2 °C bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h. No es necesario proporcionar ningún enriquecimiento específico.
3. Mantenga a los ratones con dieta extruida para ratones y agua filtrada ad libitum.
4. Inyectar por vía subcutánea el fármaco inmunosupresor prednisolona (100 mg/kg de peso corporal, ver Tabla de Materiales), por primera vez el primer día a todos los miembros de los grupos C+L+ 20, C+L+40, C+L+80, C+L- 20 μM, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ y C-L- (Ficha complementaria 1).
   NOTA: Mantenga a los ratones del mismo grupo en la misma caja y vigílelos diariamente para detectar cualquier signo de estrés y pérdida de peso. Busque consejo veterinario para analgésicos o alimentos / agua alterados si se nota estrés o pérdida de peso.
5. A partir del primer día y hasta el final del experimento, suministre clorhidrato de tetraciclina en el agua potable a 0,83 mg/mL¹³.
6. Inocular lenguas de ratones en el segundo día, incluidos los grupos C+L+ 20, C+L+40, C+L+80, C+L-20, C+L-40, C+L-80, C-L+ y C-L- (Archivo suplementario 1), con el inóculo de C. albicans . No inocule a los ratones del grupo de control negativo (NCtrl).
   1. Sedar a los animales mediante inyección intramuscular de cloruro de clorpromazina (ver Tabla de materiales) en cada músculo del muslo antes de llevar a cabo la inoculación.
   2. Realizar la inoculación intraoral de los ratones sumergiendo un hisopo estéril (uno por animal) en una suspensión estandarizada de C. albicans recién preparada (es decir, preparada inmediatamente antes de la inoculación).
   3. Coloque a los ratones sedados en posición supina. Saca suavemente la lengua de la boca con una pinza estéril. Frote la lengua de cada ratón con un hisopo empapado durante 30 segundos. Vigile a los ratones hasta que se recuperen de la sedación.
7. Al quinto día, administrar una inyección subcutánea complementaria de prednisolona (100 mg/kg de peso corporal) para mantener la inmunosupresión.
   NOTA: Este protocolo es adecuado para mantener la infección durante 7 días después de la inoculación intraoral. La escala de tiempo del protocolo se muestra en la Figura 2.

4. Terapia fotodinámica antimicrobiana y recuperación de C. albicans de lesiones orales

1. En el séptimo día, antes del tratamiento, anestesiar a los animales mediante una inyección intraperitoneal de clorhidrato de ketamina (100 mg/kg de peso corporal) combinada con xilacina (10 mg/kg de peso corporal) (ver Tabla de Materiales).
2. Coloque a cada animal en posición supina sobre un dispositivo de almohadilla^14,15 equipado con alambres de acero inoxidable que se pueden enrollar alrededor de los incisivos para mantener la boca abierta.
   NOTA: Se recomiendan almohadillas isotérmicas para calentar a los ratones mientras están sedados, previniendo la hipotermia a temperatura ambiente y evitando la mortalidad relacionada con la anestesia¹⁵. Cada animal anestesiado debe ser monitoreado por la falta de un reflejo de retirada cuando se pellizcan los dedos de los pies para confirmar la profundidad de la anestesia. Se puede administrar una dosis de mantenimiento de ketamina a 1/3 de la dosis original (sin xilacina) si es necesario.
3. Con la mandíbula y las mejillas retraídas, coloque suavemente la lengua fuera de la boca.
4. Para ratones de los grupos C+L+, pipetear 70 μL de PS en el dorso de la lengua (a una de las concentraciones probadas). Mantenga a los ratones en un ambiente oscuro durante un período de 20 minutos como período previo a la irradiación. Asegúrese de que durante este tiempo, la lengua de cada animal permanezca posicionada dentro de la cavidad bucal para evitar que el fotosensibilizador (PS) sea ingerido.
5. Después del período de fotosensibilización, saque la lengua de la boca para iluminarla. Coloque el dispositivo LED en el dorso de la lengua e ilumine a 37,5 J/^cm2 (7 min con el dispositivo actual) (Figura 3).
6. Para los animales de los grupos C+L-, pipetear 70 μL de PS a una de las concentraciones probadas en el dorso de la lengua, y mantener a estos ratones en la oscuridad durante 27 min.
7. Para los animales del grupo C-L+ (tratados con luz sin fotosensibilización previa), pipetear 70 μL de suero fisiológico estéril en el dorso de la lengua. Mantenga a los ratones en la oscuridad durante 20 minutos y luego ilumine sus lenguas a 37,5 J/^cm2 (7 min con el dispositivo actual).
8. Para ratones del grupo C-L- (no tratados con PS ni con luz), pipetear 70 μL de solución salina estéril en el dorso de la lengua y mantenerlos en la oscuridad durante 27 min.
9. Recuperar C . albicans de las lenguas de todos los ratones inmediatamente después del tratamiento. Frote el dorso de la lengua durante 1 minuto con un hisopo de algodón estéril.
10. Coloque cada hisopo de muestra en un tubo que contenga 1 ml de solución salina estéril y vórtice durante 1 minuto para resuspender las células microbianas.
11. Realice inmediatamente diluciones seriadas de 10 veces en PBS y alícuotas de placa de 25 μL sobre placas SDA por duplicado. Incubar las placas aeróbicamente a 37 °C durante 48 h.
12. Después de 48 h, use un contador de colonias digital (consulte la Tabla de materiales) para determinar los recuentos de colonias de levaduras. Calcule la carga de C. albicans (UFC/mL) para cada animal.
13. Transforme los valores de UFC/ml en log₁₀ y analice adecuadamente de acuerdo con el diseño del experimento y los supuestos de datos.
    NOTA: En la presente investigación se utilizó el ANOVA de una vía de Welch y la prueba post-hoc de Games-Howell (α = 0,05)¹⁶ .

5. Análisis histopatológicos

1. En el octavo día, anestesiar a los ratones con ketamina a 100 mg/kg combinada con xilacina a 10 mg/kg mediante inyección intraperitonial y sacrificarlos con una sobredosis de ketamina (200 mg/kg administrada por vía intraperiotonial). Confirme la muerte comprobando la ausencia de movimientos respiratorios (apnea) y la ausencia de latidos cardíacos (asistolia).
2. Pellizca con cuidado la lengua y sácala de la boca del animal. Con un bisturí manual, realice una incisión antes de las papilas circunvaladas para extirpar quirúrgicamente toda la lengua sin causar lesiones en las regiones anterior y central.
3. Fijar la lengua en formol tamponado al 10% (pH 7,2-7,4) durante 24 h y lavarla con agua corriente durante 2 h.
4. Proceder a la inclusión en el proceso de parafina: deshidratación, clarificación e impregnación^10,14.
5. Corte secciones seriadas (5 μm de grosor) con un micrótomo y, a continuación, fije las secciones en portaobjetos de vidrio. Se procede a teñir estas secciones utilizando ácido peryódico-Schiff y hematoxilina (PAS-H) para el examen histopatológico y la identificación de hongos mediante la observación bajo un microscopio óptico.
6. Pida a un patólogo, preferiblemente ciego a los grupos estudiados, que examine la reacción tisular debida a la infección por C. albicans .
7. Describir las características histológicas del tejido (epitelio y tejido conectivo), especialmente las respuestas inflamatorias locales de intensidades variables.

El modelo murino de OC mostró manchas blancas típicas y pseudomembranas en la lengua de todos los ratones infectados (Figura 4A). C. albicans recuperada de animales C-L- confirmó la colonización tisular por este microorganismo (los valores variaron de 1,62 x 104 a 4,80 x 105 UFC/mL). Como era de esperar, los animales del grupo NCtr no mostraron ninguna alteración tisular ni crecimiento de colonias después del muestreo (Figura 4B).

La aPDT disminuyó la viabilidad de C. albicans cuando se utilizaron curcuminoides a 80 μM para la fotosensibilización (Figura 5). La reducción media logarítmicade 10 alcanzada con 80 μM de aPDT mediada por PS fue de 2,47, en comparación con la del grupo C-L- (p = 0,008).

El número de colonias de C. albicans recuperadas de las lenguas de los ratones no fue significativamente diferente entre los ratones tratados con curcuminoides sin iluminación (grupos C+L-), los ratones tratados con luz pero no fotosensibilizados previamente (grupos C-L+) y los ratones no tratados (grupo C-L-) (p ≥ 0,210).

Las características histológicas de las lenguas de los animales no infectados (NCtr) mostraron tejidos normales/sanos, incluyendo lámina propia, membrana basal y papilas filiformes intactas (Figura 6A). Por el contrario, al examinar las imágenes histopatológicas de las lenguas de los ratones del grupo C-L-, se evidenció que la levadura y los filamentos estaban presentes dentro de la capa queratinizada del epitelio, aunque no hubo infiltración de hongos. En el tejido conectivo subyacente se observó una respuesta inflamatoria leve, mediada principalmente por células mononucleares, y las papilas filiformes brillaron por su ausencia (Figura 6B). El análisis histológico de las lenguas de los ratones en los grupos C+L- y C-L+ mostró características similares. Por el contrario, las secciones de la lengua de los ratones tratados con 80 μM de aPDT mediada por curcuminoides revelaron un número reducido de células fúngicas, limitadas principalmente a la capa queratinizada del epitelio (Figura 6C).

Figura 1: Estructura química del fotosensibilizador. La estructura química de la mezcla de sales solubles en agua utilizada como fotosensibilizador, que comprende un 53,4% de curcumina natural y un 46,6% de otros curcuminoides (demetoxicurcumina y bis-demetoxicurcumina). El peso molecular medio final es de 730,32 g/mol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Cronograma del protocolo para el modelo murino de candidiasis oral y TFDa. Un cronograma que describe el protocolo para el modelo murino de candidiasis oral y terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Iluminación de lenguas de ratones después de la fotosensibilización. Después de la fotosensibilización (incubación del tejido infectado con el fotosensibilizador), las lenguas se iluminaron a 37,5 J/cm2 utilizando una luz LED azul (~455 nm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Lesiones blancas en el modelo murino de candidiasis oral. (A) Imágenes representativas de las lesiones blancas observadas en el modelo murino de candidiasis oral. (B) Control negativo (no infectado). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Candida albicans recuperada de las lenguas de ratones. Los datos representan los valores medios ± la desviación estándar de log10 (UFC/ml) de los grupos de tratamiento. El ANOVA de una vía de Welch indicó que los efectos de los tratamientos fueron estadísticamente significativos diferentes entre los grupos (p < 0,001). Diferentes letras minúsculas (a, b, c) junto a las medias indican diferencias estadísticamente significativas según la prueba de Games-Howell (p≤ 0,030). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Imágenes representativas de cortes histológicos de lenguas de ratón. Las secciones histológicas de las lenguas de ratón se tiñeron con PAS-H y las imágenes se capturaron a 200x. (A) Ratones de control negativo sin candidiasis oral inducida, fotosensibilización e iluminación (grupo NCtr). (B) Ratones con candidiasis oral inducida, ni fotosensibilizados ni expuestos a iluminación LED (grupo C-L-). (C) Animales con candidiasis oral inducida, expuestos a 80 μM de curcuminoides y 37,5 J/cm2 de iluminación LED (grupo C+L+80). Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Ficha complementaria 1: Grupos experimentales. Listado de los grupos experimentales utilizados en el presente estudio. Haga clic aquí para descargar este archivo.

C. albicans has been associated with oral and esophageal infections in individuals with an immunocompromised state, diabetes mellitus, prolonged use of antibiotics, and poor oral hygiene^1,3. The study of human infectious diseases requires both in vitro and in vivo investigations before clinical trials can be safely and accurately designed. The present study describes a method for establishing a murine model of OC, which can be used to evaluate the pathogenesis of oral infections by C. albicans and the efficacy of antifungal approaches^{15,16,17,18,19}.

The murine model of OC employed here was successfully established, as evidenced by the substantial fungal load recovery from lesions as well as by the characteristic infection features observed in the macroscopic and histopathological analyses of the tongues of infected mice. Many studies have used similar murine models of OC. In such models, female mice are immunosuppressed and inoculated with C. albicans, resulting in lesions on the tongue^{10,13,14,15,20,21}. Immunosuppression with prednisolone, a glucocorticoid, inhibits the activity of neutrophils against C. albicans²². In this study, female mice were immunosuppressed with two subcutaneous injections of prednisolone, one day prior to and three days after infection with C. albicans¹³. In addition, the administration of tetracycline in drinking water during the course of the experiment caused oral dysbiosis by disturbing oral bacteria and helping C. albicans to thrive^23,24. Furthermore, the sedation caused by the intramuscular injection of chlorpromazine chloride prevented the animals from drinking water and eating immediately after inoculation. Thus, fungal cells stayed in contact with the dorsum of the tongue for a longer time, enabling the development of germ tubes and the transition from yeasts to filaments (hyphae and pseudohyphae), which are the pathogenic morphologies of C. albicans that can invade the human epithelium. Teichert et al.²⁵ used an immunodeficiency protocol to induce OC in mice and recovered only 2 x 10² CFU/mL of C. albicans.

While Totti et al.²⁶ utilized sialoadenectomized mice and conducted four separate inoculations with a C. albicans suspension, it's noteworthy that, in their case, the infection was not sustained in most animals over the course of the experiment. In contrast, in the present study, the inoculation with fungal cells was carried out only once, and it resulted in the recovery of 10⁴ CFU/mL of C. albicans from the oral cavity. This study employed the murine model of candidiasis described by Takakura et al.¹³, who performed oral inoculation with a clinical strain isolated from a patient with cutaneous candidiasis (10⁶ CFU/mL). Three to seven days post-inoculation, 10⁵-10⁶ CFU/mL of C. albicans were recovered from the oral cavity of mice¹³. The differences between the method of Takakura et al.¹³ and this study include the use of different fungal concentrations in the inoculum (this study used 10⁷ CFU/mL of C. albicans) and different C. albicans strains for oral inoculation (the reference strain ATCC 90028 was used here). Carmello et al.²⁰ employed a similar protocol, which involved using immunosuppressed animals. However, they administered two additional subcutaneous injections of prednisolone to the animals on days 1, 5, 9, and 13 of the experiment. Their study revealed a positive correlation between the scores assigned to the oral lesions of the infected animals and the number of CFU/mL over a period ranging from 5 to 16 days post-infection. It has been well-established in previous research that it is crucial to closely monitor animals under anesthesia to prevent hypothermia. Additional maintenance doses of ketamine should be administered with discretion, only when necessary²⁷.

Regarding the efficacy of aPDT application, the results showed that the irradiation of tongues previously treated with an 80 µM curcuminoid salt mixture caused a significant reduction (2.47 log₁₀) in the viability of C. albicans. Histological analyses revealed that sections from tongues treated with 80 µM curcuminoid-mediated aPDT showed a reduced number of fungal cells, which were limited to the keratinized layer, and a low inflammatory response. It is worth emphasizing that an inflammatory response was detected in all mice that were infected with C. albicans. This observation implies that the inflammation observed in all the aPDT groups might be linked to Candida infection rather than being attributed to aPDT, a consistent finding in line with our prior investigations^10,13,14,15.

Previous investigations used CUR, methylene blue, and photodithazine (PDZ) as PSs and obtained promising results^{10,20,24,25,27}. In a similar study¹⁰, a combined exposure to CUR and LED light caused a significant reduction in the viability of C. albicans; however, the use of 80 µM CUR and light reduced fungal viability by 4.0 log₁₀. Dovigo et al.¹⁰ used only CUR as PS, whereas we used a salt containing the three main curcuminoids from C. longa. When CUR (260 µM) and LED light were used for five consecutive days in the treatment of oral candidiasis in mice, the authors observed a reduction of 1.11 log₁₀ in fungal viability²¹. When methylene blue was used as PS at 450 µg/mL and 500 µg/mL, aPDT totally eradicated C. albicans from the oral cavity of mice²⁵. Moreover, when aPDT was mediated by PDZ (100 mg/L), a 3.0 log₁₀ reduction and complete remission of oral lesions were observed²⁰. In addition, aPDT increased TNF-α expression in comparison with that in the untreated group²⁰. In a study where a fluconazole-resistant strain was used, aPDT mediated by PDZ (200 mg/L) promoted a reduction equivalent to 1.3 log₁₀²⁷. Moreover, the combination of aPDT with nystatin resulted in a substantial reduction in fungal viability, amounting to a decrease of 2.6 log₁₀, along with notable improvements in oral lesions and a reduction in the inflammatory response²⁷. Collectively, these studies provide compelling evidence for the effectiveness of aPDT in reducing fungal burden within the murine model of oral candidiasis, underscoring its potential as a clinical treatment option due to its antimicrobial efficacy without causing harm to host tissues.

In conclusion, the murine model of OC used in this study is appropriate for mimicking infection and evaluating aPDT efficacy. As a limitation, the OC model used here employed only one reference strain of C. albicans (other strains, clinical isolates, and non-albicans Candida species were not evaluated). In addition, the corticosteroid-induced immunosuppression used in mice to develop oral infection may not mimic other immunodeficiency states, such as that due to HIV infection. There may also be differences in the host conditions for developing OC, such as the oral microbiota of mice and humans. This protocol should be expanded further to evaluate mixed biofilms formed by more than one species or by different strains from the same species. Furthermore, keeping mice adequately sedated and preventing hypothermia while avoiding anesthesia-related mortality are the most difficult steps of the protocol.