Optimización del modelo de ratón de periodontitis inducida por ligaduras para investigación preclínica

Resumen

El modelo murino de periodontitis inducida por ligaduras es una herramienta eficaz y cada vez más popular para estudiar la enfermedad periodontal. Se presenta una guía detallada para implementar una versión simplificada del modelo centrada en la destrucción del hueso alveolar interproximal, incluyendo el diseño de estudios en laboratorio, la producción de herramientas impresas en 3D y la cuantificación ósea mediante análisis μCT.

Resumen

El modelo experimental de periodontitis inducida por ligaduras en ratones ha desempeñado un papel fundamental en la comprensión de la patogénesis de la enfermedad periodontal; Sin embargo, no se ha aprovechado plenamente para aplicaciones traslacionales y terapéuticas. De forma similar a las enfermedades humanas, la periodontitis inducida por ligaduras en ratones se desarrolla a través de una serie de eventos microbianos, inflamatorios y osteoinmunológicos distintos. La destrucción del hueso alveolar inducida por la ligadura progresa en un periodo razonablemente corto y es fácilmente cuantificable, lo que la convierte en un modelo de enfermedad rentable para estudios preclínicos.

Para superar el desafío técnico del modelo clásico de ligadura, se curó el establecimiento del modelo simplificado de periodontitis inducida por ligadura. En lugar de inducir la enfermedad en toda la circunferencia de dos dientes adyacentes, el modelo simplificado de la enfermedad se centra únicamente en la destrucción inflamatoria ósea en la región interproximal de dos dientes posteriores, que es también la región que inicia la enfermedad periodontal común en humanos. Debido a que emplea herramientas impresas tridimensionales (3D) para la colocación de ligaduras, el enfoque es rápido y eficaz, lo que conduce a un tiempo procedimental de 5-10 minutos por ratón. Aunque la señalización osteoclastogénica se detecta tras 3 días de colocación de la ligadura, la destrucción ósea se desarrolla de forma constante a los 9 días posteriores a la ligadura.

Aquí, el protocolo simplificado del modelo de ligaduras se desarrolla destacando elementos importantes específicos del diseño del estudio (es decir, cálculo de potencia, estandarización de procedimientos, calibración), desarrollo de herramientas impresas en 3D (es decir, la "cama dental para ratón" y el "soporte de ligaduras") y la cuantificación del hueso alveolar mediante análisis μCT. La expresión génica gingival de Rank, Rankl y Opg, una tríada reguladora maestra de la osteoclastogénesis, se utiliza como evidencia indirecta de la eficacia terapéutica. Los métodos presentados en este artículo guiarán a los investigadores en la implementación del modelo simplificado de periodontitis inducida por ligaduras para probar terapias periodontales innovadoras en el entorno preclínico.

Introducción

La enfermedad periodontal es un proceso inflamatorio complejo que conduce a la destrucción de estructuras que soportan los dientes, incluyendo la encía, el ligamento periodontal, el cemento y el hueso alveolar. Para que se desarrolle la pérdida ósea periodontal, es necesario producirse la ruptura de la barrera gingival e invasión bacteriana, además del reclutamiento de células inflamatorias y la transición de una respuesta inmunitaria dominada por innatos a una dominada por^adquirida. El desequilibrio final entre osteoblastos y osteoclastos resultará en pérdida ósea alveolar por su^{destrucción 2}. El hallazgo fenotípico característico que diferencia el diagnóstico de enfermedad periodontal de la inflamación gingival reversible (gingivitis) es la pérdida del hueso alveolar. Por lo tanto, la cantidad de hueso alveolar que sostiene el diente es un resultado terapéutico clave en el entorno preclínico.

Ningún modelo animal único puede replicar todos los aspectos biológicos necesarios para el desarrollo de diferentes terapias ^3,4,5. El modelo de periodontitis inducida por ligaduras en ratón desarrolla una destrucción ósea cuantificable en un tiempo razonablemente corto (3-9 días⁾⁵, lo que lo convierte en un modelo rentable para probar intervenciones terapéuticas novedosas para la prevención y modulación de la periodontitis. A pesar de su éxito en apoyar el desarrollo de ensayos clínicos humanos de fase^II-III 6,7,8,9,10, la periodontitis inducida por ligaduras en ratones no se utiliza habitualmente como modelo preclínico. Para superar los desafíos técnicos del modelo clásico en el que la ligadura rodea el diente, se estableció el modelo simplificado de periodontitis inducida por^{ligadura 11,12}. La sencilla modificación del modelo clásico se centra en un sitio de destrucción ósea enfocado, entre los dientes en lugar de alrededor de los dientes. Los beneficios de esta modificación son múltiples, incluyendo un periodo de tiempo más corto requerido para 1) la formación del personal, 2) la facilidad técnica del procedimiento experimental y 3) la reproducibilidad de la cuantificación ósea. Además, se descubrió que varios eventos microbiológicos e inmunológicos que se desarrollan e aparecen bajo este modelo simplificado están alineados con la comprensión actual de la enfermedad periodontal humana^común 2,11,12,13. Por último, la eficaz prevención de la pérdida ósea inducida por fármacos previamente reportada por nosotros ^2,14 apoya aún más el uso del modelo simplificado de periodontitis inducida por ligaduras como herramienta in vivo para evaluar aspectos clave de terapias periodontales novedosas.

Un aspecto innovador del modelo simplificado de periodontitis inducida por ligaduras ha sido el desarrollo de herramientas impresas en 3D para facilitar más fácilmente el proceso de inducción de la^{enfermedad 11,12}. Aunque para algunos resulta intuitivo, los investigadores han informado de una incapacidad para ensamblar las herramientas impresas^{en 3D 15}, lo que podría dificultar o retrasar aún más el inicio del estudio en animales. El presente estudio amplía la información presentada en nuestro anterior estudio de protocolo¹¹y proporciona información detallada para permitir la implementación exitosa del modelo simplificado de periodontitis inducida por ligaduras en un entorno de laboratorio. Los detalles incluidos en este protocolo actual forman parte de una compleja serie de factores que pueden contribuir a la falta de reproducibilidad de los resultados de los hallazgos^científicos 15,16,17. El uso constante del modelo y la reabsorción ósea fiable identificados en los múltiples estudios ^{2,11,12,14,18} y por grupos de investigación ^{colaborativos 13,19,20,21} durante los últimos 10 años respaldan la importancia de difundir información detallada para promover la reproducibilidad en la comunidad científica.

Protocolo

Este protocolo se ajustaba a las directrices de Investigación Animal: Reporte de Experimentos In Vivo (ARRIVE^{) 22,23}. Todos los procedimientos experimentales descritos en este protocolo fueron aprobados por la IACUC de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill.

1. Diseño experimental

1. Cálculo del tamaño de la muestra
   NOTA: Debido a la naturaleza traslacional del programa de investigación, el cálculo de potencia presentado aquí se basa en mediciones de huesos alveolares de ratones salvajes tipo C57Bl6 de 8-12 semanas de edad.
   1. Analizar el hueso basándose en las mediciones lineales entre la unión cemento-esmalte y la cresta ósea alveolar (CEJ-ABC).
      1. Los ratones sanos tienen un nivel medio de inserción (o medición CEJ-ABC) de 0,2 mm, mientras que los ratones con periodontitis en el momento de 9 días tras la ligadura tienen el doble de esa cantidad (distancia CEJ-ABC de 0,4 mm)¹¹. La pérdida ósea alveolar no aumenta significativamente entre 9 y 18 días después de la colocación de la^{ligadura 11}.
      2. Realiza un análisis de cálculo de potencia basado en este tamaño de efecto para identificar el número de ratones necesarios para revelar estas diferencias entre salud y enfermedad (aquí, un total de 8-10 ratones [Figura 1A]).
         NOTA: La potencia se calculó para alcanzar una potencia entre 0,8 y 0,95, α = 0,05, usando una potencia media de dos muestras. Las medias de grupo y las desviaciones estándar se presentan en la Figura 1B.
   2. Para determinar un efecto terapéutico en la pérdida ósea, realiza un cálculo de potencia diferente. En lugar de comparar ratones sanos con ratones enfermos, ya que tanto los grupos experimentales como los de control desarrollan periodontitis en este protocolo, se reserva entre 19 y 31 ratones/grupo para asegurar la reproducibilidad de los resultados al probar la modulación de la pérdida ósea utilizando el modelo simplificado de periodontitis inducida por ligaduras (véase resultados representativos y la Figura 1C).
      NOTA: La potencia se calculó usando la misma prueba descrita anteriormente. Las medias de grupo y las desviaciones estándar se presentan en la Figura 1D.
2. Estandarización de procedimientos y calibración de personal
   1. Entrenar y calibrar a todo el personal implicado en la inducción y cuantificación de la enfermedad antes del inicio del estudio (intercalibración e intracalibración; r² ≥ 0,90).
      NOTA: Se estima que el entrenamiento para la colocación de ligaduras y la cuantificación de la pérdida ósea requiere un periodo de 2-3 meses (cronología presentada en la Tabla 1). Otros pasos necesarios se presentan como una línea temporal en la Tabla 1.
   2. Para el procedimiento de colocación de ligaduras, cuenta con dos investigadores entrenados trabajando juntos en la sala de procedimientos. El investigador principal (intra e intercalibrado) permanece como el operador que coloca las ligaduras.
   3. Haz que el segundo investigador trabaje como asistente de procedimientos y realice los pasos que se indican a continuación:
      1. Registrar el peso del ratón.
      2. Coloca el ratón en la caja anestésica.
      3. Coloca pomada para los ojos en el ratón antes de entregarlo al operador para que lo coloque en la "cama dental del ratón".
      4. Asegúrate de que ≥3 "portaligaduras" estén correctamente cargados con las ligaduras y listos para usar.
         NOTA: Para mejorar la eficiencia, lo ideal es tener ≥3 "portaligaduras" cargados adecuadamente para su uso por parte del operador. Se recomienda la rapidez (es decir, un tiempo de procedimiento de 5-10 minutos por ratón), aumentando el número de experimentos realizados en un día y disminuyendo los posibles efectos en lotes.
      5. Realiza monitorización del ratón (antes y después del procedimiento).
         NOTA: La periodontitis inducida por ligaduras es un procedimiento no invasivo y no quirúrgico que es similar al uso del hilo dental de un diente humano. Se espera que la colocación de las ligaduras cause molestias muy leves a los ratones (principalmente debido a la acumulación de bacterias entre dos dientes), pero no debería requerir el uso de analgésicos. No se esperan complicaciones tras la colocación de la ligadura realizada por una persona entrenada. Todos los animales son monitorizados cada 2-3 días tras la colocación de la ligadura. Los criterios humanos (por ejemplo, falta de acicalado o alimentación, incapacidad para levantarse o caminar, dificultad respiratoria, heridas necróticas o infectadas) deben estar listados en el protocolo aprobado para animales, pero si surge alguna complicación, se debe consultar al personal veterinario sobre las acciones adecuadas.

2. Creación de herramientas impresas para inducir periodontitis de ligadura en ratones

NOTA: Para optimizar la colocación de las ligaduras, se desarrollaron herramientas impresas en 3D llamadas Cama Dental para Ratón y Soporte para Ligaduras , compuestas por varias piezas impresas en 3D individuales que se imprimen por separado y se ensamblan manualmente. Las especificaciones de planos para estos dispositivos se publicaron^{previamente en 11} y pueden ser utilizadas por investigadores experimentados para crear archivos STL individuales. Los nuevos dispositivos del presente estudio fueron creados en colaboración con el BeAM Design Center de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill. Los materiales pueden obtenerse a través de la instalación central correspondiente o imprimirse en 3D utilizando los archivos STL en el Archivo Suplementario 1.

1. Camilla dental para ratones
   1. Imprime la cama dental de ratón (Figura 2A) y el soporte de ligaduras (Figura 2B) usando calidad estándar de impresión en una impresora 3D con filamento de ácido poliláctico (PLA) de 3,0 mm. Imprime la cama dental en la orientación diseñada y las demás partes con las superficies planas uniformes orientadas hacia abajo contra la cama de impresión. Activa la opción de material de apoyo activando la opción de Colocación de Apoyo. Asegúrate de que el material de soporte toque primero la placa de construcción seleccionando la opción Tocar la placa de construcción.
      NOTA: Utiliza los cinco archivos STL del Archivo Suplementario 1 para imprimir todos los elementos necesarios, incluyendo el tubo desmontable, la ligadura (con muesca), la cama dental del ratón (con muescas), la tapa y el cierre del soporte de ligaduras. Consulte la Tabla de Materiales para las dimensiones de cada elemento (especificaciones del plano presentadas^{previamente 10}).
   2. Una vez terminada la impresión, recorta cualquier pieza de soporte impresa de los modelos usando alicates, alicates de punta fina u otro instrumento.
      NOTA: Lleva gafas de seguridad durante este procedimiento.
2. Conjunto de cama dental para ratón
   1. Para preparar la cama dental del ratón, disponga todas las partes tal como se muestra (Figura 3A) y prepare el pegamento que se va a usar (Figura 3B).
   2. Coloca unas gotas de pegamento (Figura 3C) y fija los tornillos como se muestra (Figura 3D). De nuevo, prepárate para transferir el pegamento (Figura 3E) a las zonas donde se va a aplicar. Deslicen la ranura del tubo impreso (Figura 3F) con el extremo con púas orientado hacia afuera de la cama dental de ratón (aquí es donde se fijará la manguera para administrar isoflurano).
   3. Asegura las piezas estabilizadoras de cabeza en posiciones con pegamento (Figura 3F).
   4. Limpia cualquier exceso de pegamento y mantén una ligera presión en todas las piezas insertadas para que quede bien sujeto (Figura 3F).
3. Ajustes de los portaligaduras
   1. Para reducir las molestias al bloquear/desbloquear el mecanismo, asegúrate de que todos los bordes cuadrados o afilados en la parte exterior del Soporte de Ligaduras (Figura 4A) estén ligeramente biselados en un ángulo de 45° usando un mango de hoja de bisturí 15C, nº 3 con hoja 15C.
   2. Para asegurar un ajuste ajustado del mecanismo de bloqueo al Soporte de Ligaduras, cuadra cualquier esquina interna redondeada en el Soporte de Ligaduras (Figura 4B-F) usando una hoja de bisturí 15C.
      NOTA: Esto permitirá que el candado se ajuste completamente contra el soporte de la ligadura y solo requerirá ajustes menores.
      1. Utiliza una herramienta de recorte para impresión 3D o una hoja de bisturí 15C para eliminar el "flash" que queda en los bordes superior e inferior incluso después de quitar la mayor parte del soporte, y biselar ligeramente los bordes a 45° (similar al bisel realizado en el Ligature Holder Lock en el paso 1) para asegurar un cierre ajustado correctamente.
         NOTA: No retires demasiado material, solo lo justo para que el candado se deslice sin resistencia.
   3. Si es demasiado fino, recorta la longitud de cada punta hasta alcanzar una sección transversal más gruesa [al menos 0,5 mm de grosor], asegurando que quede suficiente espacio entre las puntas para evitar que se presione el paladar al colocar ligaduras. Asegúrate de que las puntas midan al menos 3 mm después de cortar (Figura 5A, mostrada por "CUT").
   4. En las puntas del soporte de ligaduras, retira cualquier flash del "soporte" en el que se imprimió la herramienta para asegurarte de que el lateral de las puntas quede plano (Figura 5B, flecha).
   5. Quita un "corte" del lateral de cada punta en un ángulo de 45° para facilitar la carga de la ligadura y suavizar los bordes para evitar lesiones traumáticas en los tejidos blandos (Figura 5C, indicada con flechas).
   6. Asegúrate de que cada punta del soporte de ligaduras incluya una muesca en forma de "V" en la que puedan descansar las ligaduras de seda para suturas. Si esto se eliminó en el paso 2.3.6 porque la punta impresa inicial era demasiado fina, refina en la impresión o redúcelo.
      1. Si esta muesca en forma de "V" es visible, coloca el soporte de la ligadura sobre una superficie plana con ambas puntas paralelas a la mesa, coloca suavemente una hoja de bisturí 15C en la base de la muesca y mueve suavemente la hoja de un lado a otro de modo que el filo se mantenga en la base de la "V" y el lateral de la hoja toque las paredes superiores de la "V". Con la hoja en la base de la muesca, inclina con mucho cuidado la hoja hacia la superficie exterior de la punta y repite este movimiento para refinar la base de la muesca en forma de "V" en el borde exterior, lo que permitirá que el hilo de sutura se guíe más fácilmente.
         NOTA: Esta acción de balanceo crea justo el movimiento suficiente en el filamento para apartarlo y refinar la muesca sin eliminar una cantidad excesiva de material.
      2. Si esta muesca en forma de "V" no es visible, coloca el soporte de ligaduras sobre una superficie plana con ambas puntas perpendiculares a la mesa. Mientras miras hacia abajo a lo largo de ambas puntas del soporte de ligaduras, coloca una hoja de bisturí 15C en el centro de las puntas y, en un movimiento deliberado, haz un corte superficial para crear el inicio de lo que acabará siendo la muesca en forma de "V".
         NOTA: A menudo es más fácil realizar esta acción en cada punta por separado en lugar de intentar colocar la hoja en el lugar correcto en ambas puntas al mismo tiempo.
      3. Repite el paso 2.3.7.2 si es necesario, asegurándote de que el filo de la hoja del bisturí siempre esté en el mismo punto en el centro de la punta.
         NOTA: Si el filo de la hoja no vuelve a caer en el mismo punto, se harán múltiples cortes, lo que hará que las capas de filamento empiecen a separarse en esas zonas y potencialmente reducirá el rendimiento de la herramienta.
         NOTA: La profundidad de la muesca en forma de "V" debe comprobarse periódicamente usando una ligadura de sutura atada de seda para determinar si la ligadura se mantiene o si sigue deslizándose (lo que puede indicar que es necesario un mayor refinamiento). El soporte debe imprimirse con la muesca orientada hacia abajo en la base de construcción y el bloqueo del soporte de ligaduras orientado, con la abertura más ancha hacia abajo tocando la placa de construcción. De nuevo, el material de soporte puede usarse con la colocación de soporte configurada solo en Toque de Placa.
4. Soporte de ligaduras ensamblado
   NOTA: Tras realizar las modificaciones, monta el soporte de ligaduras y revisa lo siguiente:
   1. Cuando una ligadura está bloqueada, asegúrese de que el candado apriete el hilo al soporte de la ligadura (no visible en la Figura 6A como señala la flecha, pero sí en la Figura 6B) en la parte superior o inferior del candado (ambos si es posible, aunque esto puede ser difícil de conseguir).
      NOTA: Esta fricción asegurará que la ligadura no se deslice de su sitio.
   2. Al enhebrar la ligadura en las ranuras del Soporte de Ligaduras, si sigue deslizándose de las puntas, o bien profundiza las ranuras o extiéndelas más hacia el exterior de la punta para crear una "pista" en la que se colocará el hilo.
   3. Comprueba que los dos nudos estén centrados (Figura 6C) y nivelados (en línea recta en la Figura 6D) cuando se ven desde la parte frontal del Soporte de Ligaduras; Si no, entonces una ranura es más profunda que la otra.
   4. Comprueba que la ligadura esté justo dentro de las muescas y que no esté demasiado profunda; de lo contrario, existe un riesgo elevado de que la punta del soporte de la ligadura entre en contacto con los tejidos blandos y cause un traumatismo durante la colocación de la ligadura.
   5. Usando un explorador dental (Figura 6E), confirma que la ligadura rebota en su lugar sin deslizarse cuando se aplica una fuerza suave entre los nudos (esto simula la fuerza que experimentará durante la colocación de la ligadura).

3. Colocación de ligaduras

NOTA: Es posible colocar las ligaduras entre dientes murinos con o sin la adición de patógenos periodontales^{humanos 11}. Un análisis dependiente del tiempo de la composición microbiana de la ligadura (sin suplementación con especies bacterianas humanas) demostró un cambio en la comunidad microbioma (disbiosis) durante el desarrollo de la^{periodontitis 12}. Por esta razón, no se recomienda la sustitución de la ligadura, ya que puede alterar la reproducibilidad del resultado. La inclusión de especies bacterianas en combinación con la ligadura depende de la cuestión que se aborde en un estudio específico. Debido a la pérdida esperada de^{ligaduras del} 10-15%, las ligaduras se colocan bilateralmente en un solo ratón. Este enfoque minimiza la pérdida de ratones durante el experimento.

1. Después de que el ratón haya sido anestesiado con isoflurano inhalado, coloca al ratón anestesiado en la cama dental del ratón con la espalda apoyada en la cama y la nariz cerca del cono nasal.
   NOTA: Los ratones deben ser anestesiados usando isoflurano al 4% (vol/vol). El vaporizador de isoflurano y el oxígeno se filtran mediante un filtro de aire de 0,2 μm. Una vez que el ratón está completamente anestesiado y colocado en la cama dental del ratón, debe mantenerse con un flujo del 1,5-2,5% a través del cono nasal. Los ratones son monitorizados mediante movimientos involuntarios del cuerpo y la frecuencia respiratoria (~55-65 respiraciones por minuto). No se requiere administrar ningún analgésico a ratones inducidos con periodontitis por ligadura, ya que se trata de un procedimiento no invasivo y no quirúrgico similar a usar hilo dental humano. Se espera que la colocación de las ligaduras cause molestias muy leves a los ratones (principalmente debido a la acumulación de bacterias entre dos dientes), pero no debería requerir el uso de analgésicos. No se esperan complicaciones tras la colocación de la ligadura realizada por una persona entrenada.
2. Usa las gomas para estabilizar la cabeza del ratón y abre su boca.
   NOTA: La banda alrededor de los incisivos mandibulares también retrae la lengua, y la tensión es pasiva para abrir la mandíbula sin tirar. La visualización de los molares se facilita cuando la fuente de luz se dirige en ángulo para evitar que las sombras oscuran el campo de visión. La cama dental del ratón fue diseñada específicamente para el modelo simplificado de periodontitis inducida por ligadura. La distancia entre la nariz del ratón y el cono es necesaria para permitir que el ratón tenga pequeños movimientos corporales durante el procedimiento experimental. Este movimiento del ratón permite monitorizar adecuadamente la maniobra de la mano del operador mientras utiliza el soporte de la ligadura y controla la cantidad de fuerza utilizada durante la colocación de la ligadura. La colocación de las ligaduras debería tardar entre 5 y 10 minutos por ratón. Los procedimientos deben realizarse en una campana con una campana bien ventilada para realizar experimentos con animales
3. Para colocar una ligadura en el lado derecho, sujeta el Portaligaduras en la mano derecha y el explorador en la izquierda.
   NOTA: Si los nudos de la ligadura no están centrados entre las puntas, sino más bien más cerca de una punta, entonces la ligadura puede ser más adecuada para colocarse en un lado específico. Por ejemplo, si los nudos se colocan más cerca de la punta derecha del soporte de ligaduras, esta ligadura puede ser más fácil de colocar en el lado derecho.
4. Coloca suavemente la punta del explorador debajo del contacto interproximal de los primer y segundo molares en el lado palatino.
   1. Haz que la punta exploradora toque primero los dientes y luego deslice hacia abajo y descanse contra la encía para evitar traumatizar el tejido blando; Apoya el mango Explorer en una angulación horizontal una vez colocado correctamente.
   2. Anota qué extremo del explorador se usa para colocarlo en el lado derecho y cuál en el izquierdo. Asegúrese de que la punta del explorador se enganche hacia arriba en el área de contacto proximal mientras permite que la curva del vástago se coloque sobre el lado contralateral para estabilizar la cabeza frente a fuerzas reactivas durante la colocación.
5. Utilizando el soporte de ligaduras en angulación horizontal, retrae la mejilla colocando primero el soporte por encima del contacto interproximal entre el segundo y tercer molar, empujando el borde del soporte contra la mejilla para moverlo, y luego colocando el soporte de ligaduras en el contacto interproximal de los primer y segundo molares.
   NOTA: Este paso ayuda a asegurar que ninguna mucosa bucal quede atrapada entre la ligadura y los dientes, lo que podría interferir con la colocación.
6. Una vez que la ligadura esté posicionada sobre el contacto interproximal entre el primer y el segundo molar, gira el mango del soporte de la ligadura hasta 45° y, con una combinación de suave balanceo y deslizamiento, empuja la ligadura a través del contacto.
7. Cortar el hilo sobrante:
   1. Usa una pinza fina para sujetar el hilo sobrante unido al nudo por el lado derecho, tira del hilo por los dientes hacia la izquierda y, usando unas tijeras ligeramente abiertas, desliza las tijeras por el hilo hasta que estén a ~1,5 mm del nudo antes de cortar.
      NOTA: Esto ayuda a reducir la probabilidad de trauma mucoso involuntario al eliminar el exceso.
   2. Repite lo anterior con las direcciones invertidas para el otro nudo.
8. Imita los pasos anteriores de la 3.3. hasta 3.7.2. al colocar una ligadura en el lado opuesto de la boca.
   NOTA: Se recomienda la recolección de ligaduras en sacrificio, ya que el desplazamiento disbiótico puede verse alterado por la prueba de diferentes condiciones^{experimentales 12}. Para facilitar la recogida, los ratones se colocan en la cama dental murina y se corta uno de los nudos de la ligadura, seguido de una suave extracción interproximal con pinzas. El uso de la cama dental para ratón durante la recogida de la ligadura permite una estabilidad adecuada del ratón y un acceso fácil al sitio de la ligadura.

4. Cuantificación de destrucción ósea

1. Análisis μCT
   1. Abre el software y haz clic en Archivo | Importar imagen...
   2. Haz clic en Explorar en el menú emergente, ve a la carpeta que contiene los archivos Dicom para un escaneo y selecciona el primer archivo.
   3. Haz clic en Examinar para encontrar y seleccionar cualquier otro archivo dentro de la carpeta que forme parte de la misma muestra escaneada. Haz clic en OK.
   4. Cuando la imagen empiece a cargarse, haz clic en Visualizar e Isosuperficie.
   5. Cambia el umbral de imagen a 5.000 y el Factor de Calidad de Superficie (%) a 55.
   6. Marca las casillas marcadas como Habilitar suavizado de imagen y Recortar la superficie con el ROI actual y haz clic en Actualizar.
   7. Ajusta las propiedades del nivel haciendo clic derecho en Ventana/Nivel en la parte inferior (Figura 7A) y haz clic en Editar ventana/Propiedades del nivel. Selecciona un valor de densidad ósea que sea estándar para todas las muestras. Para seguir este protocolo, usa 2.000 pero cámbialo según la densidad ósea de las muestras y mantenlo constante en todas las mediciones.
   8. Para manipular planos:
      1. Usa atajos de teclado I/J/K, ocultar/mostrar para los tres planos diferentes.
      2. Haz clic derecho y mueve el cursor para hacer zoom y hacer zoom.
      3. Pulsa Mayús y luego haz clic izquierdo para panear.
      4. Haz clic en Cortar para mover y rotar los planos.
      5. Haz clic en el centro del plano para moverlo hacia adelante/atrás o coloca el cursor en el centro del plano deseado y usa las flechas arriba y abajo para mover el plano una sección cada vez.
      6. Haz clic en el borde del plano para girar alrededor de una línea paralela a este borde en el centro del plano.
      7. Haz clic en la esquina de un plano para girar alrededor del avión.
   9. Orienta el eje z (panel azul en la parte superior de la pantalla, la sección z) de modo que las superficies/formas de los tres dientes sean visibles al mismo tiempo (o lo más cerca posible) (Figura 7B).
   10. Desplázate por este mismo plano (panel azul en la parte superior de la pantalla-z-slice) para que las raíces de los^1º y^2º molares sean visibles (Figura 7C). Intenta elegir un punto lo suficientemente profundo en las raíces para que se pueda ver toda la anatomía circundante, pero también donde los canales parezcan bien definidos y en línea recta.
       NOTA: Puede que el plano necesite ser girado para orientar verticalmente los canales.
   11. Orienta el eje x (línea verde vertical en el panel de la sección Z) para que se alinee con las raíces bucales del^{primer y segundo molar} (intenta alinear a través de la parte central de cada raíz/conducto si es posible; de lo contrario, alinea a través de la raíz bucal del^{primer molar} y la raíz distobucal del^{segundo molar} ) (Figura 7D).
   12. Utiliza la orientación de la sección en x como referencia para la alineación de la sección en y (línea azul vertical en el panel de la sección en x).
       1. Alinea la sección y de modo que quede verticalmente paralela a través de la raíz del primer molar en el panel de la sección X (Figura 7E). Gira el plano para orientar la raíz verticalmente. Observa que la línea azul cruza el centro de la raíz.
          NOTA: En áreas de pérdida ósea (como se espera con este modelo), la cresta alveolar puede presentar un defecto; por lo tanto, debe estimarse la línea media de la raíz porque el hueso circundante puede no estar presente para definir idealmente el centro del alveolo.
   13. En el panel de corte en Y, mide la distancia desde la unión cementoesmalte (CEJ) hasta la cresta ósea alveolar (ABC) colocando el cursor en el punto más profundo de la ranura en la CEJ y presionando 1, y luego colocando el cursor en el punto más cercano del ABC y presionando 2 como se muestra (Figura 7F). El^{primer punto se} indica con una flecha azul y el segundo con una flecha verde.
       1. Si las flechas no aparecen hasta que ambos puntos están seleccionados, seleccionalas pasando el cursor sobre las áreas deseadas y pulsa las teclas numéricas del teclado, ya que simplemente hacer clic con el ratón no funcionará.
       2. Si el CEJ es difícil de determinar, utiliza las flechas arriba y abajo para desplazarte por las secciones adyacentes y confirmar su ubicación.
       3. Mide varios puntos del ABC si el "punto más cercano" es difícil de determinar para confirmar que hay poca o ninguna variación en la medición.
          NOTA: Para confirmar que se ha tomado la medición correcta, es necesario ver las cortes x y z que se intersectan sobre la raíz deseada y se puede confirmar visualmente la medición en la vista 3D ocultando los planos (Figura 7F).
2. Cuantificación de expresión gingival de Rankl/Opg y Rankl/Rank
   1. Recoge tejido gingival como se describió^{anteriormente 9}.
      NOTA: Los mejores resultados de extracción de ARN se obtienen utilizando muestras de tejido fresco y la purificación de ARN debe procesarse lo antes posible.
   2. Extrae ARN de tejido gingival batiendo perlas usando el kit de referencia y las perlas cerámicas. Sigue las instrucciones del kit y almacena la muestra a -80 °C hasta el análisis por qRT-PCR.

Resultados

El análisis representativo de datos de las mediciones del hueso alveolar lineal en ratones hembras y machos WT en la línea inicial (salud) y 9 días después de la ligadura se presenta en la Figura 1A. El cálculo de potencia indica que se necesitan un total de 10 ratones (4-5 ratones por grupo) para detectar diferencias entre estos grupos si el resultado principal considerado son los niveles óseos lineales medidos por μCT (Figura 1B

Discusión

El presente estudio ofrece información perspicaz y una guía detallada paso a paso sobre el protocolo simplificado de modelos de periodontitis inducida por ligaduras que se presentó^{anteriormente 10}. Los detalles incluidos en el presente artículo pueden afectar de forma significativa la reproducibilidad y están respaldados por la experiencia del grupo con este modelo específico de periodontitis inducida por^ligaduras 11,12,13,18,19,21.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Blade	Integra	4-315C	Hoja 15C
Cuentas cerámicas	VWR	10158-608	0,5 mL x 1,4 mm Cuentas cerámicas
Material de pegamento/resina	La Compañía Gorilla Glue	8401519
Soporte para ligaduras (con muesca)	Centro de Diseño BeAM de UNC en Chapel Hill	No aplicable	118,01 mm x 13 mm x 13,74 mm
Candado de soporte de ligaduras	Centro de Diseño BeAM de UNC en Chapel Hill	No aplicable	17,5 mm x 14,57 mm x 17,8 mm
Lulzbot mini v1.0 impresora 3D	Lulzbot (Fargo Aditivive Manufacturing Equipment 3D, LLC)	No aplicable	Objetos Aleph, modelo Lulzbot Mini v1.0
MicroView Software	Innovaciones en Parallax	2.5.0-3139	Software utilizado para mediciones óseas
Cama dental para ratón (con muescas)	Centro de Diseño BeAM de UNC en Chapel Hill	No aplicable	103,86 mm x 196,85 mm x 50,99 mm
Cubierta dental de ratón	Centro de Diseño BeAM de UNC en Chapel Hill	No aplicable	99,8 mm x 77 mm x 21,5 mm
Filamento de ácido poliláctico (PLA)	Palabra por palabra	55259	PLA de 3,0 mm
Kit de ARN Rapidpure	MP Biomedicina	112721050
Mango de hoja de bisturí	Bard-Parker	371030	Mango de hoja de bisturí 15C
Sutura-seda	Instrumento Quirúrgico Roboz	SUT-15-1
Cebadores qPCR Taqman	Thermo Fisher	Rango (Mm00437135_ m1), Rankl (Mm00441906_ m1), Opg (Mm00435452_ m1), Gapdh (Mm99999915_g 1)
VX-765	InvivoGen, San Diego, EE. UU.	#inh-vx765-1	Inhibidor de caspasa-1 utilizado para la modulación del huésped