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Modelo de cultivo celular 3D traslacional para evaluar los efectos de la hiperoxia en las células epiteliales de las vías respiratorias neonatales humanas

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DOI:

10.3791/65913

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12 de julio de 2024

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1Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Center for Pregnancy and Newborn Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Medicine, Section of Pulmonary, Critical Care & Sleep Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

En este artículo

Resumen

Describimos un protocolo para establecer un modelo de cultivo de interfaz aire-líquido (ALI) utilizando células epiteliales de la vía aérea traqueal neonatal (nTAEC) y realizar una exposición a la hiperoxia fisiológicamente relevante para estudiar el efecto del estrés oxidativo inducido por la atmósfera en las células derivadas del epitelio de la superficie de la vía aérea neonatal en desarrollo.

Resumen

El epitelio de las vías respiratorias neonatales prematuros está constantemente expuesto a factores estresantes ambientales. Uno de estos factores estresantes en los neonatos con enfermedad pulmonar es la tensión de oxígeno (O2) superior a la atmósfera ambiente, denominada hiperoxia (>21%O2). El efecto de la hiperoxia en las vías respiratorias depende de varios factores, incluida la etapa de desarrollo de las vías respiratorias, el grado de hiperoxia y la duración de la exposición, con exposiciones variables que pueden conducir a fenotipos únicos. Si bien se han realizado numerosas investigaciones sobre el efecto de la hiperoxia en la alveolarización pulmonar neonatal y la hiperreactividad de las vías respiratorias, se sabe poco sobre el efecto subyacente a corto y largo plazo de la hiperoxia en las células epiteliales de las vías respiratorias neonatales humanas. Una de las principales razones de esto es la escasez de un modelo in vitro eficaz para estudiar el desarrollo y la función epitelial de las vías respiratorias neonatales humanas. Aquí, describimos un método para aislar y expandir las células epiteliales de las vías respiratorias traqueales neonatales humanas (nTAEC) utilizando aspirados traqueales neonatales humanos y cultivando estas células en cultivo de interfaz aire-líquido (ALI). Demostramos que los nTAEC forman una monocapa de células polarizadas maduras en el cultivo de ALI y experimentan diferenciación mucociliar. También presentamos un método para la exposición moderada a hiperoxia de la monocapa celular en cultivo de ALI utilizando una incubadora especializada. Además, describimos un ensayo para medir el estrés oxidativo celular después de la exposición a hiperoxia en cultivo de ALI utilizando cuantificación fluorescente, que confirma que la exposición moderada a la hiperoxia induce estrés oxidativo celular pero no causa daño significativo a la membrana celular o apoptosis. Este modelo puede utilizarse potencialmente para simular la exposición a la hiperoxia clínicamente relevante encontrada por las vías respiratorias neonatales en la Unidad de Cuidados Intensivos Neonatales (UCIN) y utilizarse para estudiar los efectos a corto y largo plazo delO2 en la programación epitelial de las vías respiratorias neonatales. Los estudios que utilizan este modelo podrían utilizarse para explorar formas de mitigar la lesión oxidativa temprana en las vías respiratorias en desarrollo, que está implicada en el desarrollo de enfermedades de las vías respiratorias a largo plazo en ex bebés prematuros.

Introducción

El oxígeno terapéutico (O2) es una de las terapias más utilizadas en la unidad de cuidados intensivos neonatales (UCIN)1. En consecuencia, la exposición a la hiperoxia (>21%O2) es un factor de estrés atmosférico común que encuentran los neonatos con y sin enfermedad pulmonar significativa. Las respuestas pulmonares a la hiperoxia pueden variar dependiendo de la intensidad y/o duración de la exposición y de la localización anatómica, el tipo de célula y la etapa del desarrollo pulmonar 2,3,4,5,6. La mayor parte de la investigación en lesión pulmonar por hiperoxia neonatal se ha centrado en el efecto de la exposición a la hiperoxia en el contexto de la alveolarización postnatal en la displasia broncopulmonar modelo (DBP), la enfermedad pulmonar crónica más común que afecta a los recién nacidos prematuros 6,7,8,9,10,11. La gravedad de la displasia broncopulmonar se clasifica según la cantidad de soporte respiratorio y elO2 necesario a las 36 semanas después de la edad menstruala las 9 semanas. La mayoría de los bebés con TLP mejoran clínicamente con el tiempo a medida que los pulmones continúan creciendo, y la mayoría deja de recibir asistencia respiratoria antes de su primer cumpleaños12,13. Independientemente de la gravedad de la TLP después del nacimiento, las morbilidades significativas que afectan a los recién nacidos prematuros incluyen un riesgo 5 veces mayor de sibilancias preescolares, asma, infecciones respiratorias recurrentes durante la infancia y enfermedad pulmonar obstructiva crónica de inicio temprano 12,14,15,16,17,18,19. El efecto de la hiperoxia sobre la enfermedad de las vías respiratorias a largo plazo y las infecciones pulmonares en recién nacidos prematuros se ha investigado utilizando modelos animales in vitro e in vivo 20,21,22,23,24. Sin embargo, la mayoría de estos modelos se centraron en el papel del tejido mesenquimatoso, el epitelio alveolar y el músculo liso de la vía aérea 25,26,27,28.

El epitelio de la superficie de las vías respiratorias recubre todo el trayecto del sistema respiratorio, extendiéndose desde la tráquea hasta el bronquiolo terminal, terminando justo antes del nivel de los alvéolos29. Las células basales de la vía aérea son las células madre primarias del epitelio de la vía aérea, con la capacidad de diferenciarse en todo el repertorio de linajes epiteliales maduros de la vía aérea, que incluyen células ciliadas y secretoras (células club: no productoras de moco, y células caliciformes: productoras de moco)29,30,31,32. Los estudios de cultivos celulares en el contexto de la lesión pulmonar hiperóxica neonatal han utilizado principalmente líneas celulares de cáncer humano o de ratónadulto 33,34. Además, la mayoría de los experimentos in vitro han utilizado sistemas de cultivo sumergido, que no permiten la diferenciación de las células en un epitelio mucociliar de las vías respiratorias similar al epitelio in vivo de las vías respiratorias en humanos35. En consecuencia, existe un vacío en el conocimiento sobre los efectos de la lesión pulmonar inducida por hiperoxia en el desarrollo de células epiteliales de las vías respiratorias de neonatos humanos. Una de las razones es la escasez de modelos traslacionales para estudiar los efectos de la exposición atmosférica en el epitelio de las vías respiratorias neonatales humanas. La lesión pulmonar hiperóxica en una etapa temprana de la vida puede provocar una enfermedad de las vías respiratorias a largo plazo y un mayor riesgo de infección, lo que tiene consecuencias que alteran la vida de los recién nacidos prematuros 14,36,37. En los lactantes no supervivientes con DBP grave, el epitelio de la superficie de las vías respiratorias presenta anomalías distintivas, como hiperplasia de células caliciformes y trastornos del desarrollo ciliar, lo que denota un aclaramiento mucociliar anormal y un aumento de la altura epitelial que compromete el calibre de las vías respiratorias38. En la última década, ha aumentado el interés en el cultivo de células epiteliales primarias de la vía aérea en la interfaz aire-líquido (ALI) para estudiar el desarrollo epitelial postnatal de la vía aérea 39,40,41,42. Sin embargo, los modelos ALI de células epiteliales de las vías respiratorias neonatales no se han utilizado en el contexto de modelos de perturbación redox atmosférica, como la exposición a la hiperoxia.

Utilizando un método previamente publicado39, hemos utilizado muestras de aspirado traqueal neonatal obtenidas de neonatos intubados en la UCIN y hemos aislado y expandido con éxito células epiteliales primarias de la vía aérea traqueal neonatal (nTAEC). Hemos utilizado inhibidores de Rho, Smad, glucógeno sintasa quinasa (GSK3) y señalización de diana de rapamicina en mamíferos (mTOR) para aumentar la capacidad de expansión y retrasar la senescencia en estas células, como se ha descrito anteriormente39,42, lo que permite un paso eficiente y posterior de las nTAECs. El protocolo describe métodos para establecer cultivos 3D de ALI utilizando nTAEC y realizar la exposición a la hiperoxia en las monocapas de nTAEC. La inhibición de Rho y Smad se utiliza durante los primeros 7 días de cultivo de ALI (días 0 a 7 de ALI), después de lo cual estos inhibidores se eliminan de los medios de diferenciación durante el resto de la duración del cultivo de ALI. La superficie apical de la monocapa de células epiteliales de la vía aérea cultivada con ALI permanece expuesta al medio ambiente43, lo que permite estudios de perturbaciones atmosféricas y se asemeja mucho a la patobiología de una vía aérea neonatal en desarrollo expuesta a la hiperoxia in vivo. La concentración deO2 utilizada en estudios previos de cultivos celulares (independientemente de las células inmortalizadas o primarias) de la lesión pulmonar hiperóxica neonatal varía significativamente (oscilando entre el 40% y el 95%), al igual que la duración de la exposición (oscilando entre 15 min y 10 días)36,44,45,46,47. Para este estudio, la monocapa de células ALI se expuso al 60% deO2 durante 7 días, desde el día 7 hasta el día 14 de ALI (después de la eliminación de los inhibidores de Rho/Smad de los medios de diferenciación). La exposición a la hiperoxia se realizó durante la fase temprana-media de la diferenciación mucociliar (ALI, días 7 a 14) en comparación con el epitelio maduro completamente diferenciado y, por lo tanto, simula el epitelio de las vías respiratorias en desarrollo in vivo en los recién nacidos prematuros. Esta estrategia de exposición minimiza el riesgo de toxicidad aguda porO2 (que se espera con concentraciones más altas deO2) mientras sigue ejerciendo estrés oxidativo dentro de un rango fisiológicamente relevante y se asemeja a la ventana crítica de transición del entorno intrauterino relativamente hipóxico a un entorno externo hiperóxico en los recién nacidos humanos prematuros.

Protocolo

Las muestras de aspirado traqueal neonatal se recolectaron solo después del consentimiento informado de los padres, y el protocolo utilizado para la recolección, el transporte y el almacenamiento ha sido aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Oklahoma (IRB 14377).

1. Preparación para el aislamiento, el paso y la cultura ALI de nTAEC

  1. Preparación de los medios
    1. Medio de la vía aérea epitelial bronquial (BLEAM) con inhibidores (BLEAM-I): Prepare 500 mL (1 frasco, almacenado a 4 °C) de BLEAM agregando 1,25 mL de suplemento de HLL (500 μg/mL de albúmina sérica humana, 0,6 μM de ácido linoleico, 0,6 μg/mL de lecitina), 15 mL de L-Glutamina (6 mM), 2 mL de Extracto P (0,4%, extracto de hipófisis bovina), 5 mL de TM1 (1 μM de epinefrina, 5 μg/mL de transferrina, 10 nM de triyodotironina, 0,1 μg/mL de hidrocortisona, 5 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (EGF), 5 ng/mL de insulina), 1 mL de solución antibiótica (Normocina, 0,1 mg/mL). Para prevenir la senescencia de las células primarias y mejorar la eficiencia de la expansión, agregue los siguientes inhibidores del factor de crecimiento como se describió anteriormente39: Y-27632 (proteína quinasa asociada a Rho o inhibidor de ROCK) con una concentración final de 5 μM, A83-01 (inhibe la señalización de Smad) con una concentración final de 1 μM, CHIR 99021 (glucógeno sintasa quinasa-3 o inhibidor de GSK3) con una concentración final de 0,4 μM y Rapamicina (inhibidor de la diana molecular de la rapamicina o mTOR) con una concentración final concentración de 5 nM. Filtre el medio a través de un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm. Consulte la Tabla 1 para obtener una lista de los componentes de medios.
    2. Medio ALI de células epiteliales bronquiales/traqueales humanas (HBTEC): Prepare 500 ml de medio HBTEC descongelando el frasco a 37 °C y añadiendo 1 ml de solución antibiótica (normocina, 0,1 mg/ml). Una vez añadido, filtre el medio a través de un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm.
    3. Medios HBTEC con inhibidores (HBTEC-I): Prepare los medios HBTEC como se indicó anteriormente. Antes de filtrar, agregue los siguientes inhibidores: Y-27632 con una concentración final de 5 μM y A83-01 con una concentración final de 0,5 μM. Filtre el medio a través de un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm.
      NOTA: Guarde los soportes BLEAM-I, HBTEC y HBTEC-I a 4 °C, fechados y etiquetados, en la oscuridad (envueltos en papel de aluminio) y solo caliente las alícuotas de lo que se necesita (la vida útil es de 30 días).
    4. HEPES/FBS: Añadir 500 mL de solución salina tamponada con HEPES y 88 mL de FBS (la concentración final es del 15%). Una vez añadida, filtre la solución a través de un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm y guárdela a 4 °C, fechada y etiquetada.
      NOTA: Aliquot y caliente BLEAM, HEPES-FBS y Trypsin-EDTA a 37 °C (al menos 30 min) antes de su uso.
  2. Recubrimiento de matraces de cultivo e insertos de cultivo celular ALI con un medio acondicionado 804G
    1. Prepare los medios condicionados por la matriz de células 804G (línea celular epitelial de vejiga de rata) como se describió anteriormente39.
    2. Cubra el matraz de cultivo celular y los insertos de cultivo celular con medios acondicionados con 804G durante al menos 4 h en la incubadora a 37 °C, 5% de CO2. Consulte la Tabla 2 para conocer las cantidades de medios necesarias para recubrir diferentes matraces de cultivo e insertos de cultivo celular.

2. Aislamiento y expansión de los nTAEC y preparación para el cultivo posterior de ALI

  1. Adquiera aspirado traqueal fresco (aproximadamente 1 mL) durante la succión rutinaria del tubo endotraqueal de los neonatos intubados y recoja el aspirado en una trampa de moco. Si el volumen de aspirado es insuficiente para alcanzar el atrapón de moco, enjuague el catéter de succión con 1-3 ml de solución salina estéril.
  2. Etiquete la muestra y guárdela en una bolsa de riesgo biológico con hielo.
    NOTA: Las muestras pueden almacenarse en hielo a 4 °C durante un máximo de 24 h. Sin embargo, el rendimiento es mayor con muestras frescas.
  3. Transportar la muestra desde la UCIN hasta el laboratorio. Cubra un matraz T25 con medios acondicionados con 804G y prepárese para la inoculación de la muestra en el momento del transporte del aspirado traqueal al laboratorio.
  4. Retire la trampa de moco de la bolsa de riesgo biológico y limpie a fondo las superficies exteriores con etanol al 70% para evitar cualquier contaminación. Abra con cuidado la tapa de la trampa de moco debajo de una campana de cultivo de células estéril.
  5. Diluir la muestra de aspirado traqueal con PBS estéril a 5 mL (para diluir la mucosidad) y transferir todo el contenido a un tubo cónico de 50 mL.
  6. Centrifugar el tubo a 250 x g, 20 °C-23 °C durante 5 min, y desechar el sobrenadante (incluida la mucosidad).
    NOTA: Todas las centrifugaciones aquí se realizan a 250 x g, 20 °C-23 °C durante 5 min, a menos que se especifique lo contrario.
  7. Vuelva a suspender el pellet en 5 mL de BLEAM-I.
  8. Retire el matraz T25 de la incubadora y deseche el medio acondicionado 804G antes de sembrar la muestra.
  9. Colocar la muestra en el matraz T25 y colocarla en la incubadora a 37 °C, 5% de CO2 (esto se denominará Paso 0 o P0).
  10. Cambie el medio con BLEAM-I 24 h después del recubrimiento para lavar las células no adheridas y, posteriormente, cada 48 h.
    NOTA: Después de procesar la muestra de aspirado traqueal e incubarla en medio BLEAM-I, aparecen células de forma cúbica 7-10 días después de la siembra. Alrededor de 3 semanas después de la siembra, las células están densamente empaquetadas y requieren tripsinización para su posterior paso, expansión y almacenamiento. Las células de paso temprano (P1 - P2) se colocan en tubos criogénicos (2,5 x 106 células por 500 μL de medio de congelación por tubo criogénico) y se almacenan en nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
  11. Descongele rápidamente las células congeladas de nitrógeno líquido en un baño de agua a 37 °C y transfiera la suspensión celular a un tubo estéril de tamaño adecuado que contenga BLEAM-I.
  12. Cuente las células para determinar el número total de células vivas y células vivas utilizando una tinción de azul de tripán y un contador de células automatizado o manual como se describió anteriormente48. Diluir la suspensión celular con un volumen adecuado de BLEAM-I, de modo que la concentración final sea de 2,1 x 106 células en 15 mL de suspensión celular (para matraz T75).
    NOTA: Para un matraz T25, generalmente se usan 0.7 x 106 celdas en 5 mL de suspensión de celdas para la siembra.
  13. Transfiera la suspensión celular de 15 mL a un matraz T75 e incube durante la noche a 37 °C, 5% de CO2.
  14. A la mañana siguiente, intercambie los medios con el nuevo BLEAM-I. A continuación, cambie los medios por un nuevo BLEAM-I cada 2 días. Una vez que las células están alrededor del 80%-90%, están listas para ser tripsinizadas para el cultivo de ALI.
  15. Aplique 5 mL de tripsina-EDTA (T75) a la monocapa celular.
    NOTA: Recuerde usar tripsina fresca. Evite usar tripsina que se haya calentado varias veces.
  16. Incubar el matraz a 37 °C durante 5 min en la incubadora. Luego, golpee el costado del matraz 8x-10x para desalojar las células. Revise bajo el microscopio para confirmar que las células se han desprendido después de la tripsinización. Si el >50% de las células permanecen en el matraz, lavar con PBS 2x y repetir el paso de tripsinización con un tiempo de incubación reducido de 2-3 min.
  17. Detenga la reacción con 15 mL de HEPES-FBS y pipetee hacia arriba y hacia abajo 4x-5x. Transfiera las células a un tubo estéril de tamaño adecuado y centrifugue a 250 x g durante 5 minutos para granular las células.
  18. Después de la centrifugación, aspire cuidadosamente el sobrenadante. Disuelva el pellet celular en 1 mL de BLEAM-I pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 5x-10x.
  19. Cuente las celdas para determinar el número total de celdas y células vivas. Diluir la suspensión celular con un volumen adecuado de BLEAM-I, de modo que la concentración final sea de 1 x 105 células vivas por cada 100 μl de suspensión celular.

3. Cultura ALI de nTAECs

NOTA: Los insertos de cultivo celular deben recubrirse con medios acondicionados con 804G e incubarse durante al menos 4 h a 37 °C, 5% de CO2 antes del siguiente paso (ver paso 1.2).

  1. Retire la(s) placa(s) de cultivo celular de 24 pocillos que contienen los insertos de cultivo celular de la incubadora y deseche los medios acondicionados con 804G.
  2. Agregue 1 mL de BLEAM-I a la cámara basolateral (inferior) de cada pocillo de ALI. Añadir 100 μL de suspensión celular (1 x 105 células) a la cámara apical de los insertos de cultivo celular ALI e incubar las células a 37 °C, 5% de CO2. Esta etapa se define como ALI día -2.
  3. Al día siguiente, cambie los medios en las cámaras basolateral (1 mL) y apical (100 μL) con BLEAM-I fresco. Al cambiar el medio en la cámara apical, tenga cuidado de no alterar la monocapa celular. Esta etapa se define como ALI día -1.
  4. Al día siguiente, retire los medios de las cámaras basolateral y apical.
    NOTA: Las células de la membrana de cultivo celular tardan 2 días en confluente en condiciones sumergidas. En esta etapa, se puede establecer ALI.
  5. Agregue 1 mL de medio HBTEC-I a la cámara basolateral, pero deje el medio de la cámara apical libre y expuesto al aire. Esta etapa se define como ALI día 0.
  6. Continúe intercambiando el medio HBTEC-I (1 mL) en la cámara basolateral cada 48 h desde el día 0 hasta el día 6 de ALI. Cambie a medios HBTEC regulares (sin inhibidores) el día 7 de ALI hasta el punto de tiempo deseado de la cosecha.
    NOTA: Durante los primeros 7 días de cultivo de ALI, los medios de la cámara basolateral pueden filtrarse a la cámara apical. Este medio debe aspirarse cuidadosamente todos los días para mantener la salud de la capa celular y permitirles diferenciarse.
  7. Coseche células, inserciones de cultivo celular y medios basolaterales en diferentes puntos de tiempo para técnicas moleculares, ensayos y análisis.
    1. Para este protocolo, en los días 0, 7 y 28 de ALI, se recolectan células para el análisis de expresión génica de qPCR (protocolo estándar del fabricante) de marcadores de diferenciación epitelial. En los días 0, 7, 14 y 28 de ALI, recoja insertos de cultivo celular para probar la función de barrera (métodos descritos a continuación).
    2. En los días 0 y 28 de ALI, utilice insertos de cultivo celular fijados en formol para la tinción inmunofluorescente con marcadores de diferenciación epitelial (utilizando el protocolo publicado previamente)49. En el día 14 de ALI, recoja medios basolaterales para la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) (protocolo estándar del fabricante), lisados celulares para qPCR de marcadores de estrés oxidativo e inmunotransferencia con anticuerpos contra caspasa-3 y caspasa-3 escindida (protocolo estándar del fabricante), e insertos de cultivo celular para el ensayo de estrés oxidativo (método descrito a continuación).

4. Prueba de la función de barrera durante la diferenciación de ALI

  1. Medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER)
    NOTA: Mida el TEER utilizando un voltímetro epitelial / ohmio (EVOM) durante la diferenciación de ALI para evaluar la integridad de la capa celular50.
    1. Antes de medir los valores de resistencia del filtro de prueba, utilice un cultivo celular recubierto de medio acondicionado a 804G (desprovisto de células) para medir el valor de resistencia de fondo en ohmios (Ω)
    2. Reste el valor de resistencia de fondo de los valores de resistencia del filtro de prueba y multiplique la diferencia por el área de superficie de crecimiento de la celda para obtener el valor de TEER para cada filtro de prueba.
      TEER = (ΩT - ΩB) X C
      TEER = Resistencia eléctrica transepitelial (Ω.cm2)
      ΩT = Valor de resistencia del filtro de prueba (Ω)
      ΩB = Valor de resistencia de fondo (Ω)
      C = Área de superficie de crecimiento celular (cm2)
      NOTA: Los insertos de cultivo celular utilizados para las mediciones de TEER se fijan posteriormente con formalina tamponada al 10% y se utilizan inmediatamente para la tinción inmunofluorescente y la microscopía fluorescente (método descrito a continuación) o se almacenan a 4 °C para la tinción posterior.
  2. Ensayo de permeabilidad epitelial de isetionato de fluoresceína dextrano (FITC-dextrano)
    NOTA: El ensayo de permeabilidad epitelial se realizó utilizando dos pesos moleculares diferentes de FITC-dextrano (10 kD y 20 kD) durante la diferenciación de ALI.
    1. Prepare la solución de trabajo de FITC-dextrano (1 mg/mL): mida 5 mg de FITC y mezcle 1 mL de DMSO (5 mg/mL). Vuelva a suspender el caldo de 5 mg/mL en medios HBTEC calentados a 37 °C hasta una concentración de 1 mg/mL. Proteja la solución de la luz.
    2. Transfiera los filtros de prueba (que contienen celdas) a una nueva placa de 12 pocillos y agregue 1 ml de medio HBTEC en el compartimento basolateral.
    3. Aspire los medios del compartimento apical (si los hay) y reemplácelos con 250 μL de solución de trabajo de FITC-dextrano. Incubar a temperatura ambiente protegido de la luz durante 60 min.
    4. Finalice el ensayo de FITC-dextrano retirando los filtros de prueba (que contienen solución de trabajo de FITC-dextrano) de la placa de 12 pocillos.
    5. Recoja los medios basolaterales de la placa de 12 pocillos en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y vórtice.
    6. Transfiera 100 μL de alícuotas de cada tubo a una microplaca de poliestireno negro de fondo transparente de 96 pocillos por triplicado. Transfiera 100 μL de medios HBTEC a pocillos adicionales en la placa de 96 pocillos como control negativo para medir la fluorescencia de fondo.
    7. Mida la intensidad de la fluorescencia utilizando un espectrofotómetro con una excitación de 490 nm y máximos de emisión de 520 nm.
    8. Reste el valor promedio de fluorescencia de fondo de los valores de fluorescencia del filtro de prueba para obtener la fluorescencia corregida y exprese los valores como un porcentaje frente a los valores de fluorescencia corregidos en el día 0 de ALI para FITC 10 kD y 20 kD.

5. Exposición a la hiperoxia con la incubadora TriGas

  1. En el día 7 de ALI, determine el número de insertos de cultivo celular que se pondrán en hiperoxia en función de las necesidades experimentales y de cosecha.
  2. Ajuste el nivel de O2 en la incubadora TriGas al 60% de O2. Por lo general, se necesitan ~ 30-45 minutos para que el nivel de O2 alcance el 60%.
  3. Una vez que el nivel deO2 se estabilice en el 60%, coloque la placa de cultivo celular de 24 pocillos con los insertos de cultivo celular asignados al grupo de hiperoxia dentro de la incubadora y cierre la puerta de la incubadora.
    NOTA: Este paso debe realizarse de la manera más eficiente posible para evitar una caída significativa en el nivel deO2 dentro de la incubadora.
  4. Cambie los medios en los insertos de cultivo celular expuestos a hiperoxia siguiendo el mismo programa que los pocillos de control (21% de O2 expuestos). Revise los insertos de cultivo celular todos los días para ver si hay fugas de medios y aspire suavemente cualquier fuga en la cámara de cultivo celular.
  5. Continúe la exposición a la hiperoxia durante 7 días (días 7 a 14 de ALI). Una vez completada la exposición a la hiperoxia, recolecte células o realice ensayos utilizando insertos de cultivo celular el día 14 de ALI.

6. Ensayo de estrés oxidativo para evaluar los efectos de la hiperoxia

NOTA: Utilizamos el kit de ensayo CM-H2DCFDA y medimos la intensidad de fluorescencia en el día 14 de ALI como marcador de estrés oxidativo en insertos de cultivo celular después de la exposición aO2 . H2DCFDA es una forma químicamente reducida y acetilada de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCF) que es un indicador de células vivas de especies reactivas de oxígeno (ROS). CM-H2DCFDA es el derivado clorometilo reactivo al tiol de H2DCFDA, que promueve una mayor unión covalente a los componentes intracelulares, lo que permite una retención más prolongada del colorante dentro de la célula. Estas moléculas son no fluorescentes hasta que los grupos acetato son eliminados por la acción de las esterasas intracelulares, y se produce la oxidación en la célula51. Después de la oxidación intracelular, el aumento resultante de la fluorescencia se puede medir con un microscopio fluorescente como medida sustitutiva del estrés oxidativo celular52. El reactivo es ligero y sensible al aire, por lo que debe protegerse de la luz y mantenerse hermético en la medida de lo posible.

  1. Preparación de la solución de ensayo CM-H2DCFDA: Cada vial contiene 50 μg de colorante reactivo en forma de polvo. Para hacer una solución madre de 1 mM, agregue 80 μL de DMSO estéril al vial, mezcle bien con una pipeta y haga un vórtice suave. Para una concentración final de 1 μM del colorante en insertos de cultivo celular, agregue 0,1 μL del stock de 1 mM por 100 μL de PBS (por ejemplo, agregue 0,6 μL de solución madre a 600 μL de PBS para 6 insertos de cultivo celular).
    NOTA: La concentración final del colorante puede variar entre 1-5 μM. La dosis debe optimizarse para cada condición de cultivo.
  2. Añadir 100 μL de la solución de colorante de 1 μM en cada cultivo celular para el grupo expuesto a la hiperoxia o al grupo expuesto a la normoxia. Utilizar al menos 1 cultivo celular como control negativo de cada grupo de tratamiento (100 μL de PBS sin colorante). Incubar a 37 °C durante 30 min, protegido de la luz. Lavar 1 vez con PBS.
  3. Preparación del portaobjetos: Drene el exceso de PBS. Sostenga con cuidado los insertos de cultivo celular y use una cuchilla para cortar lentamente la membrana del cultivo celular. Vierta 1-2 gotas de líquido de montaje en el portaobjetos. Con pinzas de punta plana, sujete con cuidado la esquina de la membrana, colóquela con el lado de la celda hacia abajo sobre el montador y cúbrala con un cubreobjetos. Retire el exceso de líquido de montaje y deje secar al aire durante 15 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz. Las diapositivas ya están listas para ser fotografiadas.
    NOTA: La preparación del portaobjetos y la microscopía fluorescente debe realizarse lo más rápido posible, ya que la intensidad fluorescente se desvanece significativamente en 2-3 h.
  4. Microscopía fluorescente: Captura de imágenes utilizando un microscopio fluorescente utilizando el canal Cy2 (cianina-2). Capture imágenes de tres áreas separadas que no se superponen por cultivo celular.
  5. Detección fluorescente de estrés oxidativo
    NOTA: Utilice las imágenes de la microscopía fluorescente para medir la fluorescencia total de células corregida (CTCF) utilizando el software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) y el flujo de trabajo que se describe a continuación. CTCF sirve como marcador del estrés oxidativo en los insertos de cultivo celular después de la exposición a la hiperoxia y se mide eliminando la fluorescencia de fondo con la ayuda del software ImageJ.
    1. Abra la imagen de microscopía en ImageJ y seleccione el área de interés con la herramienta de rectángulo. Guarde el área de selección (α) haciendo clic con el botón derecho y seleccione Agregar al administrador de ROI (región de interés). Utilice esta área de selección en todas las imágenes.
    2. Seleccione los parámetros para la medición en Analizar > Establecer mediciones y seleccione Área, Densidad integrada y Valor medio de gris dentro de la pestaña de configuración.
    3. Para cada imagen, utilice la misma área de selección del administrador de ROI y seleccione Analizar > medir. El valor de densidad integrado representa la fluorescencia total (Ft) del área seleccionada. Anote los valores de medición en la ventana emergente.
    4. Para corregir la fluorescencia de fondo (Fb) en cada imagen, seleccione una pequeña área de región no fluorescente con la herramienta rectángulo. Seleccione Analizar > medir para esta región. El valor medio de la intensidad representa Fb. Anote los valores de medición en la ventana emergente.
    5. Calcule el CTCF multiplicando la intensidad de fluorescencia media de las lecturas de fondo por el área total del ROI y restando este número del valor de densidad integrado del ROI. Repita este flujo de trabajo para todas las imágenes de ambos grupos de tratamiento (control e hiperoxia).
      CTCF = Ft - (Fb x α)
      CTCF = Fluorescencia de célula total corregida (U.A.)
      Ft = Fluorescencia total
      Fb = Fluorescencia de fondo
      α = Área de selección

Resultados

Para aislar los nTAEC, recolectamos aspirados traqueales de neonatos intubados en la UCIN y transportamos los aspirados en hielo al laboratorio para su posterior procesamiento (Figura 1A). Después de sembrar las muestras de aspirado traqueal en un medio de crecimiento epitelial de las vías respiratorias (BLEAM-I que contiene inhibidores de Rho/Smad, GSK3 y mTOR), aparecieron células cuboidales en un plazo de 7 a 10 días. A los 14 días, las células tenían una confluente del 50%-60%, y alrededor de 21 días después de la siembra, las células estaban densamente empaquetadas y requerían tripsinización para el posterior paso y expansión. Los pasajes en serie de estas células (hasta P3) se criopreservaron en nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. A continuación, las células (≤ pasaje 3) se descongelaron para el cultivo de ALI.

Los nTAEC se cultivaron en ALI una vez que alcanzaron alrededor del 80%-90% de confluencia en una placa T75 en condiciones sumergidas. Realizamos tinción por inmunofluorescencia de la monocapa de nTAEC en el día 0 de ALI con los marcadores específicos de células basales: citoqueratina-5 (KRT5)53 y proteína tumoral p63 (TP63)54 (Figura 1B). En el día 0 de ALI, casi todas las células son KRT5 y TP63 positivas, lo que sugiere un fenotipo de células basales de las vías respiratorias con una diferenciación mínima. Después de que se estableció el ALI, el TEER se midió utilizando EVOM (Figura 1C) y aumentó rápidamente en la fase temprana del cultivo de ALI (día 0 a 7 de ALI) a medida que los nTAEC comenzaron a formar una monocapa de células polarizadas maduras, con un posterior estancamiento de TEER entre el día 7 y el día 28 de ALI (Figura 1D). Además, se utilizó FITC-dextrano de dos pesos moleculares (10 kD y 20 kD) para evaluar la permeabilidad paracelular durante la diferenciación de ALI y mostró una disminución gradual general de la fluorescencia a lo largo del tiempo (Figura 1E). Esto se correlaciona con la formación de una monocapa de células maduras durante la diferenciación de ALI con una disminución de la permeabilidad a los solutos. 

Durante el cultivo de ALI, las células basales se diferencian en linajes epiteliales maduros, que incluyen células ciliadas, células club no secretoras de moco y células caliciformes secretoras de moco39. El análisis de la expresión génica de los marcadores específicos de células epiteliales maduras en el día 0 de ALI mostró una expresión mínima o nula de la proteína J155 (FOXJ1, marcador de células ciliadas), la uteroglobina56 (SCGB1A1, marcador de células club) y la mucina-5AC57 (MUC5AC, marcador de células caliciformes; Figura 2A), con un aumento posterior (día 7 y 28 de ALI) que sugiere diferenciación en estos subtipos epiteliales de vías respiratorias maduras durante el cultivo de ALI. Además, realizamos una tinción inmunofluorescente en el día 28 de ALI utilizando marcadores específicos de células epiteliales maduras y una diferenciación epitelial cuantificada que consistió en células ciliadas positivas para tubulinaacetilada 58 (TUBA4A) (~22%), células de club SCGB1A1 positivas (~13%) y células caliciformes positivas para MUC5AC (~3%) y el resto fueron células basales positivas para KRT5 (~51%) y otros tipos de células raras (Figura 2B).

Se utilizaron inhibidores de Rho y Smad durante los primeros 7 días de cultivo de ALI (días 0 a 7 de ALI) y luego se retiraron de los medios de diferenciación durante el resto de la duración del cultivo de ALI (Figura 3A). La superficie apical de la monocapa celular durante el cultivo de ALI se expone al aire, lo que permite estudios de perturbaciones atmosféricas. La exposición a la hiperoxia de la monocapa celular se realizó con 60% deO2 de forma continua durante 7 días desde el día 7 hasta el día 14 de ALI utilizando la incubadora TriGas. El grupo de control se mantuvo en una incubadora separada con exposición al aire ambiente (21%O2). Dada la intención futura de estudiar las consecuencias duraderas (1-2 semanas después de completar la exposición alO2) de la exposición alO2 en el desarrollo y la regeneración epitelial de las vías respiratorias, era esencial que la exposición alO2 no provocara de forma aguda una citotoxicidad grave o daño en la membrana hasta el punto de alterar significativamente la monocapa de células ALI. Para evaluar el daño de la membrana celular, medimos la liberación de LDH en los medios basolaterales en el día 14 de ALI, que no mostró diferencias significativas entre la hiperoxia y los cultivos tratados con aire ambiente (Figura 3B). Para evaluar más a fondo si los efectos citotóxicos delO2 eran lo suficientemente significativos como para inducir la apoptosis en los nTAEC, realizamos inmunotransferencia para la caspasa-3 total y la caspasa-3 escindida59 en lisados celulares recolectados de grupos expuestos a la hiperoxia y al aire ambiente en el día 14 de ALI (Figura 3C). La expresión total de caspasa-3 fue comparable entre los dos grupos, y no se detectó la expresión de caspasa-3 escindida, lo que sugiere que 7 días de exposición al 60% deO2 no indujeron apoptosis en nTAEC en el día 14 de ALI. Además, se diseñó un control positivo con incubación nocturna de nTAEC en condiciones sumergidas con concentraciones crecientes de estaurosporina (0,5 μM, 1 μM y 2 μM), un agente citotóxico y un inductor de apoptosis. La inmunotransferencia para la expresión de caspasa-3 total y caspasa-3 escindida confirmó la inducción exitosa de la apoptosis. Para medir el estrés oxidativo inducido por la exposición al 60% deO2, se realizó un ensayo de estrés oxidativo celular con medición de intensidad fluorescente en las monocapas celulares de nTAEC en ALI 14 (Figura 3D). La exposición a la hiperoxia causó un aumento significativo en la intensidad fluorescente (calculada por fluorescencia celular total corregida o CTCF) en comparación con las células expuestas al aire ambiente, lo que sugiere un aumento del estrés oxidativo celular. El análisis de la expresión génica de los genes antioxidantes mostró que el 60% deO2 causó una regulación positiva de estos genes antioxidantes en el día 14 de ALI, con catalasa, SOD1, SOD2 y GPX3 significativamente reguladas al alza (Figura 3E).

figure-results-1
Figura 1: Las células epiteliales de las vías respiratorias traqueales neonatales (nTAEC) se aíslan con éxito de los aspirados traqueales neonatales y se cultivan en la interfaz aire-líquido (ALI). (A) Las nTAEC aisladas mediante aspiración traqueal de neonatos intubados se dejaron pasar en estado sumergido con el cultivo posterior de ALI. (B) Las células se recolectaron en el día 0 de ALI para la tinción inmunofluorescente con marcadores de células basales de las vías respiratorias: KRT5 (rojo) y TP63 (rojo). Los núcleos se tiñen de azul con DAPI. Barra de escala = 50 μm. (C) Medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) en insertos de cultivo celular utilizando un voltímetro epitelial / ohmio (EVOM). (D) El TEER se midió durante la diferenciación del ALI. Los datos se presentaron como media (n=2 donantes, 5-10 pocillos por donante por punto de tiempo). (E) El ensayo de permeabilidad transepitelial de isotiocianato-dextrano de fluoresceína (FITC-dextrano) se realizó durante la diferenciación de ALI utilizando dos pesos moleculares diferentes de FITC-dextrano (10 kD y 20 kD). Se añadió solución de FITC-dextrano (10 kD o 20 kD) a la cámara apical, y los insertos de cultivo celular se incubaron a temperatura ambiente durante 60 min. La fluorescencia en el medio de la cámara basolateral se midió espectrofotométricamente en placas de 96 pocillos. La fluorescencia de fondo (medios HBTEC) se restó de las mediciones de prueba para obtener un valor de fluorescencia corregido (expresado como porcentaje en comparación con los valores del día 0). Los datos se presentan como media (n=2 donantes, tres pocillos por donante por punto de tiempo para cada peso molecular de FITC-dextrano). Las barras de error indican SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Las células epiteliales de las vías respiratorias traqueales neonatales (nTAEC) experimentan diferenciación mucociliar durante el cultivo de la interfaz aire-líquido (ALI). (A) Las células se recolectaron en los días 0, 7 y 28 de ALI para el análisis de qPCR de marcadores específicos de células epiteliales: citoqueratina-5 (KRT5) para células basales, proteína J1 de caja de horquilla (FOXJ1) para células ciliadas, uteroglobina (SCGB1A1) para células club y mucina-5AC (MUC5AC) para células caliciformes. La expresión relativa de cada gen se determinó mediante el método δCt con GAPDH como control endógeno. Los datos se presentan como media (de n = 3 donantes, tres pocillos por donante por punto de tiempo). El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA de dos vías con análisis post-hoc de Tukey, *p=0.0114, ***p=0.0005, ***p<0.0001. (B) Se realizó una tinción inmunofluorescente de células basales (KRT5, rojo), ciliadas (tubulina acetilada o TUBA4A, verde), club (SCGB1A1, rojo) y caliciforme (MUC5AC, verde) en el día 28 de ALI para cuantificar la diferenciación epitelial. Los núcleos se tiñen de azul con DAPI. Datos de porcentaje (%) de células positivas presentadas como media (n=2 donantes, dos insertos de cultivo celular por donante, 6-8 imágenes no superpuestas por portaobjetos, mínimo de 3000 células contadas por portaobjetos). Las barras de error indican SEM. Barra de escala = 50 μm.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: La hiperoxia induce estrés oxidativo celular en las células epiteliales de las vías respiratorias traqueales neonatales (nTAEC), pero no causa daño significativo en la membrana celular ni apoptosis. (A) Cronología experimental para la exposición a la hiperoxia de nTAEC utilizando la incubadora Trigas. La exposición al oxígeno se inició después de que los inhibidores se retiraron de los medios de diferenciación en el día 7 de ALI y se continuó durante 7 días (día 7 a 14 de ALI). (B) Se recolectaron medios basolaterales para el ensayo de liberación de LDH para evaluar el daño de la membrana celular entre el aire ambiente (control) y el grupo expuesto al 60% deO2 (hiperoxia) en el día 14 de ALI. Los datos se presentan como puntos de datos individuales (absorbancia corregida) con líneas que denotan la media general para cada grupo, n = 3 donantes denotados por círculos negros, cuadrados y triángulos con cuatro pocillos por donante, respectivamente. El análisis estadístico se realizó utilizando una prueba t no apareada, p=0,6184. (C) Las células se recolectaron en el día 14 de ALI y se realizó inmunotransferencia para marcadores de apoptosis (caspasa-3 y caspasa-3 escindida) para comparar las respuestas entre el aire ambiente y los nTAEC expuestos aO2. El control positivo para el ensayo se diseñó incubando nTAEC durante la noche con estaurosporina (Stau 0,5 μM, 1 μM y 2 μM) o control de vehículo (Veh Ctrl) en una condición de cultivo sumergido. Las células se recolectaron para inmunoblot con caspasa-3 total y anticuerpo caspasa-3 escindido. La densitometría se realizó con α-tubulina como gen de limpieza. Los datos se presentaron como media (de n=2-3 donantes, de uno a dos pocillos por donante). Las barras de error indican SEM. Se utilizó una prueba t no apareada para comparar la expresión total de caspasa-3 entre el aire ambiente y el grupo de 60% deO2 , p = 0,4. Se utilizó ANOVA de un factor para comparar la expresión de caspasa-3 total y caspasa-3 escindida entre los grupos expuestos a Veh Ctrl y Stau, *p<0.05, ***p<0.0005. (D) El ensayo CM-H2DCFDA para el estrés oxidativo celular se realizó en el día 14 de ALI con insertos de cultivo celular recolectados del aire ambiente y nTAEC expuestos aO2. Se muestran imágenes representativas de microscopía fluorescente del aire ambiente (control) y de insertos de cultivo celular expuestos al 60% deO2 (hiperoxia). Se calculó la fluorescencia celular total corregida (CTCF) para comparar el estrés oxidativo celular entre el aire ambiente y los nTAEC expuestos al 60% deO2. Los datos de CTCF se presentan como puntos de datos individuales con una línea que denota la media general para cada grupo, 6-7 imágenes/grupo de 2 donantes individuales (círculos negros y cuadrados) con dos pocillos por donante. El análisis estadístico se realizó utilizando una prueba t no pareada, *p<0.05. Barra de escala = 50 μm. (E) Las células se recolectaron en el día 14 de ALI del aire ambiente y se realizaron pocillos expuestos a hiperoxia para el análisis de qPCR de genes de estrés oxidativo, incluida la catalasa, la superóxido dismutasa 1 y 2 (SOD1 y SOD2), la glutatión peroxidasa 1, 2 y 3 (GPX1, GPX2 y GPX3). Los datos de cambio de pliegue de cada gen se determinaron utilizando el método δCt con ARNr 18s como control endógeno. Los datos se presentaron como media (de n=3 donantes, dos pocillos por donante). Las barras de error indican SEM. El análisis estadístico se realizó utilizando una prueba t no apareada, *p<0.05, **p=0.006.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Componente multimediaImporteConcentración final
BLEAM-I
Medios BLEAM500 mL
Suplemento HLL1.25 mL500 μg/mL de albúmina sérica humana
0,6 μM de ácido linoleico; 0,6 μg/mL de lecitina
L-Glutamina15 mL6 mM
Extracto P2 mL0,4% de extracto de hipófisis bovina
TM15 mL1 μM de epinefrina; 5 μg/mL de transferrina
10 nM de triyodotironina; 0,1 μg/mL de hidrocortisona
5ng/mL Factor de crecimiento epidérmico (EGF)
5 ng/mL de insulina
Normocina1 mL0,1 mg/mL
Y-27632Puede variar según el número de lote5 μM
A83-01Puede variar según el número de lote1 μM
CHIR 99021Puede variar según el número de lote0,4 μM
RapamicinaPuede variar según el número de lote5 nM
HBTEC
Medios de comunicación HBTEC500 mL
Normocina1 mL0,1 mg/mL
HBTEC-I
Medios de comunicación HBTEC500 mL
Normocina1 mL0,1 mg/mL
Y-27632Puede variar según el número de lote5 μM
A83-01Puede variar según el número de lote0,5 μM

Tabla 1: Componentes de los medios para el medio de la vía aérea del epitelio bronquial con inhibidores (BLEAM-I), el medio ALI de células epiteliales bronquiales/traqueales humanas con inhibidores (HBTEC-I) y HBTEC.

Matraz para cultivo celular/Insertos para cultivo celularMedios acondicionados para celdas 804G (mL)
Matraz T253 mL
Matraz T755 mL
Inserto de cultivo celular de 24 pocillos (tamaño de poro de 0,4 μm, área de superficie de 0,33cm2 )400 μL

Tabla 2: Volúmenes de medios acondicionados de matriz derivados de células 804G necesarios para matraces de cultivo e insertos de cultivo celular.

Discusión

El protocolo aquí descrito detalla un método para la recolección y procesamiento de muestras de aspirado traqueal neonatal de neonatos intubados en la UCIN, con el posterior aislamiento y expansión de nTAEC vivos a partir de estas muestras utilizando métodos previamente establecidos39. Además, hemos descrito un método para cultivar nTAECs en ALI y caracterizar su diferenciación en un epitelio de la vía aérea mucociliar polarizado en función del tiempo mediante la medición de TEER, ensayo FITC-dextrano, tinción inmunofluorescente y análisis de qPCR de marcadores específicos de tipo celular (es decir, basales, ciliados, maza y cáliz). El aspecto novedoso de este protocolo es la perturbación redox atmosférica realizada a través de una exposición moderada a hiperoxia (60%O2) en monocapas de nTAEC en desarrollo. Hemos demostrado que la exposición al 60% deO2 durante 7 días induce estrés oxidativo celular en los nTAECs. Además, demostramos que la estrategia de exposición alO2 no induce de forma aguda una apoptosis celular significativa ni daños en la membrana celular, lo que permite el mantenimiento de estos nTAECs en el cultivo de ALI más allá del momento de finalización de la exposición alO2 . Por lo tanto, el modelo puede utilizarse potencialmente para estudiar los efectos a corto y largo plazo de la exposición alO2 en la programación epitelial de las vías respiratorias neonatales.

El cultivo de nTAECs en ALI confiere ciertas ventajas sobre el cultivo sumergido convencional, ya que promueve la formación de una monocapa epitelial polarizada en la vía aérea con formación de uniones estrechas y diferenciación mucociliar60,61. Estudios previos con nTAECs han demostrado que en la fase temprana del cultivo de ALI (día 0 a 7 de ALI), las células experimentan una pseudoestratificación (que aparece como una capa multicapa en lugar de una sola célula) y finalmente forman un epitelio pseudoestratificado maduro al final de la segunda semana42,62. La formación de uniones estrechas sigue una trayectoria similar en la fase temprana del cultivo de ALI, acompañada de un rápido aumento de TEER con una meseta posterior de63, lo que se demuestra en el modelo con nTAEC. Además, las células epiteliales de las vías respiratorias cultivadas en ALI mejoran la expresión y la localización apico-lateral de claudina-1 (un componente del complejo de unión estrecha), lo que aumenta las propiedades de sellado de las uniones estrechas durante el cultivo de ALI, promoviendo la formación de una monocapa celular madura63. Esto se correlaciona con una disminución de la permeabilidad paracelular, que se probó en el modelo con el ensayo FITC-dextrano y demostró una tendencia generalmente decreciente en la permeabilidad monocapa. Hemos delineado el patrón de diferenciación mucociliar en nTAECs con inmunotinción para marcadores específicos de células ciliadas (TUBA4A), club (SCGB1A1) y caliciformes (MUC5AC) en el día 28 de ALI. Además, realizamos la expresión génica de marcadores específicos de células ciliadas (FOXJ1), club (SCGB1A1) y caliciformes (MUC5AC) durante el curso de tiempo de ALI. Otros grupos han demostrado que el factor de transcripción FOXJ1 es esencial para la ciliogénesis móvil, mientras que TUBA4A está presente tanto en los cilios primarios como en los móviles64,65. En este modelo, el patrón de expresión génica de FOXJ1 durante la diferenciación de ALI de nTAECs se correlaciona aproximadamente con el tiempo de aparición de cilios móviles en el cultivo epitelial de la vía aérea de estudios previos64,66.

Un estudio reciente de Teape et al. evaluó los efectos proteómicos y metabolómicos de la exposición a la hiperoxia en el cultivo de ALI67. Sin embargo, las células se derivaron de donantes adultos. Estudios previos sobre el virus respiratorio sincitial (VRS)62,68,69,70 y la reciente pandemia de COVID-1971 han puesto de manifiesto la importancia de las diferencias relacionadas con la edad en la respuesta y función epitelial de las vías respiratorias. Zhao et al. utilizaron flujos de trabajo similares para aislar las células epiteliales de las vías respiratorias neonatales y adultas y demostraron que después de 21 días de diferenciación de ALI, no había diferencias significativas en la composición celular entre las células epiteliales de las vías respiratorias neonatales y adultas62. Sin embargo, hubo claras diferencias en su respuesta a la infección por VRS, ya que las células neonatales mostraron más células infectadas por VRS y daño epitelial en comparación con los adultos. En general, las condiciones de cultivo utilizadas por Zhao et al. produjeron una diferenciación más robusta en las nTAECs en comparación con las nuestras, con un mayor número de células ciliadas (41% vs 22%) y caliciformes (10% vs 3%). Estas diferencias podrían atribuirse al uso de diferentes medios de crecimiento. Se ha demostrado que el medio PneumaCult-ALI utilizado por su grupo (a diferencia del medio HBTEC-ALI) induce una diferenciación más robusta con un mayor número de células ciliadas y caliciformes72. En este modelo, la expresión génica de los marcadores específicos del tipo de célula para las células ciliadas, de club y caliciformes mostró un rápido aumento inicial (día 0 a 7 de ALI) con una disminución posterior alrededor del día 28 de ALI. Una posible razón podría ser el estancamiento de la diferenciación después del día 14 de ALI, que se ha demostrado en estudios previos con nTAECs42.

Hemos descrito el uso de una exposición moderada a hiperoxia (60%O2) durante 7 días, que creemos que simula más de cerca las experiencias de la vida real de los recién nacidos prematuros en la UCIN en comparación con el uso de niveles muy altos deO2 (> 80%O2)67 donde el riesgo de toxicidad aguda porO2 aumenta1, 5. De hecho, se demostró que la exposición al 95% deO2 del tejido pulmonar del recién nacido induce la apoptosis celular a través de la activación decaspasas 73. Sin embargo, esta estrategia de exposición es relevante solo en un pequeño porcentaje de recién nacidos en la UCIN que, como consecuencia de la lesión pulmonar aguda inducida porO2, desarrollan DBP grave con patologías bronquiales crónicas (modelo de lesión pulmonar aguda)37. En la era moderna del uso juicioso de la terapia conO2 , la mayoría de los bebés prematuros no se exponen a un nivel tan alto deO2; Sin embargo, todavía corren el riesgo de desarrollar una futura enfermedad de las vías respiratorias (modelo de perturbación del desarrollo). En este último grupo, la lesión de la perturbación redox en los primeros años de vida puede ser silenciosa al principio, pero manifestarse más tarde durante la edad infantil o más allá en forma de enfermedad crónica de las vías respiratorias37. Nuestros datos, utilizando el ensayo de estrés oxidativo celular, mostraron que la exposición moderada a la hiperoxia (60% deO2) aumentó significativamente el estrés oxidativo dentro de la monocapa celular nTAEC. El análisis de la liberación de LDH y la activación celular de la caspasa-3 sugirió que nuestra estrategia de exposición a la hiperoxia no causó una muerte celular significativa. Los métodos y el sistema modelo que describimos pueden utilizarse potencialmente para descubrir mecanismos moleculares sensibles al O2 en las primeras etapas de la vida como un vínculo con el desarrollo posterior de enfermedad pulmonar en recién nacidos prematuros.

Durante la vida fetal, las células epiteliales de las vías respiratorias están sumergidas en el líquido pulmonar y existen en el ambiente intrauterino relativamente hipóxico26. Las células epiteliales de las vías respiratorias neonatales experimentan una rápida renovación y diferenciación y forman una barrera crítica entre el pulmón y el mundo exterior. A medida que los recién nacidos hacen la transición a la vida posnatal, las células epiteliales de las vías respiratorias se exponen a un entorno postnatal relativamente hiperóxico. Esta transición se hace más brusca en los recién nacidos prematuros y clínicamente enfermos, ya que también requieren rutinariamente O2 terapéutico como parte de su cuidado40,74, lo que los coloca en alto riesgo de lesión oxidativa después del nacimiento1. Si bien los efectos de la hiperoxia en la alveolarización pulmonar postnatal se han caracterizado bien utilizando modelos animales75, los efectos de la exposición a la hiperoxia en las células epiteliales de las vías respiratorias en desarrollo están relativamente poco estudiados38. El uso de células epiteliales de las vías respiratorias derivadas de neonatos humanos con exposición a hiperoxia fisiológicamente relevante durante la ALI añade relevancia traslacional a nuestro modelo. Además, el uso de la exposición a la hiperoxia durante la fase temprana-media de la diferenciación activa y la formación de monocapas celulares en lugar del epitelio maduro de la vía aérea completamente diferenciado67 simula potencialmente el escenario clínico en recién nacidos extremadamente prematuros (< 28 semanas de gestación) que nacen durante las etapas más tempranas (canalicular a sacular) del desarrollo pulmonar en lugar de la etapa alveolar7.

Nuestro modelo tiene limitaciones que deben ser consideradas a la hora de aplicarlo al desarrollo humano y a la enfermedad. Hemos utilizado la reprogramación condicional de células epiteliales primarias de la vía aérea neonatal previamente publicada en un modelo ALI de nTAECs39. El uso de inhibidores del factor de crecimiento (Rho/Smad/GSK3/mTOR) permite un paso más rápido y tardío de estas células. Hemos intentado cultivar nTAECs tanto en condiciones sumergidas como en ALI sin inhibidores en el medio de crecimiento; sin embargo, la expansión y el paso de estas células fueron significativamente más lentos, y la monocapa celular en ALI se volvió permeable al final de la segunda semana (datos no mostrados). Otro grupo que utilizó los mismos inhibidores para cultivar células epiteliales primarias de las vías respiratorias neonatales42 realizó la secuenciación de ARN de una sola célula para demostrar que la presencia de estos inhibidores no causaba una expresión diferencial significativa de los genes implicados en el estrés oxidativo, la transición epitelio-mesenquimal o la senescencia celular. No obstante, consideramos esta limitación en nuestro modelo y decidimos realizar la exposición a la hiperoxia después de que los inhibidores de Rho y Smad se eliminaron de los medios de diferenciación. Para este estudio, solo hemos probado los efectos moderados de la hiperoxia (60%O2) sobre los nTAECs. Sin embargo, los estudios futuros tienen la intención de utilizar la exposición graduada a la hiperoxia (40%, 60% y 95% deO2) y comparar las respuestas en los nTAEC. Si bien el modelo descrito aquí tiene un atractivo traslacional dado el uso de células de neonatos humanos ingresados en la UCIN, este es un modelo de cultivo celular in vitro y, por lo tanto, los hallazgos significativos que utilizan este modelo justificarían la confirmación con un modelo animal in vivo complementario.

En conclusión, hemos descrito el método paso a paso para establecer un modelo de cultivo de ALI en 3D in vitro utilizando células epiteliales de la vía aérea neonatal aisladas de aspirados traqueales de neonatos intubados en la UCIN. Hemos utilizado este modelo para examinar los efectos de la exposición moderada a la hiperoxia, un daño ambiental común en los neonatos prematuros en la UCIN. La exposición a la hiperoxia indujo estrés oxidativo celular en la monocapa celular sin causar daño significativo en la membrana celular o muerte celular, lo que permitió la continuación del cultivo de ALI para estudiar los efectos duraderos de la exposición alO2 en el desarrollo y la función epitelial de las vías respiratorias neonatales. Las aplicaciones futuras que utilicen estos métodos podrían descubrir los mecanismos tempranos de la enfermedad involucrados en el desarrollo a largo plazo de enfermedades pulmonares inducidas por la hiperoxia que se observan con frecuencia en recién nacidos prematuros.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar ni conflictos de intereses que informar.

Agradecimientos

Este trabajo cuenta con el apoyo financiero de la Fundación Presbiteriana de Salud (PHF) y Oklahoma Shared Clinical and Translational Resources (U54GM104938 con un Premio de Desarrollo Institucional (IDeA) de NIGMS) a AG. Nos gustaría agradecer al Dr. Paul LeRou y al Dr. Xingbin Ai del Hospital General de Massachusetts, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, Massachusetts, por proporcionar células de donantes neonatales utilizadas en algunos de los experimentos. Las figuras fueron creadas con Biorender. El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Formalina tamponada al 10%Fisher Scientific23-426796
1X PBS (solución salina tamponada con fosfato), pH 7.4Gibco10010049
A 83-01Tocris29-391-0
ALI Insertos Transwell, 6.5mmCorning3470
monoclonal de ratónSigmaT7451
Anticuerpo anti-alfa tubulinaAbcamab7291
Anticuerpo anti-citoqueratina 5Abcamab53121
BronchiaLife Medio de la vía aérea epitelial (BLEAM)LifeLine Cell TechnologyLL-0023
CHIR 99021Tocris44-231-0
Anticuerpo caspasa-3 escindidoSeñalización celular9664T
SCGB1A1 o Club Cell Protein (CC16) Humano, Anticuerpo policlonal de conejoBioVendor R& DRD181022220-01
CM-H2DCFDA (Indicador general de estrés oxidativo)Thermo ScientificC6827
Matraces T25Corning430639
Corning Cultivo celular en forma de U T75 Matraces Corning430641U
CyQUANT LDH Ensayo de citotoxicidadThermo ScientificC20300
DAPI Solución (1 mg/mL)Fisher ScientificEN62248
Dimetilsulfóxido [DMSO] Hybri-MaxSigmaD2650
Agua destiladaGibco15230162
EVOM Manual para la medición de TEERInstrumento de precisión mundialEVM-MT-03-01
FBS (Suero fetal bovino)Gibco10082147
Isotiocianato de fluoresceína Dextrano (promedio mol wt 10,000)Fisher ScientificF0918100MG
Isotiocianato de fluoresceína– dextrano (peso medio mol 20,00)SigmaFD20-100MG
Cabra Anti-Ratón IgG (H + L), Humano ads-HRPSouthern Biotech1031-05
Cabra anti-Ratón IgG2b Anticuerpo secundario de adsorción cruzada, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21141
Cabra anti-Conejo IgG (H + L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 546InvitrogenA-11035
Cabra Anti-Conejo IgG (H + L), ratón / humano ADS-HRPSouthern Biotech4050-05
HBTEC Interfaz aire-líquido (ALI) Medio de diferenciaciónLifeLine Tecnología celularLM-0050
HEPESLonzaCC-5024
Heracell VIOS 160i Incubadora de CO2 trigás, 165 LThermo Scientific51030411
Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidadThermo Scientific4368814
Suplemento HLLLifeLine Cell TechnologyLS-1001
ImageJNIHN/A
Invivogen Normocin - Reactivo antimicrobianoFisher Scientific
L-GlutaminaLifeLine Cell TechnologyLS-1013
Suero de cabra normalGibco
NormocinInvivogenanticuerpo ant-nr-05
p63Santa Cruz Biotechnologysc-25268
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36930
PureLink RNA Mini KitThermo Scientific12183025
RAPAMICINAThermo ScientificAAJ62473MC
Mezcla maestra avanzada rápida de TaqmanThermo Scientific 4444964
Ensayos de exressión génica de Taqman: ARNr 18SThermo Scientific
Taqman: CATThermo ScientificHs00156308_m1
Ensayos de exressión génica de Taqman: FOXJ1Thermo Scientific
Taqman: GAPDHEnsayos
Taqman de Thermo Scientific: Ensayos de exressiónHs00829989_gH
de genes de Taqman GPX1 Thermo Scientific: EnsayosThermo ScientificHs01591589_m1
Taqman: Ensayos de exressión de genes GPX3Thermo ScientificHs01078668_m1
Taqman: KRT5Thermo Scientific
Ensayos de exressión génica de Taqman: MUC5ACThermo ScientificHs01365616_m1
Ensayos de exressión génica de Taqman: SCGB1A1Ensayosde Hs00171092_m1
Taqman Thermo Scientific: Ensayos de exressión de genes SOD1Thermo ScientificHs00533490_m1
Taqman: SOD2Thermo ScientificHs00167309_m1
Unidades de filtro desechables estériles de flujo rápido Thermo Scientific Nalgene con membrana PES (0,22 μ m poros, 500 ml)Thermo Scientific5660020
TM-1 Suplemento combinadoLifeLine Cell TechnologyLS-1055
Anticuerpo total caspasa-3Señalización celular14220S
Triton X-100Sigma9036-19-5
Tripsina-EDTA (0,05%), Rojo fenolGibco25300062
Y-27632 2 HClTocris12-541-0
Anticuerpo de tubulina antiacetilada 3470, tratados con cultivo celular de imagej.nih.gov/ij/ NC9273499 PCN5000 Ensayos de exressión del gen Hs99999901_s1 Ensayos de exressión del gen Hs00230964_m1 de exressión génica Hs02786624_g1 de de exressión de genes GPX2 Hs00361185_m1 de exressión génica

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